C 형 간염 바이러스에 대한 인간 락토페린의 세포 흡수 및 관련 바이러스 활동을 모니터링하는 면역 형광

요약

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

초록

흔히 면역 생물학의 여러 측면을 연구하는 데 실험 기술이다. 이것은 전형적으로 세포 및 조직에서 표적 분자의 분포 및 / 또는 위치 파악을 시각화하기 위해 사용된다. 면역은 세포 내에서 해당 항원에 대한 형광 표지 항체의 특이성에 의존한다. 모두 직접 및 간접 면역 형광 방법은 형광 색소와 링크 된 항체의 사용에 의존 할 수있다. 그것은, 낮은 신호를 제공 높은 비용과 적은 유연성을 포함하기 때문에 직접 면역 형광이 자주 사용된다. 대조적으로, 간접 면역 형광은 더 일반적 때문에 고감도의 사용과 둘 이상의 이차 항체 각 차 항체에 부착 할 수 있기 때문에 증폭 된 신호를 제공한다. 이 논문에서는, 표면 형광 현미경 및 공 초점 현미경 모두 인간 락토페린의 내재화, 면역의 중요한 구성 요소를 모니터링하는 데 사용 된간 세포로 시스템. 또한, 우리는 면역 형광을 사용하여 C 형 간염 바이러스의 복제를 HLF 세포의 억제 가능성을 모니터. 이 두 가지 접근 방식과 관련된 장점과 단점이 논의된다.

서문

Immunofluorescence is a technique that uses a fluorescence microscope to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in a biological sample. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell¹. It is typically used on tissue sections and cultured cell lines in order to analyze the distribution/localization of various biological molecules such as proteins, nucleic acids and glycans. It should be noted that immunofluorescence is often used in combination with other non-antibody methods of fluorescent staining such as the 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stains which are typically used to label DNA². Moreover, this technique involves fixation of the cells which allows the analysis of cells at a specific time.

Different types of microscopes can be used to analyze immunofluorescence samples. The simplest is the epifluorescence microscope (Figure 1) for which excitation of the fluorochrome and detection of the fluorescence are done through the same light path³. Because most of the excitation light is transmitted through the sample, only reflected excitatory light can reach the objective together with the emitted light. This approach unfortunately leadsto a frequent high signal to noise ratio.In contrast, confocal microscopy (Figure 2) offers a distinct advantage for increasing optical resolution and contrast by means of adding a spatial pinhole placed at the confocal plane of the lens to eliminate out-of-focus light⁴. This approach allows the reconstruction of three-dimensional structures from the obtained images. However, since an important fraction of the light from the sample is blocked at the pinhole, long exposures are often required.

There are two classes of immunofluorescence techniques, primary (or direct) and secondary (or indirect). Direct immunofluorescence involves a primary antibody linked with a fluorochrome (Figure 3). This method is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility¹. Moreover, such antibodies are generally harder to find commercially. On the other hand, the direct attachment of the fluorochrome to the antibody significantly reduces the number of steps in the procedure, saving time and frequently reducing non-specific background signal. This also limits the possibility of antibody cross-reactivty.

Indirect immunofluorescence involves a primary unlabelled antibody which is specific for the epitope of interest¹. A secondary antibody which carries the fluorochrome then recognizes the primary antibody and binds to it (Figure 3). Although indirect immunofluorescence is more complex and time consuming than direct immunofluorescence, it is frequently used because of its high sensitivity and it also provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In addition, a vast array of commercial secondary antibodies is available at affordable prices.

Hepatitis C virus (HCV) is a major public-health problem with 130-170 million individuals chronically infected worldwide. In order to halt the epidemic, therapy against HCV will need to be both effective and widely available. Studies focusing on safe and affordable natural product active against HCV have revealed the antiviral activity of the human Lactoferrin (hLF) protein which binds and neutralizes the circulating virion⁵. In the current study, investigation of hLF activity on the HCV subgenomic replicon system, which is independent from viral entry and shedding, revealed a distinct antireplicative activity of hLF against HCV. This manuscript presents a study in which immunofluorescence assays were performed to monitor the internalization of hLF, an important component of the immune system⁶, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus (HCV).

프로토콜

1. 세포 준비 및 치료

1. 24 웰 플레이트에서 웰의 바닥에 유리 덮개를 넣고. 인산염 완충 식염수 (PBS)를 각 웰을 세척 할 것.
2. / 웰의 5 × ¹⁰⁴ 세포의 농도로 각 웰에 subgenomic HCV 레 플리 콘을지지 시드 응-7 세포. 그럴 치료가 없으면 세포는 고밀도로 접종 될 수있다. 배양 배지는 둘 베코 변형 이글 중간 10 % 우태 혈청 (FBS)를 2mM L- 글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨 및 250 ㎎ / ㎖ G-418 (레 플리 콘을 유지하기 위해)와 보충 (DMEM)이다.
3. 37 ° C에서 품어 5 % CO _2. 다음날, 인간의 우유에서 정제 HLF의 3 μm의와 세포를 치료.

2. 파라 포름 알데히드 / 자당 준비 (12 % PAF 12 % 자당)

1. 20 ° C와 30 ° C 사이를 비커에 PBS 500 ㎖에 넣고 가열한다. PBS에서 자당의 60g을 녹인다. paraformal의 60g을 녹여PBS / 자당 용액에 알데히드 (PAF). 서서히 투명 용액이 얻어 질 때까지 2 N NaOH로 (3 내지 7 ml)에 추가한다.
2. HCl을 7.4으로 산도를 조정합니다. PBS로 500 ml의 완전한 볼륨. 워트 먼지 필터에 중력에 의해 필터링합니다. 사용 전에, PAF 4 % 4 % 자당 (스토리지 일주 최대 4 ℃)의 최종 농도로 PBS 용액으로 희석.

3. 면역 형광

1. 원하는 시간에 (0 시간은 2 시간 24 처리의 시간), PBS로 (1 분) 두 번 세포를 씻어 실온에서 20 분 동안 PBS / 4 % PAF / 4 % 자당에 고정합니다. 세포는 30 % ~ 40 % 합류에 통상적이며 1.5 × ^{105 세포가} 사용된다.
2. 20 분 동안 PBS 중 10 % 정상 염소 혈청 (NGS)에서 RT에서 5 분 동안 PBS에 0.​​15 %의 트리톤 X-100 세포 및 블록 Permeabilize 하시려면.
3. 10 % NGS의 관심 단백질의 일차 항체를 희석 (예 : 1000 : 일차 마우스 항 HLF 항체 희석은 1). 세포에 차 항체를 적용합니다.
4. RT 또는 O에서 4 시간 후 /4 ° C에서 N은 10 % NGS 5 분 동안 세포를 세 번 씻는다. 10 % NGS 희석 형광 색소로 표지 된 이차 항체와 세포 얼룩 (예 : 형광 색소를 항 - 마우스 항체 (1)에 연결된 488 nm 인 여기 파장 : 1,000) 어두운 RT에서 1 시간 동안.
5. PBS로 5 분 동안 한 번 세포를 씻으과 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 4 ', 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) (1 μg의 / ml)로 세포를 얼룩.
6. PBS로 5 분 동안 두 번 세포를 씻으십시오. 마운트 현미경을 통해 시각화하기 전에 SlowFade 설치 매체에 안경을 커버합니다. 셀은 표면 형광 또는 공 초점 현미경에 의한 분석을위한 준비가되어 있습니다.
7. 검출의 특이성을 보장하기 위해 다른 컨트롤을 사용합니다. 예를 들어, 모든 항체는자가 형광을 검출하기 위해 생략 될 수있다. 일차 항체는 이차 항체에 의한 비특이적 염색을 결정을 생략 할 수있다. 가능하면 마지막으로, 그렇지 않은 세포 또는 조직을 제어대상 분자가 또한 사용될 수 표현한다.
8. 사용되는 형광 표지에 적합한 적절한 형광 현미경 (또는 표면 형광 공 초점) 및 필터 세트를 이용하여 샘​​플을 시각화. 슬라이드는 또한 <-20 ° C에 대한 시험에서 나중에 슬라이드 박스에 저장 될 수있다.

4. 형광 현미경

1. 광표백을 방지하기 위해 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. 선택한 현미경 (표면 형광 또는 공 촛점)의 광원을 켭니다.
2. 현미경을 켭니다. 현미경 용 카메라를 켭니다. 시각화를위한 현미경의 슬라이드를 넣습니다. 대물 렌즈의 개구 수를 증가시키는 침지 슬라이드에 오일을 추가한다.
3. 적절한 필터를 선택합니다. 초점과 적절한 목표를 조정합니다. 적절한 형광 색소를 검출하지만 광표백을 방지하기 위해 셔터를 조정한다. 샘플을 볼 때 배경 조명을 최소화하기 위해 머리 위의 조명을 유지합니다.
4. 변경 일E 필터 (예 DAPI 및 488 nm 인 여기 파장 용)의 다양한 형광 색소를 시각화. 카메라로 사진을 촬영합니다.

결과

외생 투여 HLF 내부화 간 허-7 세포주의 능력에 촛점 miscroscope 면역 형광을 사용하여 모니터 하였다. HLF은 배양 배지에 첨가하고, 내재화 후, 세포 외 HLF는 PBS로 세척하고, 결합 된 잔여 HLF 막은 5 분간 트립신 처리 (1 ml)로 저하시키고, 24 시간 동안 두었다. 세포는 시드 및 면역 형광 염색하기 전에 18 시간 동안 다시 부착하는 것이 허용되었다. 세포질 한계를 개설하기 위하여, 세포 막은 488 nm의 복합?...

토론

HCV 전염병은 간경변, 간부전이나 간암의 위험에 그들을 가하고, 만성 감염을 개발 새로 감염된 환자의 80 %로, 글로벌 위협이 남아있다. 최근 두 NS3 N- 말단 단백질 분해 효소 억제제 (Boceprevir 및 Telaprevir)의 규제 당국의 승인에 의해 입증 된 바와 같이 - 직동 HCV 복제 및 성숙을 대상으로 항 바이러스제는 주요 항 HCV 에이전트를 나타냅니다. HLF 항 HCV 활성은 현재 비리 순환 그들의 타겟 간세포 내로 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000