Immunfluoreszenz, um die zelluläre Aufnahme von menschlichem Lactoferrin und die damit verbundenen antivirale Aktivität gegen das Hepatitis C Virus-Monitor

Zusammenfassung

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Zusammenfassung

Immunfluoreszenz ist eine Labortechnik häufig verwendet, um viele Aspekte der Biologie zu studieren. Er wird üblicherweise verwendet, um die Verteilung und / oder die Lokalisierung eines Zielmoleküls in Zellen und Gewebe zu visualisieren. Immunfluoreszenz beruht auf der Spezifität von Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen die entsprechenden Antigene in der Zelle. Direkte und indirekte Immunofluoreszenz Ansätze können verwendet werden, die auf der Verwendung von Antikörpern, die mit einem Fluorochrom gebunden verlassen. Direkte Immunfluoreszenz wird seltener verwendet, da sie geringere Signal, mit höheren Kosten und weniger Flexibilität. Im Gegensatz dazu ist die indirekte Immunfluoreszenz mehr allgemein wegen seiner hohen Empfindlichkeit verwendet und liefert ein verstärktes Signal seit mehr als einem sekundären Antikörper kann an jeden primären Antikörper zu befestigen. In diesem Manuskript wurden sowohl Epifluoreszenzmikroskopie und konfokale Mikroskopie verwendet, um die Internalisierung von menschlichem Lactoferrin, eine wichtige Komponente der Immun überwachenSystem, in Leberzellen. Außerdem überwacht wir die Hemmpotenzial hLF auf die intrazelluläre Replikation des Hepatitis C-Virus mittels Immunfluoreszenz. Sowohl die Vorteile und Nachteile, die mit diesen Ansätzen verbunden sind, diskutiert.

Einleitung

Immunofluorescence is a technique that uses a fluorescence microscope to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in a biological sample. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell¹. It is typically used on tissue sections and cultured cell lines in order to analyze the distribution/localization of various biological molecules such as proteins, nucleic acids and glycans. It should be noted that immunofluorescence is often used in combination with other non-antibody methods of fluorescent staining such as the 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stains which are typically used to label DNA². Moreover, this technique involves fixation of the cells which allows the analysis of cells at a specific time.

Different types of microscopes can be used to analyze immunofluorescence samples. The simplest is the epifluorescence microscope (Figure 1) for which excitation of the fluorochrome and detection of the fluorescence are done through the same light path³. Because most of the excitation light is transmitted through the sample, only reflected excitatory light can reach the objective together with the emitted light. This approach unfortunately leadsto a frequent high signal to noise ratio.In contrast, confocal microscopy (Figure 2) offers a distinct advantage for increasing optical resolution and contrast by means of adding a spatial pinhole placed at the confocal plane of the lens to eliminate out-of-focus light⁴. This approach allows the reconstruction of three-dimensional structures from the obtained images. However, since an important fraction of the light from the sample is blocked at the pinhole, long exposures are often required.

There are two classes of immunofluorescence techniques, primary (or direct) and secondary (or indirect). Direct immunofluorescence involves a primary antibody linked with a fluorochrome (Figure 3). This method is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility¹. Moreover, such antibodies are generally harder to find commercially. On the other hand, the direct attachment of the fluorochrome to the antibody significantly reduces the number of steps in the procedure, saving time and frequently reducing non-specific background signal. This also limits the possibility of antibody cross-reactivty.

Indirect immunofluorescence involves a primary unlabelled antibody which is specific for the epitope of interest¹. A secondary antibody which carries the fluorochrome then recognizes the primary antibody and binds to it (Figure 3). Although indirect immunofluorescence is more complex and time consuming than direct immunofluorescence, it is frequently used because of its high sensitivity and it also provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In addition, a vast array of commercial secondary antibodies is available at affordable prices.

Hepatitis C virus (HCV) is a major public-health problem with 130-170 million individuals chronically infected worldwide. In order to halt the epidemic, therapy against HCV will need to be both effective and widely available. Studies focusing on safe and affordable natural product active against HCV have revealed the antiviral activity of the human Lactoferrin (hLF) protein which binds and neutralizes the circulating virion⁵. In the current study, investigation of hLF activity on the HCV subgenomic replicon system, which is independent from viral entry and shedding, revealed a distinct antireplicative activity of hLF against HCV. This manuscript presents a study in which immunofluorescence assays were performed to monitor the internalization of hLF, an important component of the immune system⁶, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus (HCV).

Protokoll

1. Zellen Vorbereitung und Behandlung

1. In einer 24-Well-Platte, legte ein Glasabdeckung am Boden der Wells. Mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Waschen Sie jede Vertiefung geben.
2. Samen Huh-7 Zellen Stütz HCV subgenomische Replikon in jeder Vertiefung bis zu einer Dichte von 5 × ¹⁰ 4 Zellen / Vertiefung. Wenn es keine Behandlung, um zu tun, können die Zellen in einer höheren Dichte ausgesät werden. Das Kulturmedium ist Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 250 mg / ml G-418 (um das Replikon zu erhalten) ergänzt.
3. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ am nächsten Tag zu behandeln, die Zellen mit 3 & mgr; M hLF aus menschlicher Milch gereinigt.

2. Paraformaldehyd / Saccharose-Herstellung (12% PAF und 12% Saccharose)

1. Setzen 500 ml PBS in einem Becherglas und Wärme zwischen 20 ° C und 30 ° C. 60 g Saccharose in PBS. 60 g des paraformaldehyd (PAF) in PBS / Saccharose-Lösung. Langsam NaOH 2N (3-7 ml), bis eine klare Lösung erhalten wird.
2. PH-Wert auf 7,4 mit HCl. Gesamte Volumen auf 500 ml mit PBS. Filter durch die Schwerkraft auf Whatman-Filter. Vor Gebrauch verdünnte die Lösung mit PBS auf eine Endkonzentration von 4% PAF und 4% Saccharose (Lagerung 4 ° C für 1 Woche Maximum).

3. Immunfluoreszenz

1. Zum gewünschten Zeitpunkt (0 h, 2 h oder 24 h der Behandlung), waschen Sie die Zellen zweimal (1 min) mit PBS und fixieren mit PBS / 4% PAF / 4% Saccharose für 20 min bei RT. Die Zellen werden typischerweise bei 30-40% Konfluenz und 1,5x10 ⁵ Zellen verwendet werden.
2. Permeabilisierung der Zellen mit 0,15% Triton X-100 in PBS für 5 min bei RT und Block in 10% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS für 20 min.
3. Verdünnen Sie die primären Antikörper des Proteins von Interesse in 10% NGS (Beispiel: primäre Maus-Anti-hLF Antikörper verdünnt 1: 1.000). Wenden Sie den primären Antikörper zu den Zellen.
4. Nach 4 h bei RT oder O /N bei 4 ° C, waschen Sie die Zellen dreimal 5 min mit 10% NGS. Färben die Zellen mit Sekundärantikörper mit Fluorochrom in 10% NGS verdünnt markierten (Beispiel: Fluorochrom mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm auf einen Antikörper, anti-Maus-1 verbunden: 1000) für 1 h bei RT im Dunkeln.
5. Die Zellen werden einmal für 5 Minuten mit PBS und färben die Zellen, die mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1 ug / ml) für 15 min bei RT im Dunkeln.
6. Für 5 Minuten mit PBS waschen Sie die Zellen zweimal. Berg decken Gläser auf Slowfade Eindeckmedium vor Visualisierung durch Mikroskopie. Die Zellen sind nun bereit für die Analyse durch Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie.
7. Verwenden Sie verschiedene Steuerelemente, um die Spezifität des Nachweises zu gewährleisten. Zum Beispiel können alle Antikörper, um die Autofluoreszenz zu detektieren weggelassen. Der primäre Antikörper weggelassen werden, um die nicht-spezifische Färbung mit dem sekundären Antikörper zu bestimmen. Schließlich, wenn möglich, zu steuern Zellen oder Gewebe, die nichtexprimieren das Molekül von Interesse kann auch verwendet werden.
8. Visualisieren Sie die Proben unter Verwendung von geeigneten Fluoreszenzmikroskop (Epifluoreszenz oder konfokalen) und Filtersätze für die Fluoreszenzmarkierung verwendet angemessen. Dias können auch in einer Diashow Fach an <-20 ° C für die spätere Prüfung abgelegt werden.

4. Fluoreszenzmikroskopie

1. Bewahren Sie die Proben in der Dunkelheit, um Photobleichung zu verhindern. Einschalten der Lichtquelle der ausgewählten Mikroskop (Epifluoreszenz oder konfokalen).
2. Schalten Sie das Mikroskop. Einschalten der Kamera für das Mikroskop. Legen Sie die Folie unter dem Mikroskop auf Visualisierung. In Immersionsöl auf der Folie, um die numerische Apertur der Objektivlinse zu erhöhen.
3. Wählen Sie die entsprechenden Filter. Stellen Sie den Fokus und entsprechende Ziel. Passen Sie die Fensterläden, um die entsprechenden Fluorochrom erkennen, sondern verhindern, Photobleichen. Halten Deckenbeleuchtung aus, um Hintergrundlicht zu minimieren, wenn man Probe.
4. Th ändernE-Filter, um verschiedene Fluorochrome (zB DAPI und für eine Anregungswellenlänge von 488 nm) zu visualisieren. Nehmen Sie Bilder mit der Kamera.

Ergebnisse

Die Fähigkeit der Leber Huh-7-Zelllinie exogen administrated hLF internalisiert wurde mittels Immunfluoreszenz auf einem konfokalen miscroscope überwacht. hLF wurde zu dem Kulturmedium zugegeben, und die Internalisierung wurde 24 h erlaubt, wonach wurde extrazelluläres hLF mit PBS gewaschen und restliche Membran gebunden hLF wurde mit einer 5 min Trypsinbehandlung (1 ml) abgebaut. Die Zellen wurden ausgesät und man ließ sie wieder halten 18 Stunden vor der Immunfluoreszenzfärbung. Um die cytoplasmatischen Grenzen ...

Diskussion

Die HCV-Epidemie bleibt eine globale Bedrohung, mit 80% der neu infizierten Patienten entwickeln eine chronische Infektion, indem sie mit einem Risiko für Leberzirrhose, Leberversagen oder Leberzellkarzinom. Direkt wirkende antivirale Mittel Targeting HCV-Replikation und Reifung stellen erstklassige Anti-HCV-Mittel, wie kürzlich von der behördlichen Genehmigung von zwei NS3 N-Terminus-Protease-Inhibitoren (Boceprevir und Telaprevir) demonstriert. HLF anti-HCV-Aktivität wird derzeit angenommen, dass als das Eindringe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000