טכניקת קיבוע אקריליק שרף דפוס מבוסס ראש במכרסמים

Summary

Traditional head fixation techniques have used metallic frames attached on the skull as an interface for head fixation apparatus. This protocol demonstrates a frameless, acrylic resin molding based head fixation technique for behavioral tasks in rodents.

Abstract

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires surgical attachment of metallic frames on the skull. The attached frames are then clamped to a stationary platform resulting in immobilization of the head. However, metallic frames for head fixation have been technically difficult to design and implement in general laboratory environment. In this study, we provide a novel head fixation method. Using a custom-made head fixation bar, head mounter is constructed during implantation surgery. After the application of acrylic resin for affixing implants such as electrodes and cannula on the skull, additional resins applied on top of that to build a mold matching to the port of the fixation bar. The molded head mounter serves as a guide rails, investigators conveniently fixate the animal’s head by inserting the head mounter into the port of the fixation bar. This method could be easily applicable if implantation surgery using dental acrylics is necessary and might be useful for laboratories that cannot easily fabricate CNC machined metal head-posts.

Introduction

הרחקה קיבעון או ראש בראש היא טכניקה של לשתק את ראשו של בעל החיים על ידי הצמדת מסגרת או צלחת על הגולגולת להידוק נוקשה. הטכניקה כבר אימצתי לגירוי חושי מדויק, חישת התנהגות עם או בלי הקלטה עצבית בבעלי חיים ער ^1-3 ותיוג juxtacellular במהלך מחזור ⁴ שינה ו. כמו כן הוא משמש לin vivo ההדמיה של מוח ^5,6. עכשיו טכניקת קיבוע הראש הוא כלי נפוץ במדעי מוח והתנהגות מחקר.

בעיקרון, קיבעון הראש מסורתי דורש קובץ מצורף כירורגית של ראש-הודעות מתכת על גבי ^6-8 הגולגולת. אז הקבצים המצורפים מהודקים לפלטפורמה נייחת, וכתוצאה מכך חוסר תנועה של הראש. מחקר בבעלי חיים neurophysiological ער כגון עצבי ו / או הקלטה אופטית, התערבות חשמלית במוח, הדמיה מוחית מלווה בניתוח השתלה באמצעות אקריליק שיניים. לכן,נראה משימה פשוטה ליישם את קיבעון הראש במעבדות אלה כאשר הוא בניסוי נחוץ. צריכים להיות מתוכננות המסגרות להיות קל משקל וקטן מספיק כדי לא להפריע התנהגות הטבעית של בעלי החיים בכלובים בביתם. הוא גם מספק קשיחות מכאנית כאשר הידק לפלטפורמה הנייחת. עוד יש לו התאמה ביולוגית בהתאם למטרות ניסויים. לכן, זה קשה מבחינה טכנית כדי לעצב ולייצר ראש-הודעות כאלו בציוד מעבדה כללי.

במחקר זה, שיטת קיבוע ראש רומן מתוארת, מתן קשיחות מכאנית באמצעות הידוק נוח מבלי להשתמש בראש-הודעות מתכת. על ידי שימוש בשיטה, קיבעון הראש יכול להיעשות בתנאי מעבדה כלליים, שבו ניתוח השתלה מבוצע בדרך כלל במכרסמים למחקר מוח. הראש-הודעות המתכת מוחלפות במלט שרף אקרילי היצוק באופן חלקי על ידי בר קיבעון ראש מחוייט ודפוס התהליך נעשה במהלך implanניתוח tation. בר הקיבעון מספק תאימות מרחבית גבוהה עם שתלים אחרים, כגון בדיקות הקלטה עצביות, אלקטרודות גירוי. כמו כן הוא מפשט את הפעולות של הידוק הראש של החיה על פלטפורמת הקיבעון על ידי הסרת בורג חיזוק. אנחנו השתמשנו בשיטה זו במחקר ההתנהגות הקודם והגעתי למסקנה שהשיטה זו היא קלה ליישום ונוח בניסויים מעשיים ^9.

Protocol

הצהרת אתיקה:
ניסוי זה אושר על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה הלאומית Kyungpook, ובוצע על פי מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (המכון הלאומי לבריאות, 1996). לאחר ניסוי, בעלי החיים הוקרבו תחת המתת חסד פחמן דו חמצני.

1. עיצוב של בר-ראש הקיבעון לחולדות

הערה: שלב זה הוא קו מנחה כללי לעיצוב בר קיבעון. כל שינוי על הממד והחומר אפשרי בהתאם לחיות או שתלים. עיצוב בר ראש-קיבעון באמצעות תוכנות CAD מומלצת אך לא הכרחי.

1. השתמש בתוכנת CAD לעצב בר קיבעון.
   1. עיצוב בר קיבעון של צורה מלבנית (123 מ"מ × 35 × 6) (איור 1 א). הפוך חריץ מלבני (16 × 20 מ"מ; נמל) באמצע הבר הקיבעון. להוסיף מדרונות או חריצים which לשמש כמעקה מדריך על הגבולות של הנמל (איור 1 א-, איור 1 -arrows).
      הערה: ודא שאזור הנמל מכסה את המלבן המשוער של הגולגולת של החולדה על המוח כדי לאפשר כניסות אנכיות באמצעות מניפולטור stereotaxic לרוב האזורים במוח באמצעות פתיחת גולגולת.
   2. צרף צלחות (50 × 20 × 6 מ"מ) עם שני חורי עיגון מוארכים משני צידי הבר הקיבעון. ודא שהחורים האלה עוברים ברגים בקוטר 6 מ"מ (1A-ד איור). לעשות חור בקוטר של 3 מ"מ בחלק קדמי של היציאה לוו נעילה (איור 1 א-ב).
   3. להפוך את תיבה שיש רצפה (135 × 305 מ"מ) וקירות צדדיים (305 × 76 מ"מ). לקדוח שני חורים בקוטר 6 מ"מ, כפי שמוצג באיור 1 א (הבלעה). להוסיף קירות תומכים בסרגל הקיבוע (איור 1 א-ה).
2. ייצור בר המעוצב ותיבה ולהרכיב כל אחד מהם באמצעות cyanoacrylate כשמוצג באיור 1 א (הבלעה). להרכיב את הבר בתיבה באמצעות ברגים בקוטר 6 מ"מ. החל מדרון על ידי התאמת עמדת הבורג על הבר לקיבעון ארגונומי ראש (1A-הבלעה איור).
   הערה: לעכברים, הממד של בר הקיבעון הוא 60 מ"מ × 20 × 4 (מורכב משתי שכבות של 2 מ"מ פנלי אקריליק סמיך). הנמל הוא ריבוע של 8 מ"מ רוחב (עליון) ו -9 x 10 מ"מ (נמוך) כפי שמוצג באיור 1 ג. צלחות עיגון הן באותו הגודל של חולדות. קירות צלחת התיבה וצד הם 100 מ"מ × 72 × 100 ושל 50 מ"מ, בהתאמה.

2. ראש Mounter בנייה במהלך ניתוח השתלה

זהירות: היה זהיר בעת התמודדות עם שרף אקרילי שיניים. הנוזל עלול לגרום לגירוי בעור. לשים על מסכה וללבוש כפפות. עובד באזור מאוורר היטב.

1. הכנה לפני הניתוח
   1. חוזקה לעטוף את הגבול של נמל AP באמצעות סרגל קיבעוןסרט araffin כדי למנוע הידבקות של שרף אקרילי פנה לבר (ראה איור 1 ואיור 2 א). מעיל הדייר של הנמל המכוסה על ידי סרט פרפין עם שכבה דקה של שרף אקרילי.
   2. השתמש במכשירי ניתוח עיקור. ביסודיות לחטא מסגרת stereotaxic והסביבה באמצעות 70% אתיל אלכוהול.
2. לבצע ניתוח השתלת stereotaxic
   1. להרדים בעלי חיים על ידי זריקת intraperitoneal של תערובת קוקטייל (2 מיליליטר / קילוגרם) של קטמין 10 מיליליטר (50 מ"ג / מיליליטר), hydrochloride xylazine 1.5 מיליליטר (23.32 מ"ג / מיליליטר), ומלח 2.5 מיליליטר. ודא שהחיה בהרדמה מלאה ואינה מגיבה לצובט זנב ובוהן. להזריק תערובת קוקטייל של 1 מיליליטר / קילוגרם במהלך ניתוח בעת צורך.
   2. תקן את בעלי החיים למנגנון stereotaxic. החל משחה עיניים על עיניים כדי למנוע יובש במהלך ניתוח. להתגלח ולנקות את הקרקפת עם 70% אתנול. תן הזרקה תת עורית של 2% לידוקאין ולחתוך SCALP לאורך קו האמצע של הגולגולת. לגמרי לגרד periosteum. יש לשטוף מספר פעמים עם מי מלח.
   3. הפוך קידוח בר-חור ליד השפה של הגולגולת. ברגי שתל 4-5 סיבובים (עד 1 מ"מ עומק) ממשטח הגולגולת כדי למנוע הפרת מאטר הדורה. ודא שאין דליפה של CSF ודם על פני השטח הגולגולת לאחר השתלת בורג. לשטוף עם מי מלח ולייבש את פני השטח הגולגולת באמצעות אוויר-עלים, בעיקר סביב הברגים.
   4. פני גולגולת מעיל עם שכבה דקה של "דבק שיניים (Super-בונד C & B)". לחלוטין לא מכסה את פני השטח של הגולגולת כולל גבחת אם השתלת אלקטרודה נוספת מתוכננת. השתמש בגבחת לסימון קואורדינטות פתיחת גולגולת. אלקטרודות ו / או דיסק קשיח זעיר שתל ולתקן את זה על ידי החלת גולגולת שרף אקרילי סביבו.
   5. החל שרף אקרילי נוסף על גבי מלט השיניים. השתמש בכמות מתאימה של שרף אקרילי לעזוב חלל מילוי החוצה מספיק בין שרף מצופה ברשרף הרכבה ראשוני ד כאשר להתקבע הברגים ו / או אלקטרודות (איור 2 א).
3. הנח בר הראש-קיבעון 5 מ"מ או יותר מעל פני השטח הגולגולת וליישר מרכזה (איור 2 א מרט).
4. החל שרף אקרילי לפער בין בסיס הגולגולת ושרפי הרכבה ראשוני. (איור 2 א מרכז). חכה עד שהשרף הפך קשה.
5. הסר אוזן-בר ולמשוך את mounter היצוק מהנמל בר קיבעון. (איור 2 א ה"זכות). זהירות להחיל שרף אקרילי נוסף סביב מסילות קצה mounter היצוק במידת צורך.
6. יש לשטוף את משטח הפצע בקרקפת עם תמיסת מלח סטרילית. להזריק אנטיביוטיקה (Enrofloxacin, 5 מ"ג / קילוגרם sc) ו( tartrate butorphanol, 2 מ"ג / קילוגרם sc) משכך כאבים מייד לאחר ניתוח. בית החיה בנפרד בכלוב אחד.

3. בעלי חיים הרגלה לראש קיבעון

הערה: דה צעד זהסופרי לוחות זמנים התרגלות מבוססים על ההערכות המוצלחות באופן אמפירי של המחברים. לסקירה כללית של הליך התרגלות לראש-קיבעון, לראות את העבודה של של ¹⁰ שוורץ או גואו ^11.

1. תן תקופת התאוששות מספקת (שבוע או יותר) לבעלי חיים. ביום 1, ידית בעלי חיים לעתים קרובות במפגשים קצרים חלוקים.
2. ביום שלמחרת (יום 2), לחשוף את בעלי החיים לסביבת הקיבעון (תיבה). אל תכניסו את ראשם mounter ליציאה של בר הקיבעון. השאר בעלי חיים כדי להתרגל לסביבה. מאובטח לתפוס mounter הראש בעזרת יד ל1 עד 2 שניות ולשחרר אותו באופן מיידי. חזור על קיבעון טווח קצר על ידי מספר פעמים ביד לתפוס.
3. ביום 3, להרגיל בעלי חיים לראש-קיבעון.
   1. להביא חיות מכלובי הבית וליישב אותם בתיבת בימוי ראשים לכיוון נמל בר הקיבעון. תפוס את mounter הראש ולהכניס אותו ליציאה של בר הקיבעון.
   2. תחייב את mounter (חיה שלראש) לוו הנעילה של בר הקיבעון באמצעות גומייה. לעמוד במשך 5 דקות.
      הערה: אל תיגעי בתא המטען או הזנב של החיה לאחר קיבוע, אשר מובילה את בעלי החיים לחריקה ולהיאבק הגדלת הלחץ של בעלי החיים. כאשר בעלי החיים ממשיכים נאבקים דקות יותר מ 1, לשחרר אותו ולנסות מאוחר יותר. מהצעד הזה, בעלי חיים מראים הפרשת שתן וצואה בכל פעם שנחשפה לראש קיבעון אבל זה בהדרגה מקבל מופחת כתמורת התרגלות.
   3. אחזר את הגומייה הנעילה ולהוציא את mounter מחוץ לנמל. שים את החיות בחזרה לכלוב בבית ולספק פיסת דגנים או זרעי חמניות לכלוב בבית כפרס. המשפט הבא מתחיל ב 30 דקות. חזור 3.4.1 ל3.4.4 חמש או יותר תוך יום.
4. ביום 4 עד 7, לחשוף את בעלי החיים לראש קיבעון, כמתואר בפרוטוקול 3.4. בהדרגה להגדיל את משך הזמן של קיבעון הראש (10 דקות, 20 דקות, 30 דקות, 50 דקות וכתמורת הרגלה).
   הערה: אם בעלי חיים לא יעשולא להאכיל את גמול מזון, זה יכול להיות סימן לרמה גבוהה של לחץ. לא להגדיל את זמן הקיבוע. אם בעלי החיים מראים חזר נאבקים התנהגות, להרגיל אותם לתקופה ארוכה יותר.
5. לבדוק את משקל גופו של בעל חיים יומיומי. שקול התרגלות לא מוצלחת כאשר משקל גוף הולך ופוחת. המשך למשימות התנהגותיות עם קיבעון ראש אחרי התרגלות מוצלחת.
   הערה: התרגלות מוצלחת מאפשרת אימון שלאחר מכן התנהגות (איור 3E וF).

תוצאות

שיטת קיבוע ראש זה חל על שני חולדות ועכברים. שמונה חולדות סה"כ קיבלו השתלה דו-צדדית של גירוי אלקטרודות לתוך צרור המוח הקדמי המדיאלי. לארבעה מתוכם, אלקטרודות חוט טונגסטן מותאמות אישית (microdrives) הושתלו גם לאזור forelimb M1 (איור 2 ג). לעכברים (n = 2), ארבע אלקטרודות חוט נ?...

Discussion

This protocol demonstrates a simple and convenient head fixation method using materials at hand. For physically successful head fixation, the first critical steps during surgery is to rinse and dry the skull surface clearly before applying the dental adhesive resin cement. Second, this method does not uses screws implanting under temporal muscles and only depends on the screws on the skull, their perpendicular implantation against the surface of skull rim is crucial¹⁰. This reduces the possibility of accidenta...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dental acrylic resin	Lang Dental Manufacturing	Ortho-Jet	to make molded mounter
Paraffin film	Bemis	Parafilm	to prevent adhesion of acrylic resin to the bar
Dental adhesive	Sun Medical	Super-Bond C&B	to bond between acrylic resin and skull
Plexglass or other acrylic plate			to make fixation bar and box platform
Cyanoacrylate			to bond acrylic plates