Kemirgenler Akrilik Reçine Kalıp Esaslı Başkanı Fixation Tekniği

Özet

Traditional head fixation techniques have used metallic frames attached on the skull as an interface for head fixation apparatus. This protocol demonstrates a frameless, acrylic resin molding based head fixation technique for behavioral tasks in rodents.

Özet

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires surgical attachment of metallic frames on the skull. The attached frames are then clamped to a stationary platform resulting in immobilization of the head. However, metallic frames for head fixation have been technically difficult to design and implement in general laboratory environment. In this study, we provide a novel head fixation method. Using a custom-made head fixation bar, head mounter is constructed during implantation surgery. After the application of acrylic resin for affixing implants such as electrodes and cannula on the skull, additional resins applied on top of that to build a mold matching to the port of the fixation bar. The molded head mounter serves as a guide rails, investigators conveniently fixate the animal’s head by inserting the head mounter into the port of the fixation bar. This method could be easily applicable if implantation surgery using dental acrylics is necessary and might be useful for laboratories that cannot easily fabricate CNC machined metal head-posts.

Giriş

Kafa tespit veya kafa kısıtlama sert sıkma için kafatası üzerinde bir çerçeve ya da plaka takarak hayvanın başını hareketsizleştirir bir tekniktir. Teknik, hassas duyusal stimülasyon, ya da uyanık hayvanlarda ^1-3 nöral kayıt olmadan ve uyku-uyanıklık döngüsü ⁴ sırasında juxtacellular etiketleme için davranışsal algılama için kabul edilmiştir. Aynı zamanda, in vivo beyin görüntüleme ^5,6 kullanılır. Şimdi kafa sabitleme tekniği nörobilim ve davranışsal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir araçtır.

Temelde, geleneksel kafa sabitleme kafatası ^6-8 üstündeki metal baş mesajların cerrahi eki gerektirir. Ek parça daha sonra baş immobilizasyonu ile sonuçlanan sabit bir platforma kenetlenir. Böyle nöral ve / veya optik kayıt, beyin devreleri müdahale olarak uyanık hayvanlarda nörofizyolojik araştırma, beyin görüntüleme diş akrilik kullanarak implantasyon cerrahisi eşlik ediyor. Bu nedenle,o deneysel gerektiğinde bu laboratuvarlarda kafa tespiti uygulamak için basit bir görev gibi görünüyor. Çerçeve evlerinde kafeslerde hayvanın doğal davranışlarını rahatsız değil, hafif ve yeterince küçük olması dizayn edilmelidir. Sabit platforma kenetlenmiş zaman da mekanik sertlik sağlar. Ayrıca deneysel amaçlarla bağlı biyouyumluluk vardır. Bu nedenle, tasarım ve genel laboratuar ekipmanları gibi baş mesajları imal etmek teknik olarak zordur.

Bu çalışmada, yeni bir baş tespit yöntemi, metal kafa Mesajları kullanmadan uygun sıkıştırma yoluyla mekanik sertlik sağlarken, tarif edilmektedir. Yöntemi kullanarak, kafa sabitleme implantasyonu genellikle beyin çalışma için kemirgenlerde gerçekleştirilen genel laboratuar koşulları altında yapılabilir. Metal baş mesajlar implan sırasında yapılan bir ısmarlama kafa sabitleme çubuğu ve kalıplama işlemi kısmen kalıplı akrilik reçine çimento ile değiştirilirtation cerrahisi. Sabitleme çubuğu gibi nöral kayıt sondaları, stimülasyon elektrotları gibi diğer implantlar, yüksek uzaysal uyumluluk sağlar. Ayrıca vidalı bağlama kaldırarak sabitleme platformunda hayvanın kafasını sıkma adımlarını kolaylaştırır. Biz önceki davranışsal çalışmada bu yöntem kullanılır ve bu yöntem pratik deneyler ⁹ uygulamak kolay ve rahat olduğu sonucuna varıldı.

Protokol

Etik Beyanı:
Bu deney Kyungpook Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylandı ve Bakımı ve Kullanımı Laboratuvar Hayvanları (Ulusal Sağlık Enstitüsü, 1996) Kılavuzu göre yapıldı. Deneyden sonra, karbon dioksit ötenazi altında kurban edilmiştir.

Sıçanlar için başlıklar tespit Bar 1. Tasarım

NOT: Bu adım, bir tespit çubuğu tasarımı için genel bir kılavuzdur. Boyut ve malzeme ile ilgili herhangi bir değişiklik hayvanlar veya implantlar bağlı mümkündür. CAD yazılımı kullanarak bir kafa sabitleme çubuğunu Tasarımı önerilir, ancak gerekli değildir.

1. Bir tespit çubuğu tasarlamak için CAD yazılımı kullanın.
   1. Bir dikdörtgen şeklinde (123 × 35 × 6 mm) (Şekil 1A) bir tespit çubuğu tasarlayın. Tespit çubuğunun ortasında, dikdörtgen bir çentik (port 16 × 20 mm) emin olun. Yamaçlarında ya da girintileri ekle yüklenebileceğinih (Şekil 1B -arrows Şekil 1A-) liman sınırları üzerinde kılavuz rayı olarak hizmet vermektedir.
      NOT: limanın alan kraniotomi yoluyla beyin bölgelerinin çoğunda bir stereotaksik manipülatör kullanarak dikey erişimlerini sağlamak için beynin üzerine sıçan kafatası tahmini dikdörtgen kapsar emin olun.
   2. Sabitleme çubuğunun her iki tarafta iki uzatılmış sabitleme delikleri (50 x 20 x 6 mm) plakaları takın. Bu delikler 6 mm çaplı (Şekil 1A-d) vidalarını geçmesi emin olun. Bir kilitleme kancası (Şekil 1A-B) bağlantı noktasının önünde çapı 3 mm bir delik açın.
   3. Bir kutu bir zemin (135 x 305 mm) ve yan duvarları (305 x 76 mm) sahip olun. Şekil 1A (ek) 'de gösterildiği gibi, iki 6 mm çaplı delik delin. Sabitleme bar (Şekil 1A-e) destek duvarları ekleyin.
2. Tasarlanmış bir bar imalatı ve kutu gibi siyanoakrilat kullanılarak her biri bir arayaŞekil 1A (ek) gösterilmiştir. 6 mm çapında vidalar kullanılarak kutusunu çubuğu birleştirin. Ergonomik kafa sabitleme (Şekil 1A-ek) için çubuğun vidalı pozisyonunu ayarlayarak eğimi uygulayın.
   NOT: Fare için, sabitleme çubuğunun boyutu (2 mm kalınlığında akrilik paneller iki katmandan oluşan), 60 x 20 x 4 mm 'dir. Port 8 mm genişliğinde (üst) ve Şekil 1C 'de gösterildiği gibi 9 x 10 mm (alt) kare olduğunu. Ankraj plakaları fareler 'aynı boyuttadır. Kutu plaka ve yan duvarlar sırasıyla 100 × 72 mm ve 100 × 50 mm, vardır.

İmplantasyon Cerrahisi sırasında 2. Başkanı Mounter İnşaat

DİKKAT: Diş akrilik reçine ile uğraşırken dikkatli olun. Sıvı cilt tahrişine neden olabilir. Bir maske koyun ve eldiven giyin. Iyi havalandırılan bir alanda çalışın.

1. Ameliyattan önce hazırlık
   1. Sıkıca tespit çubuğu kullanarak ap limanı sınır sarınbara uygulanan akrilik reçine yapışmasını önlemek için araffin film (Şekil 1B ve Şekil 2A 'ya bakınız). Kat akrilik reçine ince bir tabaka ile parafin film kaplı portun yatılı.
   2. Sterilize cerrahi aletler kullanın. İyice stereotaksik çerçeve dezenfekte ve onun% 70 etil alkol kullanarak çevredeki.
2. Stereotaksik implantasyon ameliyatı
   1. Intraperitonal ketamin 10 ml kokteyl karışımının enjeksiyonu (2 ml / kg) (50 mg / ml), ksilazin hidroklorür 1.5 ml (23.32 mg / ml) ve tuzlu su 2.5 mi, bir hayvan anestezisi. Hayvan tamamen uyuşturulduktan ve kuyruk ve ayak tutam yanıt vermiyor emin olun. Gerektiğinde, ameliyat sırasında, 1 ml / kg bir kokteyl karışımı enjekte edilir.
   2. Stereotaksik aparat hayvan sabitleyin. Ameliyat sırasında kuruluğunu önlemek için gözleri oftalmik merhem sürün. Tıraş ve% 70 etanol ile kafa derisi temizleyin. % 2 lidokain subkutan enjeksiyon vermek ve SCA insizyonKafatasının orta hat boyunca lp. Tamamen periost kazıyın. Tuzlu birkaç kez durulayın.
   3. Kafatasının kenarına yakın Burr-hole sondaj yapın. İmplant vidaları kafatası yüzeyinden 4-5 tur (1 mm kadar derinlik) dura mater ihlal önlemek için. Vida implantasyon sonrası kafatası yüzeyinde CSF ve kan emin hiçbir sızıntı olun. Tuzlu su ile durulayın ve özellikle vida etrafında, hava puf kullanarak kafatası yüzeyi kurulayın.
   4. "Dental yapıştırıcı (Süper Bond C & B)" ince bir tabaka ile kaplayın kafatası yüzeyi. Tamamen ek elektrot implantasyonu planlanan eğer bregma dahil kafatasının yüzeyini örtmeyin. Kraniyotomi koordinatları işaretleme için bregma kullanın. İmplant elektrotlar ve / veya Microdrive ve çevresinde akrilik reçine uygulayarak kafatası sabitleyin.
   5. Diş çimentosu en ek akrilik reçine uygulanır. Bar kaplı reçine arasında yeterli dolgu-out boşluk bırakmak için akrilik reçine uygun miktarda kullanınd İlk montaj reçine vida ve / veya elektrotların (Şekil 2A) sabitleme zaman.
3. Baş-sabitleme çubuğunu kafatası yüzeyi üzerinde 5 mm veya daha fazla koyun ve merkezi (Şekil 2A -Sol) hizalayın.
4. Kafa tabanı ve ilk montaj reçineler arasındaki boşluğa akrilik reçine uygulayın. (Şekil 2A -Center). Sert olmak reçine kadar bekleyin.
5. Kulak-bar çıkarın ve sabitleme çubuğu liman dışında kalıp Mounter çekin. (Şekil 2A -Sağ). Dikkatle kalıplanmış mounter gerektiğinde kenar rayları etrafında ek bir akrilik reçine uygulanır.
6. Steril serum fizyolojik ile kafa derisi yara yüzeyini durulayın. Ameliyattan hemen sonra bir antibiyotik (enrofloksasin, 5 mg / kg sc) ve bir analjezik (butorfanol tartrat, 2 mg / kg sc) enjekte edilir. Tek bir kafeste tek hayvan barındıracak.

3. alıştırmak Hayvanlar Baş-tespit etmek

Not: Bu adım DEYazarların ampirik başarılı değerlendirmelere dayalı alışkanlık programları scribes. Baş-sabitleme için alışkanlık prosedürünün genel bir bakış için, Schwartz'ın ^{10 veya} Guo'nun ¹¹ iş görmek.

1. Hayvanlara yeterli iyileşme süresini (bir hafta veya daha fazla) verin. Gün 1, sık sık bölünmüş kısa oturumlarında hayvanları taşıyınız.
2. Ertesi gün (Gün 2) üzerinde sabitleme ortamı (kutu) hayvan maruz bırakmaktadır. Tespit çubuğunun portuna onların baş Mounter takmayın. Çevreye alışması için hayvanları bırakın. Güvenli 1 ila 2 saniye elinizi kullanarak kafa Mounter kapmak ve hemen bırakın. El-kapmak birkaç kez kısa süreli fiksasyon tekrarlayın.
3. Gün 3, baş-tespitin hayvanları alıştırarak.
   1. Ev kafeslerden hayvanları getirin ve sabitleme çubuğu limanına doğru başlarını yönetmenlik kutuya yerleşmek. Baş Mounter tut ve tespit çubuğunun bağlantı noktasına takın.
   2. Hayvan en (Mounter Bindbir lastik bant kullanarak tespit çubuğunun kilitleme kancasına baş). 5 dakika bekleyin.
      NOT: gıcırtı ve hayvanın strese artan mücadele hayvan açar tespit sonrasında hayvanın gövde veya kuyruk dokunmayın. Hayvan fazla 1 dk mücadele devam ederse, bırakın ve daha sonra tekrar deneyin. Tespit kafa maruz ancak bu yavaş yavaş alışkanlık ilerledikçe azaltılmış olur zaman bu adımı itibaren, hayvanlar idrar ve dışkı atılımı göstermektedir.
   3. Kilitleme lastik bant alın ve liman dışında Mounter çıkarın. Eve kafesine hayvan koyun ve tahıl bir parça veya bir ödül olarak ev kafesin içine bir ayçiçeği tohumu sağlamaktadır. Bir sonraki duruşma 30 dakika başlar. Bir gün içinde 3.4.1 beş 3.4.4 ya da daha fazla tekrarlayın.
4. 7 Gün 4, Protokolün 3.4 anlatıldığı gibi tespit kafa hayvan maruz. Yavaş yavaş (10 dk, 20 dk, 30 dk, ve alışkanlık ilerledikçe 50 dakika) baş sabitleme süresini artırır.
   NOT: Hayvanlar yaparsanız hiçbirt stres düzeyi yüksek bir işareti olabilir, gıda ödül yem. Fiksasyon süresini artırmak etmeyin. Hayvanlar davranışı mücadele tekrarlanan göstermek ise, daha uzun bir süre onları alıştırmak.
5. Günlük hayvanın vücut ağırlığını kontrol edin. Vücut ağırlığı azalıyor başarısız alışkanlık düşünün. Başarılı alışkanlık sonra baş sabitleme ile davranışsal görevlere devam edin.
   NOT: Başarılı alışkanlık sonraki davranış eğitimi (Şekil 3E ve F) kolaylaştırır.

Sonuçlar

Bu kafa sabitleme yöntemi, farelerde ve sıçanlarda da uygulanabilir. Toplam sekiz sıçan medyal ön beyin demetine uyarıcı elektrot bilateral implante aldı. Bunların dördünde için özelleştirilmiş tungsten tel elektrotlar (Microdrives) ek M1 ön ayakları alanına (Şekil 2C) implante edildi. Fareler (n = 2), dört adet paslanmaz çelik tel elektrot frontal / Oksipital kortikal alanlara implante edildi. Ameliyattan çıktıktan sonra Protokol bölümünde 2. tarif olarak Ameliyat sırasınd...

Tartışmalar

This protocol demonstrates a simple and convenient head fixation method using materials at hand. For physically successful head fixation, the first critical steps during surgery is to rinse and dry the skull surface clearly before applying the dental adhesive resin cement. Second, this method does not uses screws implanting under temporal muscles and only depends on the screws on the skull, their perpendicular implantation against the surface of skull rim is crucial¹⁰. This reduces the possibility of accidenta...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dental acrylic resin	Lang Dental Manufacturing	Ortho-Jet	to make molded mounter
Paraffin film	Bemis	Parafilm	to prevent adhesion of acrylic resin to the bar
Dental adhesive	Sun Medical	Super-Bond C&B	to bond between acrylic resin and skull
Plexglass or other acrylic plate			to make fixation bar and box platform
Cyanoacrylate			to bond acrylic plates