אלקטרופיזיולוגיה בהכנות כבל מבודדות גזע המוח-השדרה מיילוד מכרסמים מאפשרת הקלטת תפוקת רשת הנשימה עצבית

Summary

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Abstract

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

Introduction

נשימה היא פעילות מורכבת וחיונית הנשלטת על ידי המוח, המאפשרת dioxygen (O ₂₎ ספיגה ופחמן דו חמצני (CO ₂₎ חיסול. כונן הנשימה המרכזי מופק על ידי רשת מורכבת ממוקמת בגזע המוח בשני היונקים ^1, דו-חיים ^2, זוחלים ^{3, 4} ציפורים ודגים ^5. גם אם המחקר של נשימה יכול להיות מעובד בvivo, חקירות מכניסטית מדויקות דורשות גישה ישירה לרשת שליטה בדרכי הנשימה. לשם כך, אדריאן וBuytendijk פיתחו הכנת דג זהב מופחתת, שבו אלקטרודות המונחת על משטח שיא גזע המוח קצב שנוצר קשור לאוורור זימים ^5. גישה זו הותאמה לאחר מכן על ידי Suzue בשנת 1984 ⁶ לשימוש במכרסמים שזה עתה נולד. כניסתו של תכשיר זה הובילה להתקדמות משמעותית בנוירוביולוגיה בדרכי הנשימה. מאז הוא פשוט יחסית, הטכניקה הציגה hבטרם ניתנים למגוון רחב של חקירות בסיסיות של התנהגויות מוטוריות קצביות ומקורותיהם במכרסמים שזה עתה נולד.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקליט את התשתית העצבית של פעילות שאיפה, קצב כמו-נשימה נקרא נשימה פיקטיבית, המיוצרת על ידי הרשת בדרכי הנשימה. שיטה זו יכולה להיות מועסק במגוון רחב של מטרות מחקר, מיקוד תגובות שאיפה לשינויים או פרמקולוגיה נשימה בסוג ⁷ ומהונדסים ⁸ שני חיות בר. בהתחשב בכך שהניסויים מבוצעים בטמפרטורה נמוכה, ללא afferents חושית, ובתנאים שבי הריכוזים של גלוקוז וO ₂ בתוך aCSF גבוהים, שאלות הועלו לגבי הרלוונטיות הפיזיולוגיות של האות נרשמה. אמנם יש הבדלים ברורים בין in vivo ובתנאי מבחנה (למשל., התדירות של התפרצויות שאיפה) העובדה היא שהנוכחות שלמרכיבי הליבה של רשת הנשימה ⁶ לעשות את זה אפשרי ללמוד מקצב חזק הקשורים לתפקוד homeostatic חיוני ^9,10.

הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בטכניקה זו הוא להקל על גישה ישירה לאלמנטי גזע המוח של הרשת בדרכי הנשימה, שהם כמעט ולא נגישים in vivo, במיוחד בתינוקות. גזע המוח ממוקם בתנאים מבוקרים בקפדנות: קצב שנרשם לא מווסת על ידי תשומות מביא היקפיים מהריאות או גופי התרדמה, המאפשר המחקר להתמקד בכונן הנשימה המרכזי עצמו ^11. לפיכך, גישה זו מנוצלת ליישם גירויים ולהקליט את אות הפלט. בניגוד לplethysmography הקלטות, קצב הנשימה הוא מווסת על ידי כל מרכיביו בכל הגוף (לדוגמא., התנפחות ריאות, chemosensors ההיקפי), ולכן קשה ליישם גירויים מדויקים.

בעכברוש ewborn, הפרוטוקול מורכב מהקלטת האות הרביעית הגחון שורש בגזע מוח מבודד וחוט השדרה קטוע, נשמר בנוזל מלאכותי Cerebro-השדרה (aCSF). קצב שנוצר על ידי הכנות כבל גזע המוח-השדרה מורכב מהתפרצויות איטיות בודדות שצמודות לאות השאיפה ^9. הכנות כבל גזע המוח-השדרה מבודדות בקלות לצריבה בחולדות מיום שלאחר הלידה 0-4 (P0 - P4) ^7. גישה זו משמשת בדרך כלל כדי להעריך את תגובת חוסר חמצן של רשת דרכי הנשימה, וגם התגובה לhypercapnia, חמצת או סמים. פרוטוקול היפוקסיה חריף מוצג כאן. גירוי זה מתקבל על ידי נסיגה של O ₂ בaCSF; גישה זו משמשת בדרך כלל כדי להעריך את הסובלנות והיענות לעלבונות חוסר חמצן. הפרוטוקול גורם דיכאון קצב מהרגע הראשון ועד לסוף חשיפת היפוקסיה (איור 1) ^12. דיכאון זה מתהפךבמהלך ¹² התאוששות לאחר חוסר חמצן. בנוגע לעיצוב ניסיוני, חשוב לשים לב שפונס, הממוקם בחלקו מקורי של גזע המוח, יש פעולה מעכבת על הגנרטור קצב ^8. כך, הכנות של גזע המוח וחוט השדרה מלאים מקורי להציג קצב נמוך יותר. הכללה של פונס במדגם המבודד להקלטה נקבעה בהתאם למטרת הניסוי ^13; המחקר של השפעת פונטיני ברשת הלשד המוארכת ידרוש הקלטות עם ובלי פונס להשוות את התוצאות ^14. יתר על כן, אחד היתרונות של שיטה זו היא האפשרות להארכת החלק מקורי של ההכנה לכולל mesencephalic ו / או אזורי diencephalic ^15,16, כך שניתן להעריך את ההשפעה של אזורים אלה ברשת הנשימה פונטו-לשדי.

Protocol

שיטה זו נדרשה שימוש נושאי בעלי חיים, אפשרו על ידי הוועדה לאוואל אוניברסיטת בעלי החיים אתיקה (פרוטוקול # 2,012-170).

1. התקנה והכנה

1. פתרונות
   1. הכן פתרונות מניות aCSF על פי המתכונים ^7,17 הבאים. מתכונים אחרים עם וריאציות ריכוז זמינים בספרות. פתרונות מניות חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד חודש.
      1. תמיסת מלח: להוסיף 75.39 גרם של NaCl (129 מ"מ סופי); 2.5 גרם של KCl (3.35 מ"מ סופי); 0.81 גרם של NaH2PO4 (0.58 מ"מ סופי); 2.33 גרם של MgCl2 (1.15 מ"מ סופי); 1.85 גרם של CaCl2 (1.26 מ"מ). ממיסים בכ -800 מיליליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן למלא לL 1 עם מים distillated.
      2. פתרון ביקרבונט: להוסיף 17.65 גרם של NaHCO ₃ (21 מ"מ סופי). ממיסים בכ -900 מיליליטר של מים distillated לאחר מכן למלא לL 1 עם מים מזוקקים. וריאציות של הריכוז ביקרבונט יגרמו וריאציות pH.
      3. פתרון גלוקוז: להוסיף 54.06גרם של גלוקוז (30 מ"מ סופי). ממיסים בכ -400 מיליליטר של מים distillated לאחר מכן למלא 500 מיליליטר מים מזוקקים.
   2. הכן aCSF על ידי דילול של תמיסת מלח 100 מיליליטר, של פתרון ביקרבונט 100 מיליליטר, 50 מ"ל ושל פתרון גלוקוז ב1 ליטר של מים מזוקקים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
   3. הכן אלקטרודת זכוכית על ידי התחממות ומתיחת צינור זכוכית עד שזה נשבר. חול במורד הקצה לפני השימוש. האלקטרודה ניתן לעשות שימוש חוזר הרבה זמן כל עוד הוא נשאר נקי.
2. הגדרת ניסוי
   הערה: פרטי ההגדרה מוצגים באיור 2.
   1. הפעל את המגבר, נע Averager, נתוני מערכת רכישה, בקר טמפרטורה ומשאבה. בדוק את ההגברה האות (רווח = 10,000), סינון (סף נמוך, 10 הרץ; סף גבוה, 5 kHz), וקצב הדגימה של אנלוגי להמרה דיגיטלית של אות הגלם (2.5 kHz).
   2. מלאו בקבוק עם aCSF ובועה זה עם carbogen (95% O ₂ , 5% CO _2). לגרום bubbled- וחמם aCSF זרימה בתא ההקלטה (נפח 5 מיליליטר) בשעה 4 מיליליטר / דקה. החזק את הטמפרטורה בחדר ההקלטה ב 26 (± 1) מעלות צלזיוס. pH צריך להיות 7.4 בתנאים סטנדרטיים אלה.
   3. שמור 50 מיליליטר של RT וaCSF-בועות carbogen במזרק 50 מיליליטר ליד חדר הניתוח.
   4. הפעל את המחשב ולהפעיל את תוכנת ההקלטה.

2. Dissection

1. לשקול וחזותי לקבוע את מינו של בעל החיים (זכרים כבר ano-גניטלי מרחק, ואילו נקבות יש מרחק ano באיברי המין קצר; זכרי איברי מין הם בדרך כלל כהים ואילו איברי המין נקביים הם ורוד).
2. להרדים את מכרסמים שזה עתה נולד על ידי אחת מהאפשרויות הבאות: cryoanesthesia (לטבול לחלוטין בבעלי החיים בקרח 4 - 5 דקות ^18), הזרקה (equitensine ב 4 מיליליטר / קילוגרם) ¹⁹ או שאיפה של חומרי הרדמה נדיפים (isoflurane או אתר ^{21 20).} Confirm מטוס נאות של הרדמה על ידי היעדר רפלקס נסיגת כפה.
3. מניחים את החיה על הספסל, פני הגחון למטה. סעיף החלק מקורי של הראש coronally עם אזמל ברמת גבחת (גלויה דרך העור והגולגולת). לבצע שלב זה מייד לאחר החיה מורדמת.
4. סעיף הגוף coronally עם אזמל תחת החברים הקדמי.
5. להסיר עור, שרירים, רקמות שומן וקיבה עם מספריים וצבת כירורגית ודקים. מאז העצמות רכות בגיל הזה, להיות זהיר שלא לפגוע במערכת העצבים. לבצע שלב זה על הספסל.
6. מניחים את ההכנה בתא לנתיחה. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה. מנקודה לסוף ההקלטה זו, השתמש במיקרוסקופ.
7. על פניו הגב של ההכנה, לחתוך את הגולגולת וחוליות מהמקוריות לחלק הזנב לאורך הציר הבינוני עם מספריים וצבת כירורגית ודקים. פתח את הגולגולת לחתוךוחוליות במטרה לחשוף את רקמת העצבים. השתמש בaCSF strored במזרק לחמצן ההכנה.
8. עם הצבת, להסיר את קרום נואיד, רקמה דקה המכסה את פני השטח של רקמת העצבים. שמור קרום רך וכלי דם נגד רקמת העצבים. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה.
9. מניחים את ההכנה עם הגב עם פנים כלפי מטה, ובזהירות להפיל את גזע המוח וחוט השדרה על ידי חיתוך העצבים ורקמות חיבור עם המספריים תוך החזקת ההכנה במקום. גישת גב היא גם אפשרית. שמור את השורשים ועצבי זמן רב ככל האפשר. הסר את העצמות לבודד את גזע המוח וחוט השדרה. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה.
10. הסר את המוח הקטן ונותר מבנים מקורי על ידי חתכם עם האזמל. השתמש בaCSF מאוחסן במחט לחמצן ההכנה.
11. לחלופין בהתאם experimenעיצוב טל, להסיר את פונס עם האזמל על ידי קדמי סעיף העטרה לעורק המוח הקטן הנחות ^22. שימו לב שהשמירה על כל פונס יהיה להאט את קצב בחולדות ומלאה לעכב אותו בעכברים. הכנות הכוללות את חלק הזנב רק של פונס להציג פעילות כמו נשימה-עם תדר יציב בשורש C4.

3. הקלטה

1. מניחים את ההכנה בחדר הקלטה, עם הפנים כלפי מעלה הגחון. תקן את ההכנה עם סיכות בחלק הנמוך ביותר של חוט השדרה והמקורי ביותר החלק מגזע המוח.
2. באמצעות מזרק הצמוד לאלקטרודה על ידי מחטה, לגרום לדיכאון באלקטרודה (קוטר הקצה של כוס: 150-225 מיקרומטר) על ידי תלישת הבוכנה המזרק, כדי למלא באופן חלקי את האלקטרודה עם aCSF.
3. באמצעות micromanipulator, למקם בזהירות את האלקטרודה קרובה לאחד משורשי הגחון הרביעי. שורשי הגחון אחרים יכולים גם להציג כמו נשימה-פעילות (ה.ז., עצב גולגולת XII, C1 שורש הגחון).
4. לגרום לדיכאון במכל אלקטרודה באמצעות המזרק ידי משיכת הבוכנה כדי לשאוב שָׁרשׁוֹן העצב בעדינות. לאחר מכן לעבור בזהירות את האלקטרודה ליישם אותו נגד חוט השדרה.
   הערה: באופן אידיאלי בגודל של שָׁרשׁוֹן מתאים לגודל של פתיחת האלקטרודה ובכך יוצר חותם בין התאים הפנימיים וחיצוניים של האלקטרודה. מאז מגברי ההפרש משמשים בדרך כלל להקלטות כאמור, כל פתיחה בין החלק הפנימי של האלקטרודה ותא ההקלטה מפחיתה את איכות האות ומקשה על למנוע רעש רקע.
5. התחל ההקלטה.
6. רשום את קצב מיוצר על ידי ההכנה בתנאי normoxic (כלומר, aCSF מבעבע עם carbogen: 95% CO ₂ O ו 5% ₂₎ לפחות 20 דקות כדי לקבוע את הפרמטרים הבסיסיים של ההכנה.
7. לעבור זלוף מaCSF-בועות carbogen לaCSF גירוי (כלומר, מבעבע עם 95% N _2, 5% CO ₂ לגירוי היפוקסיה) במשך 15 דקות. לשנות משך חשיפה בהתאם לפרוטוקול הניסוי. רשום את משך החשיפה בגיליון הנתונים של ההקלטה ובעלי חיים. השתמש בצינורות נירוסטה בין בקבוק aCSF ותא בכל הזדמנות אפשרית, כדי למנוע דיפוזיה גז לחלק החיצוני של הצינור.
8. לעבור זלוף בחזרה לaCSF-בועות carbogen הסטנדרטי לפחות 15 דקות להקלטת התאוששות. שיא זה בגיליון הנתונים של ההקלטה ובעלי חיים.
9. לסיים את ההקלטה.

4. ניתוח סטטיסטי

1. מהאות המשולבת, לחשב את התדירות כמו מספר ההתפרצויות לדקה (באה לידי ביטוי בהתפרצויות / min), משרעת כהפרש בין קו הבסיס והשיא של הפרץ (בא לידי ביטוי בmV), משך הפרץ כמשך מ המתחילה ועד סופו של הפרץ (באה לידי ביטוי בים), אזור הפרץ כאזור תחת נוכve של הפרץ באות המשולבת (באה לידי ביטוי בmV · ים) (איור 3).
2. לחשב את התדירות, משרעת, משך פרץ ואזור פרץ תחת normoxic (בסיס), חוסר חמצן (גירוי) ותנאים שלאחר חוסר חמצן התאוששות (לאחר הגירוי) כממוצע של 5 דקות האחרונות של הקלטות לכל מצב. אל תנתח את החלק הראשון של כל מצב, כי יש עיכוב בין מיתוג הומוגניזציה זלוף וaCSF בתא ההקלטה.
3. הגעה אז גירוי (כלומר, היפוקסיה) ופוסט-גירוי ערכי התאוששות (כלומר, לאחר חוסר חמצן) כאחוז מערכי הבסיס להקלטה המקבילה. הגעה התוצאות כאמצעי ± SD

תוצאות

כפי שצוין במבוא, אחד היתרונות החשובים ביותר של טכניקה זו היא הגישה הישירה לגזע המוח ליישם גירויים שונים. כדוגמא, היפוקסיה יושמה כאן. איור 1. א.ב. מציג הקלטת פרוטוקול מלאה, עם שני תנאי normoxic וחוסר חמצן. איור 1.CE מציגה את קצב שנרשם בתנאי normoxic (כלומר, aCSF...

Discussion

כימות מדויק של פעילות נשימה יכול להיות מאתגר. ואכן, נשימה היא פונקציה שיכולה להיות גם אוטומטי ורצון, וכי הוא מווסת בהתאם לסביבה, הצרכים של הגוף, המצב הרגשי וההתנהגות. היתרון של שיטה זו הוא הבידוד של האלמנטים העצביים האחראים לייצור את פקודת דרכי הנשימה. לפיכך, קלטות אלק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	Use under hood
NaCl	Bioshop	SOD002
KCl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	SPM306
D-glucose	Bioshop	GLU501
Carbogen	Linde	343-02-0006
Temperature Controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Suction electrode	A-M Systems, Everett, WA, USA	model 573000
Differential AC amplifier	A-M Systems, Everett, WA, USA	model 1700
Moving averager	CWE, Ardmore, PA, USA	model MA-821
Data acquisition system	Dataq Instruments, Akron, OH, USA	model DI-720
LabChart software	ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware	Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber	Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber	Home made
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA	KITE-R
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	MINIPULS 3
Faraday Cage	Home made
Computer