JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Аннотация

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

Введение

Дыхание представляет собой сложный и жизнедеятельность контролируется мозгом, что позволяет молекулярным кислородом (O 2) поглощение и двуокись углерода (CO 2) ликвидации. Центральный дыхательных привод генерируется сложной сети, расположенной в стволе головного мозга в обоих млекопитающих, земноводных 1 2 3, рептилий, птиц и рыб 4 5. Даже если исследование дыхания могут быть обработаны в естественных условиях, точные механистические исследования требуют прямого доступа к сети дыхательной управления. С этой целью, Адриан и Бойтендейк разработан уменьшенный подготовку рыбка, в котором электродами, расположенными на поверхности ствола мозга записи сгенерированного ритм, связанный с жаберной вентиляции 5. Этот подход был впоследствии адаптирована Suzue в 1984 6 для использования в новорожденных грызунов. Появление этого препарата привело к значительному прогрессу в дыхательных нейробиологии. Так как это относительно простой, метод представлены часпрежде чем поддается широкого круга основных исследований художественной поведения моторных и их происхождении у новорожденных грызунов.

Общая цель этого метода заключается в регистрации нейронной коррелят вдоха деятельности, дыхания, как ритм называется фиктивным дыхание, произведенный дыхательных сети. Этот метод может быть использован в широком диапазоне задач исследования, ориентированные вдоха ответов на дыхательных вариаций или фармакологии в обоих дикого типа и трансгенных 7 8 животных. Учитывая, что эксперименты проводятся при низкой температуре, без сенсорных афферентных и в условиях, когда концентрация глюкозы и O 2 в пределах ACSF высоким, возникают вопросы относительно физиологическое значение сигнала, записанного. В то время как существуют четкие различия между в естественных условиях и в условиях лабораторных (например., Частота вдоха всплесков) остается фактом, что при наличииосновные элементы дыхательной сети 6 позволяют изучать надежную ритм, связанный с жизненной гомеостатической функции 9,10.

Обоснованием разработки и использования этой методики состоит в содействии прямой доступ к стволовых элементов дыхательной сети, которые труднодоступны в живом организме, особенно у новорожденных. Ствола головного мозга находится в строго контролируемых условиях: записанный ритм не модулируется периферийных афферентных входов из легких или сонных тел, что позволяет изучение сосредоточиться на центральной дыхательной диске самой 11. Таким образом, этот доступ используется для применения стимулов и записывать выходной сигнал. В отличие от плетизмографии записи, ритм дыхания модулируется все его компоненты по всему телу (например,., Легких, периферические живота хемосенсоров), что делает его трудно применять точные стимулы.

Вewborn крыса, протокол состоит из записи четвертого вентральной корень сигнала на изолированном мозга и усеченный спинного мозга, поддерживается искусственным спинномозговой жидкости (ACSF). Ритм генерируется стволовых-препаратах спинного мозга состоит из отдельных всплесков медленных, которые связаны с вдоха сигнала 9. Изолированные ствола мозга-препаратах спинного мозга легко записываемых на крысах с послеродовой день 0 до 4 (P0 - P4) 7. Этот подход обычно используется для оценки гипоксического реакцию дыхательных сети, а также ответ на гиперкапнии, ацидоза или наркотиков. Острый протокол гипоксия, представленные здесь. Эта стимуляция получается вывода O 2 в ACSF; этот подход обычно используется для оценки толерантности и реагирования на гипоксических оскорбления. Протокол не вызывает ритм депрессии с первой минуты и до конца экспозиции гипоксии (рис 1) 12. Эта депрессия восстанавливаетсяво-гипоксического после восстановления 12. Относительно экспериментального дизайна, важно заметить, что Понс, расположенные в ростральной части мозга, оказывает тормозящее действие на ритм генератора 8. Таким образом, препараты полном мозга и спинного мозга ростральной отображения нижний ритм. Включение моста в выделенного образца для записи определяется в соответствии с целью эксперимента 13; изучение влияния на мостовой продолговатый мозг сети потребует записи с и без моста, чтобы сравнить результаты 14. Кроме того, одним из преимуществ этого метода является возможность продления ростральной часть подготовки включает мезенцефалической и / или диэнцефальные регионы 15,16, что делает возможным, чтобы оценить влияние этих регионах на дыхательную сети Понто-медуллярной.

протокол

Этот метод требует использования предметов, разрешенных животных комитета Laval University Animal этики (протокол № 2012-170) от.

1. Установка и подготовка

  1. Решения
    1. Подготовьте ACSF растворы в соответствии со следующими рецептами 7,17. Другие рецепты с вариациями концентрации доступны в литературе. Магазин растворы при 4 ° С на срок до одного месяца.
      1. Соль решение: добавить 75.39 г NaCl (129 мМ финал); 2,5 г KCl (3,35 мМ финал); 0,81 г NaH2PO4 (0.58 мМ финал); 2.33 г MgCl2 (1,15 мм финал); 1,85 г CaCl2 (1,26 мМ). Растворите в 800 мл дистиллированной воды залейте 1 л дистиллированной воды с.
      2. Бикарбонат решение: добавить 17,65 г NaHCO 3 (21 мм финал). Растворить в 900 мл дистиллированной воды в затем заполнить до 1 л дистиллированной водой. Вариации концентрации бикарбоната будет приводить к изменениям рН.
      3. Глюкоза решение: добавить 54.06г глюкозы (30 мМ конечной). Растворить в 400 мл дистиллированной воды в затем заполнить до 500 мл дистиллированной водой.
    2. Подготовьте ACSF разбавлением 100 мл солевого раствора, 100 мл раствора бикарбоната и 50 мл раствора глюкозы в 1 л дистиллированной воды. Хранить при 4 ° С до использования.
    3. Подготовьте стеклянный электрод при нагревании и растяжения стеклянную трубку, пока она не сломается. Песок вниз кончиком перед использованием. Электрод может быть использован повторно много раз до тех пор, пока она остается чистой.
  2. Экспериментальная установка
    Обратите внимание: набор-до сведения представлены на рисунке 2.
    1. Включите усилитель, перемещение усреднения, системы сбора данных, регулятор температуры и насос. Проверьте усиление сигнала (коэффициента усиления = 10000), фильтрации (низкий порог, 10 Гц; верхний порог, 5 кГц) и частоту дискретизации аналого-цифрового преобразования исходного сигнала (2,5 кГц).
    2. Заполните бутылку с ACSF и пузырь его с карбогена (95% O 2 , 5% СО 2). Индуцируют bubbled- и нагревают-ACSF потока в камере записи (объем 5 мл) при 4 мл / мин. Держите температуру в камере записи на 26 (± 1) ° С. рН должен быть 7,4 в этих стандартных условиях.
    3. Держите 50 мл РТ и карбогена-ыми ACSF в 50 мл шприц возле рассечение камере.
    4. Включите компьютер и запустите программное обеспечение для записи.

2. Препарирование

  1. Взвешивание и визуально определить пол животного (у самцов больше АНО-генитальный расстояние, в то время как женщины имеют короткий АНО-генитальный расстояние; мужчины гениталии часто темно, а женские половые органы розовый).
  2. Обезболить новорожденных грызунов одним из следующих вариантов: cryoanesthesia (полностью погружать животное в лед в течение 4 - 5 мин 18), инъекции (equitensine в 4 мл / кг) 19 или вдыхания летучих анестетиков (изофлуран 20 или эфирных 21). КонфиRM адекватной анестезии самолет в отсутствии лапы отмены рефлекса.
  3. Поместите животное на скамейке, брюшной лицом вниз. Раздел ростральной части головы коронки с помощью скальпеля на уровне темени (видимый через кожу и череп). Выполните этот шаг сразу же после животное под наркозом.
  4. Раздел тело коронки с помощью скальпеля под передними членов.
  5. Удалить кожу, мышцы, жировую ткань и внутреннего органа с хирургическими и тонких ножниц и щипцов. С кости мягкие в этом возрасте, будьте осторожны, чтобы не повредить нервную систему. Выполните этот шаг на скамью.
  6. Поместите подготовку в рассечение камере. Используйте ACSF хранится в шприц кислородом подготовку. С этой точки до конца записи, в микроскоп.
  7. На спинной поверхности препарата, сократить череп и позвонки от ростральной к хвостовой части вдоль средней оси с хирургическими ножницами и тонких и клещами. Откройте вырезать черепи позвонки для того, чтобы подвергать нервную ткань. Используйте ACSF strored в шприц кислородом подготовку.
  8. С помощью плоскогубцев снимите паутинной оболочки, тонкая ткань, покрывающая поверхность нервной ткани. Сохраните мягкой мозговой оболочки и кровеносные сосуды от нервной ткани. Используйте ACSF хранится в шприц кислородом подготовку.
  9. Поместите препарат с спинной стороной вниз, и тщательно сбить ствол мозга и спинной мозг путем разрезания нервов и соединительной ткани с ножницами, держа подготовку на месте. Спинной подход также возможно. Держите корни и нервы как можно дольше. Удалить кости, чтобы изолировать ствол мозга и спинной мозг. Используйте ACSF хранится в шприц кислородом подготовку.
  10. Удалить мозжечок и остальные ростральные структуры секционирования их скальпелем. Используйте ACSF хранится в иглу, чтобы кислородом подготовку.
  11. При желании в зависимости от экспериментальТаль дизайн, удалить варолиев с скальпелем корональной разделе передней к нижней мозжечковой артерии 22. Обратите внимание, что сохраняя весь варолиев замедлится ритм у крыс и полностью подавляют его у мышей. Препараты, которые содержат только хвостовой частью моста отображения дыхания, как деятельность со стабильной частотой в корне C4.

3. Запись

  1. Поместите подготовку в записи камеры, вентральной стороной вверх. Закрепите препарат с контактами в нижней части спинного мозга и ростральной-большая часть мозга.
  2. С помощью шприца, связанный с электродом его иглы, вызвать депрессию в электрод (диаметром стекло наконечника: 150 - 225 мкм), потянув поршень шприца, чтобы частично заполнить электрод с ACSF.
  3. Использование микроманипулятора, осторожно поместите электрод, близкий к одному из четвертого брюшных корней. Другие брюшные корни могут также представить дыхания, как деятельность (е.г., XII черепных нервов, С1 вентральной корень).
  4. Вызвать депрессию в электродной бак через шприц, потянув поршень, чтобы мягко аспирата нерва корешок. Затем осторожно перемещать электрод, чтобы применить его против спинного мозга.
    Примечание: В идеальном случае размер корешка соответствует размеру отверстия электрода и, следовательно, создает уплотнение между внутренними и внешними отсеками электрода. Так дифференциальные усилители обычно используются для таких записей, любое отверстие между внутренней частью электрода и запись камеры снижает качество сигнала и делает его трудно устранить фоновый шум.
  5. Начните запись.
  6. Записывают ритм производимого препарата в условиях нормоксических (т.е. ACSF барботировали карбогена: 95% O 2 и 5% СО 2), по крайней мере 20 мин, чтобы определить параметры исходных препарата.
  7. Включите перфузии от карбогена-ыми ACSF кстимул ACSF (т.е. пропускают с 95% N 2 и 5% CO 2 в течение гипоксии стимул) в течение 15 мин. Alter продолжительность экспозиции в зависимости от экспериментального протокола. Запишите продолжительность экспозиции на записи и животных таблицы. Использование труб из нержавеющей стали между ACSF бутылки и камеры, когда это возможно, чтобы избежать диффузии газа к наружной трубе.
  8. Включите перфузии на стандартный карбогена-ыми ACSF по крайней мере 15 мин для записи восстановления. Запишите это на записи и животных таблицы.
  9. Конец записи.

4. Статистический анализ

  1. Из комплексного сигнала, вычислить частоту, что и числа пакетов в минуту (выраженной в пакетах / мин), амплитуду как разницу между базовой и пик всплеска (выраженной в мВ), то длительности пакета, как продолжительность от начало до конца пакета (в сек), площадь взрыв как площадь под дворняжкаве всплеска по комплексному сигнала (выраженной в мВ · с) (рис 3).
  2. Рассчитайте частоту, амплитуду, длительность и взрыв взрыв площадь под нормоксических (базовый), гипоксическая (стимул) и пост-гипоксические условия (пост-стимул) восстановления как в среднем по последней 5 мин записей для каждого условия. Не проанализировать первую часть каждого условия, потому что есть задержка между включением и перфузии ACSF гомогенизации в записи камеры.
  3. Экспресс тогда стимул (то есть, гипоксия) и пост-стимул (то есть, после гипоксии) значения восстановления в процентах от исходных значений для соответствующего записи. Экспресс результаты в виде среднего ± SD

Результаты

Как уже упоминалось во введении, одним из самых важных преимуществ этого метода является прямой доступ к мозга применять различные стимулы. В качестве примера, гипоксия была применена здесь. Рисунок 1. Б. показывает запись полный протокол, с обеих нормоксических и гипоксии.

Обсуждение

Точная количественная оценка дыхательной деятельности может быть сложной задачей. Действительно, дыхание является функцией, которая может быть как автоматической, так и на добровольной основе, и что изменяется в зависимости от окружающей среды, потребности организма, эмоционального ...

Раскрытие информации

The authors have no competing financial interests or conflicts of interests to disclose.

Благодарности

The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children’s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
SylgardSigma Aldrich761036-5EAUse under hood
NaClBioshopSOD002
KClBioshopPOC888
CaCl2BioshopCCL444
MgCl2BioshopMAG510
NaHCO3BioshopSOB999
NaH2PO4BioshopSPM306
D-glucoseBioshopGLU501
CarbogenLinde343-02-0006 
Temperature ControllerWarner Instruments, Hamden, CT, USATC-324B
Suction electrodeA-M Systems, Everett, WA, USAmodel 573000
Differential AC amplifierA-M Systems, Everett, WA, USAmodel 1700
Moving averagerCWE, Ardmore, PA, USAmodel MA-821
Data acquisition systemDataq Instruments, Akron, OH, USAmodel DI-720
LabChart softwareADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofwareGraphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamberPlastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamberHome made
BaseKanetec, Bensenville, IL, USAMB
MicromanipulatorWorld Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USAKITE-R
BaseKanetec, Bensenville, IL, USAMB
Peristaltic pumpGilson, Middleton, WI, USAMINIPULS 3
Faraday CageHome made
Computer

Ссылки

  1. Feldman, J. L., Del Negro, ., A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
  2. Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
  3. Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
  4. Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
  5. Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
  6. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
  7. Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
  8. Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
  9. Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
  10. Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
  11. Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
  12. Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
  13. Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. , 165-201 (2007).
  14. Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
  15. Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
  16. Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
  17. Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
  18. Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
  19. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
  20. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
  21. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
  22. Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
  23. Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
  24. Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
  25. Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).
  26. Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
  27. Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
  28. Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
  29. Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
  30. Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
  31. Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
  32. Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
  33. St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

105

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены