Électrophysiologie sur isolés Cord Préparatifs du tronc cérébral-spinal de la naissance Rongeurs Permet Neural respiratoire Réseau d'enregistrement de sortie

Résumé

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Résumé

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

Introduction

La respiration est une activité complexe et vital commandé par le cerveau, ce qui permet dioxygène _(O 2) et l'absorption du dioxyde de carbone _(CO 2) d'élimination. L'entraînement respiratoire centrale est généré par un réseau complexe situé dans le tronc cérébral dans les deux mammifères ^{1, 2} amphibiens, reptiles, oiseaux ^{3 4 et 5} poissons. Même si l'étude de la respiration peut être traitée in vivo, les enquêtes mécanistes précises nécessitent un accès direct au réseau de contrôle respiratoire. À cette fin, Adrian et Buytendijk développé une préparation de poisson rouge réduite, dans laquelle des électrodes placées sur le record de surface du tronc cérébral le rythme généré associé à la ventilation des branchies ^5. Cette approche a ensuite été adapté par Suzue en 1984 ^{6 pour une utilisation} chez les rongeurs nouveau-nés. L'avènement de cette préparation a conduit à des avancées significatives dans la neurobiologie respiratoire. Étant donné qu'il est relativement simple, la technique présentée here se prête à un large éventail d'enquêtes de base de comportements moteurs rythmiques et leurs origines chez les rongeurs nouveau-nés.

L'objectif global de cette méthode est d'enregistrer le corrélat neuronal de l'activité inspiratoire, un rythme respiratoire de type appelé respiration fictive, produite par le réseau des voies respiratoires. Ce procédé peut être utilisé dans un large éventail d'objectifs de recherche, visant les réponses inspiratoires aux variations ou la pharmacologie respiratoires dans les deux sauvages de type ^{7 et 8 animaux} transgéniques. Étant donné que les expériences sont réalisées à basse température, sans afférences sensorielles, et dans des conditions où les concentrations de glucose et de O ₂ dans le aCSF sont élevés, des questions ont été soulevées quant à la pertinence physiologique du signal enregistré. Bien qu'il existe des différences claires entre in vivo et in vitro de conditions (par exemple., La fréquence de salves inspiratoire) le fait demeure que la présence deles éléments de base du réseau des voies respiratoires ⁶ permettent d'étudier un rythme robuste associée à une fonction homéostatique essentiel ^9,10.

La raison derrière le développement et l'utilisation de cette technique est de faciliter l'accès direct aux éléments du tronc cérébral du réseau des voies respiratoires, qui sont difficilement accessibles in vivo, en particulier dans les nouveaux-nés. Le tronc cérébral est placé dans des conditions strictement contrôlées: le rythme enregistré est pas modulée par des apports afférents périphériques des poumons ou les organes de la carotide, ce qui permet l'étude de se concentrer sur l'entraînement respiratoire centrale elle-même ^11. Ainsi, cet accès est utilisé pour appliquer des stimuli et enregistrer le signal de sortie. Contrairement à la pléthysmographie enregistrements, le rythme respiratoire est modulée par la totalité de ses composants dans tout le corps (par ex., Distension pulmonaire, senseurs chimiques périphériques), ce qui rend difficile l'application de stimuli précis.

Dans unewborn rat, le protocole consiste à enregistrer le quatrième signal de la racine ventrale sur un tronc cérébral isolé et une moelle épinière tronqué, maintenue dans le liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF). Le rythme généré par les préparations de la moelle du tronc cérébral-spinal est constituée de salves lentes individuels qui sont liés au signal inspiratoire ^9. Préparations isolées de la moelle épinière tronc cérébral sont facilement enregistrables chez les rats de jour postnatal 0 à 4 (P0 - P4) ^7. Cette approche est couramment utilisé pour évaluer la réponse hypoxique du réseau des voies respiratoires, ainsi que la réponse à l'hypercapnie, acidose ou de drogues. Un protocole d'hypoxie aiguë est présenté ici. Cette stimulation est obtenue par retrait de O ₂ dans le aCSF; cette approche est couramment utilisé pour évaluer la tolérance et de la réactivité à des insultes hypoxiques. Le protocole induit une dépression du rythme dès la première minute jusqu'à la fin de l'exposition de l'hypoxie (figure 1) ^12. Cette dépression est inversépendant la post-hypoxique ¹² de récupération. En ce qui concerne la conception expérimentale, il est important de noter que le pont, situé à la partie rostrale du tronc cérébral, a une action inhibitrice sur le générateur de rythme ^8. Ainsi, les préparations de pleine tronc cérébral et la moelle épinière rostrale affichent un rythme plus faible. L'inclusion de la protubérance dans l'échantillon isolé de l'enregistrement est déterminée en fonction du but de l'expérience ^13; l'étude de l'influence pontique sur le réseau bulbe rachidien de exigerait enregistrements avec et sans les pons de comparer les résultats ^14. En outre, l'un des avantages de cette technique est la possibilité d'étendre la partie rostrale de la préparation d'inclure mésencéphalique et / ou régions diencéphaliques ^15,16, ce qui permet d'évaluer l'effet de ces régions sur le réseau des voies respiratoires ponto-médullaire.

Protocole

Cette méthode nécessitait l'utilisation de sujets animaux, autorisés par le Comité d'éthique animale de l'Université Laval (protocole N ° 2012-170).

1. Configuration et préparation

1. Solutions
   1. Préparer des solutions de ACSF selon les recettes ^7,17 suivantes. D'autres recettes avec des variations de concentration sont disponibles dans la littérature. Solutions magasin d'achat d'actions à 4 ° C pour jusqu'à un mois.
      1. Sel solution: ajouter 75,39 g de NaCl (129 mM final); 2,5 g de KCl (3,35 mM final); 0,81 g de NaH2PO4 (0.58 mM final); 2,33 g de MgCl2 (1,15 mM final); 1,85 g de CaCl2 (1,26 mM). Dissoudre dans 800 ml d'eau distillée puis remplir à 1 L avec de l'eau distillée.
      2. Une solution de bicarbonate: ajouter 17,65 g de NaHCO ₃ (21 mM final). Dissoudre dans 900 ml d'eau distillée puis remplir à 1 L avec de l'eau distillée. Les variations de la concentration en bicarbonate se traduiront par des variations de pH.
      3. Une solution de glucose: ajouter 54.06g de glucose (30 mM final). Dissoudre dans 400 ml d'eau distillée puis remplir à 500 ml avec de l'eau distillée.
   2. Préparer aCSF en diluant 100 ml d'une solution de sel, 100 ml d'une solution de bicarbonate et 50 ml de solution de glucose dans 1 litre d'eau distillée. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
   3. Préparer une électrode de verre par chauffage et étirage d'un tube de verre jusqu'à ce qu'elle se casse. Poncer la pointe avant de l'utiliser. L'électrode peut être réutilisé plusieurs fois aussi longtemps qu'il reste propre.
2. Installation expérimentale
   Remarque: Les détails de mise en place sont présentés dans la figure 2.
   1. Mettez l'amplificateur, le déplacement de calcul de moyenne, le système d'acquisition de données, le contrôleur de température et la pompe. Vérifiez l'amplification du signal (gain = 10 000), la filtration (seuil bas, 10 Hz; seuil haut, 5 kHz), et le taux d'échantillonnage de la conversion analogique-numérique du signal brut (2,5 kHz).
   2. Remplissez une bouteille avec aCSF et bulle avec carbogène (95% O ₂ , 5% CO _2). Induire une bubbled- et réchauffé aCSF écoulement dans la chambre d'enregistrement (volume 5 ml) à 4 ml / min. Maintenir la température dans la chambre d'enregistrement à 26 (± 1) ° C. pH devrait être de 7,4 dans ces conditions standard.
   3. Maintenir 50 ml de carbogène et RT-aCSF barboter dans une seringue de 50 ml à proximité de la chambre de dissection.
   4. Allumez l'ordinateur et lancez le logiciel d'enregistrement.

2. Dissection

1. Peser et de déterminer visuellement le sexe de l'animal (les mâles ont une ano-génitale plus longue distance, tandis que les femelles ont une distance ano-génitale court; les mâles les organes génitaux sont souvent sombres tandis que les organes génitaux féminins sont de couleur rose).
2. Anesthésier les rongeurs nouveau-nés par l'une des options suivantes: cryoanesthesia (immerger complètement l'animal dans la glace pendant 4 - 5 min ^18), l'injection (equitensine à 4 ml / kg) ¹⁹ ou par inhalation d'anesthésiques volatiles (isoflurane ²⁰ ou éther ^21). Confirm un plan adéquat de l'anesthésie par l'absence d'un réflexe de retrait de la patte.
3. Placez l'animal sur le banc, face ventrale vers le bas. Section de la partie rostrale de la tête coronaire avec un scalpel au niveau du bregma (visible à travers la peau et le crâne). Effectuez cette étape immédiatement après que l'animal est anesthésié.
4. Section du corps coronaire avec un scalpel dans les membres antérieurs.
5. Enlever la peau, les muscles, les tissus adipeux et viscère avec des ciseaux et des pinces chirurgicales et minces. Depuis os sont mous à cet âge, être prudent pour ne pas endommager le système nerveux. Effectuez cette étape sur le banc.
6. Placer la préparation dans la chambre de dissection. Utilisez la aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation. De ce point à la fin de l'enregistrement, utiliser un microscope.
7. Sur la face dorsale de la préparation, couper le crâne et les vertèbres de la rostrale à la partie caudale long de l'axe moyen avec des ciseaux et des pinces chirurgicales et minces. Ouvrez le crâne de coupeet vertèbres afin d'exposer le tissu nerveux. Utilisez la aCSF strored dans la seringue pour oxygéner la préparation.
8. Avec la pince, retirer l'arachnoïde, un tissu mince recouvrant la surface du tissu nerveux. Conserver la pie-mère et les vaisseaux sanguins contre le tissu nerveux. Utilisez la aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation.
9. Placer la préparation avec la dorsale face vers le bas, et soigneusement abattre le tronc cérébral et la moelle épinière en coupant les nerfs et du tissu conjonctif avec les ciseaux tout en maintenant la préparation en place. Une approche dorsale est également possible. Garder les racines et les nerfs aussi longtemps que possible. Retirez les os pour isoler le tronc cérébral et la moelle épinière. Utilisez la aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation.
10. Retirer le cervelet et le reste des structures rostrales en les sectionnant avec le scalpel. Utilisez le aCSF stockée dans l'aiguille pour oxygéner la préparation.
11. Eventuellement fonction sur expériconception tal, retirez le pont avec le scalpel par une section coronale antérieure à l'artère cérébelleuse inférieure ^22. Notez que le maintien de l'ensemble des pons va ralentir le rythme chez les rats et entièrement inhiber chez les souris. Les préparatifs qui ne comprennent que la partie caudale du pont affichent une activité respiratoire-like avec une fréquence stable à la racine de la C4.

3. Enregistrement

1. Placez la préparation dans la chambre d'enregistrement, ventrale face vers le haut. Fixer la préparation avec des épingles dans la partie inférieure de la moelle épinière et rostrale-plus partie du tronc cérébral.
2. En utilisant une seringue reliée à l'électrode par son aiguille, induire une dépression dans l'électrode (diamètre de la pointe de verre: de 150 à 225 um) en tirant sur le piston de la seringue, afin de combler partiellement l'électrode avec aCSF.
3. Utilisation d'un micromanipulateur, placer soigneusement l'électrode à proximité de l'un des quatrième racines ventrales. Autres racines ventrales peuvent aussi présenter une respiratoires comme l'activité (e.g., nerf crânien XII, C1 racine ventrale).
4. Provoquer une dépression dans le réservoir d'électrode via la seringue en tirant le piston afin d'aspirer délicatement le radicelles de nerf. Puis déplacez doucement l'électrode pour l'appliquer contre la moelle épinière.
   Remarque: Idéalement, la taille des radicelles correspond à la taille de l'ouverture de l'électrode et crée un joint d'étanchéité entre les compartiments interne et externe de l'électrode ainsi. Depuis amplificateurs différentiels sont couramment utilisés pour de tels enregistrements, toute ouverture entre l'intérieur de l'électrode et la chambre d'enregistrement réduit la qualité du signal et il est difficile d'éliminer les bruits de fond.
5. Commencez l'enregistrement.
6. Enregistrer le rythme produit par la préparation dans des conditions normoxiques (c.-à barboter avec du carbogène aCSF: 95% O ₂ et 5% CO ₂₎ pendant au moins 20 min afin de déterminer les paramètres de base de la préparation.
7. Mettez la perfusion de carbogène-barboter à aCSFaCSF stimulus (par exemple, par barbotage avec 95% de N ₂ et _5% de CO2 pendant l'hypoxie stimulus) pendant 15 min. Modifier la durée d'exposition en fonction du protocole expérimental. Consigner la durée de l'exposition sur l'enregistrement et animale fiche. Utilisation tubes en acier inoxydable entre la bouteille et le ACSF chambre chaque fois que possible pour éviter la diffusion de gaz vers l'extérieur du tube.
8. Mettez la perfusion retour à aCSF carbogène-barboter norme pendant au moins 15 minutes pour un enregistrement de récupération. Inscrire ce sur l'enregistrement et animale fiche.
9. Terminez l'enregistrement.

4. Analyse statistique

1. A partir du signal intégré, le calcul de la fréquence que le nombre de paquets par minute (exprimée en salves / min), l'amplitude de la différence entre la ligne de base et le pic de la salve (exprimée en mV), la durée de salve que la durée de du début à la fin de la salve (exprimé en s), la région d'éclatement comme l'aire sous la curve de la salve sur le signal intégré (exprimée en mV · s) (Figure 3).
2. Calculez la fréquence, l'amplitude, la durée et la zone éclater éclater sous normoxique (de base), hypoxique (stimulus) et post-hypoxiques conditions (post-stimulus) de récupération comme la moyenne des les 5 dernières minutes des enregistrements pour chaque condition. Ne pas analyser la première partie de chaque condition, car il ya un délai entre la commutation de la perfusion et aCSF homogénéisation dans la chambre d'enregistrement.
3. Exprimez puis stimulus (ie, l'hypoxie) et post-stimulus (ie, post-hypoxiques) valeurs de récupération en pourcentage des valeurs de référence pour l'enregistrement correspondant. Exprimer les résultats en tant que moyen ± SD

Résultats

Comme mentionné dans l'introduction, l'un des avantages les plus importants de cette technique est l'accès direct au tronc cérébral pour appliquer divers stimuli. A titre d'exemple, l'hypoxie a été appliqué ici. La Figure 1. AB affiche un enregistrement de protocole complète, avec les deux conditions normoxiques et hypoxiques. Figure 1.CE affiche le rythme enregistrés dans des conditions normoxiques (par exemple, aCSF barboter avec 95% O ₂

Discussion

Quantification précise de l'activité respiratoire peut être difficile. En effet, la respiration est une fonction qui peut être à la fois automatique et volontaire, et que est modulée en fonction de l'environnement, les besoins de l'organisme, l'état émotionnel et le comportement. L'avantage de cette technique est l'isolement des éléments neuronaux responsables de la production de la commande respiratoire. Ainsi, les enregistrements électrophysiologiques de préparations pléthysmograph...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	Use under hood
NaCl	Bioshop	SOD002
KCl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	SPM306
D-glucose	Bioshop	GLU501
Carbogen	Linde	343-02-0006
Temperature Controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Suction electrode	A-M Systems, Everett, WA, USA	model 573000
Differential AC amplifier	A-M Systems, Everett, WA, USA	model 1700
Moving averager	CWE, Ardmore, PA, USA	model MA-821
Data acquisition system	Dataq Instruments, Akron, OH, USA	model DI-720
LabChart software	ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware	Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber	Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber	Home made
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA	KITE-R
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	MINIPULS 3
Faraday Cage	Home made
Computer