Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Abstract

הרשתית היא מודל טוב למערכת העצבים המרכזית בפיתוח. הגודל הגדול של העין והכי חשוב הנגישות למניפולציות ניסוייות באובו / in vivo הופך את הרשתית העוברית עוף מודל ניסיוני רב-תכליתי ויעיל מאוד. למרות רשתית העוף קלה למקד באוב על ידי זריקות או electroporation התוך עיני, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים בתוך הרשתית עלול להיות קשה לשליטה מלאה. זה יכול להיות בגלל וריאציות של האתר המדויק הזרקה, דליפה מהעין או דיפוזיה אחידה של החומרים. יתר על כן, בתדירות של מומים ותמותה לאחר מניפולציות פולשנית כגון electroporation היא גבוהה למדי.

פרוטוקול זה מתאר לשעבר אובו הטכניקה לculturing explants רשתית שלם מעוברי עוף ומספק שיטה לחשיפה מבוקרת של הרשתית לחומרים כימיים. פרוטוcol מתאר כיצד לנתח, ניסוי לתפעל, וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. Explants יכול להיות מתורבת לכ 24 שעות ויהיה נתון למניפולציות שונות כגון electroporation. היתרונות העיקריים הם כי הניסוי אינו תלוי בהישרדות של העובר וכי הריכוז של המגיב הציג יכול להיות מגוון ומבוקר על מנת לקבוע ולייעל את הריכוז האפקטיבי. יתר על כן, הטכניקה היא מהירה, זולה ויחד עם השיעור הגבוה הניסיוני שלה להצלחה, הוא מבטיח לשחזור תוצאות. יודגש כי היא משמשת כמצוינת כדי להשלים את הניסויים שבוצעו באוב.

Introduction

הרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית ואת זה הוא, בפשטותה היחסית ואדריכלות סלולרית מאופיינת היטב, דגם פופולרי לחקר התפתחות מערכת עצבים מרכזית. עינו של עובר העוף היא יחסית גדולות בהשוואה לשאר העובר. לכן נגיש בקלות באובו למניפולציות ניסיוניות, כגון זריקות או electroporation, ומשמש ככלי מצוין לצבור ידע על תאים ברשתית וביולוגיה התפתחותית בvivo. למרות יתרונות הגדולים אלה, הישרדות של העוברים יכולה להיות נמוכה כאשר ניסויים פולשניים כגון עם electroporations, זריקות חוזרות ונשנות, או מניפולציות ניסיוניות משולבות.

Electroporation של פלסמידים DNA לעובר העוף באובו הוא טכניקה חשובה ומבוססת ^1. היא מאפשרת תיוג של תאי עצב, התחקות של גורל תא, כמו גם שטחים עצביים בnerv המרכזימערכת היחידות הארגוניות והיא מאפשרת לביטוי גנים מחוץ לרחם לנתח תפקוד חלבון in vivo. הטכניקה נוצלה בעבר ללימודים של צינור עצבי ^2, המוח האחורי ^3, ורשתית ^4. יש Electroporation של רשתית עוברית באוב כמה קשיים ניסיוניים הקשורים למצב in vivo. העמדה של העין, בשל קיפול הגולגולת של העובר, קרובה יחסית ללב. קרבה זו מגדילה את הסיכון של דום לב לאחר electroporation, והסיכון עולה עם גיל העובר. יתר על כן, כדי לגשת לעין, יש צורך לפתוח את הקרומים העובריים, ובכך להגדיל את הסיכון לדימום, מומים וכדאיות מופחתים שלאחר מכן. כאשר בודקים ואופטימיזציה פלסמיד דנ"א חדש לעתים קרובות ללא תוצאה פנוטיפי ידועה, מגבלות אלה עשויות להקטין את היעילות וכוחה של השיטה אפילו בניסויים מנוסים. כפי שהוצג בפרוטוקול זה, התרבות של wexplant החור ברשתית, שהוגדר כרשתית עצבית השלמה עם אפיתל הפיגמנט הוסר, הוא שיטה יעילה המשלימה בגישת אוב.

זריקות תוך עיניות של ריאגנטים כימיים קלות יחסית לביצוע באוב. עם זאת, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים שהוחדרו בתוך הרשתית העצבית עלול להיות קשה לשלוט באופן מלא. הנפח המוזרק עשוי להשתנות עקב דליפה ואתר הזרקה המדויק עשוי להשפיע הן על חלוקת מגיב בתוך העין ודיפוזיה דרך הגוף הזגוגי. ההשתנות תהיה השלכות משמעותיות על הפרשנות של התוצאות כאשר כלומר, עקומת תגובה למינון מעכב אנזים נקבעה; במיוחד אם ההשפעה היא קטנה והחלון הזמני של ההשפעה הוא צר. יתר על כן, רק עין אחת יכולה לשמש מכל עובר בעת ביצוע ניסויים באובו בשל השפעות מערכתיות פוטנציאליות דרך זרם הדםעל העין הנגדית. התאמת גיל היא חשובה כאשר לומדים פיתוח והשתנות בודדות בין מטופלים ועוברים בקרה עשויה להוביל לשונות ניסיוניות נוספות.

מסיבות אלה, לשעבר אוב שיטה המבוססת על explants רשתית מעוברי עוף פותח, שברשתית העצבית יכולה להיות חשופה למדים ובשליטת תנאי ניסוי במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי פותח על בסיס פרוטוקולים קודמים ^5-9. explants רשתית מבמה (רח ') 20 (ימים עובריים [E] 3) לst31 (E7) עוברי עופות נותחו, תרבותי וelectroporated עם ריכוז פלסמיד דנ"א מוגדר או שנחשפו למדיום המכיל ריכוז מוגדר של מגיב כימי. הפרוטוקול המובא כאן כבר מיושם בהצלחה בפרסומים האחרונים, באמצעות כמה ריאגנטים כימיים שונים, כולל רגולטורים של מסלול הנזק לדנ"א, כגון KU55933, SB 218,078, ומועצה לביטחון לאומי 109,555 דיטוsylate, ומחזור התא, כגון Cdk1 / 2 מעכב שלישי ^10,11.

Protocol

פרוטוקול זה מתבצע בהתאם להמלצות ב" המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של האגודה למחקר ברפואת עיניים וראייה ".

1. טיפול בביצה וגביית עיניים

1. אחסן ביצי ליבורנו הלבנות ב12-14 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע 1. אם זמין, להשתמש במקרר יין קירור לאחסון הביצים המופרות.
   הערה: טמפרטורות גבוהות חנות להוביל להתפתחות לא תקינה של עוברים, ואילו טמפרטורות נמוכות מגבירה תמותה. זמן אחסון מורחב מגדיל שני תמותה והתפתחות לא תקינה.
2. לדגור על הביצים ב37.5 מעלות צלזיוס ו -60% חממת ביצת humidified עם הנדנדה עדינה בתדירות של 5 פעמים בשעה 24.
3. הסר את הביצים מודגרות מן חממת הביצה בגיל העוברי הרצוי.
   הערה: גיל העובר העוף נקבע כזמן של דגירה והוא כונה כימים עובריים (E) או כשלבים (רח '), על פי הסדרה של שלבי התפתחות שתוארו על ידי המבורגר והמילטון ^12.
4. מניחים את הביצים שנבחרו בזרימה למינרית. נגב את קליפת הביצה עם 70% אתנול, כדי למנוע זיהום של העובר.
   הערה: ניהול כל ההליכים בתנאים אספטיים עם פתרונות סטרילי http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions ומכשירים.
5. הקש בצד של הביצה בתקיפות כנגד משטח קשה לפיצוח פתוח הביצה. הנח את התוכן בצלחת פטרי 100 מ"מ. השתמש בכפית קטנה להעביר את העובר לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה מראש חימם (37 ° C) 1x PBS כדי למנוע את הרקמות מייבוש.
6. מניחים את 35 מ"מ צלחת פטרי המכילה את הרקמה העוברית על מיקרוסקופ לנתח stereovision משקפת בזרימה למינרית. לערוף את העובר על ידי צובט את הצוואר עם מלקחיים עדינים וזורקים את הגוף.
7. שימוש במלקחיים בסדר לעשות חתך המחוספס הפה, הגחון לעין. החל באתר של חתך, קורע את הרקמות המקיפות את כל העין. לצבוט את עצב הראייה ולהסיר את העיניים בשלמות מארובת העין. לאסוף צד השמאל ועין ימין מאותו העובר לשימוש כמו גם השליטה או עין שטופלה.
8. השתמש בכפית קטנה להעביר את העיניים לצלחת חדשה 35 מ"מ פטרי המכילה מראש חימם (37 ° C) 1x PBS.

2. הכנת Explants הרשתית השלמה

1. שימוש במלקחיים עדינים כדי להסיר את כל הרקמה סביב העין כולל Anlage scleral.
   הערה: רקמת תנתק בקלות עוזבת את הרשתית על הגוף ועדשת הזגוגית עם אפיתל הפיגמנט (1A-B איור) ללא פגע.
2. שימוש במלקחיים עדינים לצבוט חתך קטן לאפיתל הפיגמנט בחלק הגב של העין ללא פגיעה ברשתית העצבית (איור 1 ג).
3. שימוש במלקחי קנס לקרוע בעדינות לפתוח את starti אפיתל הפיגמנטng באתר של חתך, ומשאירה את העדשה ואת כל הרשתית מחוברת לגוף הזגוגי (1D איור). שמור את העין בחם (37 מעלות צלזיוס) 1x PBS כדי להקל על הסרת האפיתל פיגמנט.
   הערה: אפיתל הפיגמנט עלול להיות קשה להסרת, בפרט לאורך גוף הריסים סביב התלמיד, באזור הקדמי של העין, ולאורך הבקע דמית העין. לכן, חלק מאפיתל הפיגמנט ניתן להשאיר על הרשתית העצבית (איור 1E-F).

3. טיפול בExplants הרשתית השלמה

1. Electroporation של explants רשתית השלם
   הערה: Electroporation של explants רשתית השלם יכול להתבצע מייד לאחר שלב 2.
   1. להכין מדיום תרבות המכיל 1: 1 DMEM: תערובת מזון F12, 10% FBS, 10 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, וL- גלוטמין 2 מ"מ.
   2. חותך את קובט פלסטיק חד פעמי של 1.5 מיליליטר (מ"מ 12.5 מ"מ x 12.5 x 45 מ 'מ ') (או כל מיכל קטן מסוגל להחזיק פתרון 300-400 μl) כ 8 מ"מ מהתחתית בעזרת מסור בסדר להב.
   3. לדלל את פלסמיד דנ"א של בחירה ב1xDPBS לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μl.
   4. הפעילו את הפרמטרים electroporator וסט 15 V לST20 - ST25 רשתית (E3-E4) ו -20 V לst26 - st27 רשתית (E5). הגדר את הדופק חוזר ל5 פולסים של 50 דופק באורך msec עם 1 מרווחי שניות. השתמש במחולל פעימות שיכולות להיות נשלט על ידי רגל דוושה על הרצפה כתהיינה צורך בשתי הידיים כדי להחזיק את האלקטרודות במקום.
   5. חבר (קוטר שטוח, עגול. 4 מ"מ) שתי ההנעה בצורת אלקטרודות פלטינה (איור 2 א) לשקע הפלט על מחולל את הדופק.
      הערה: אלקטרודות הפלטינה שימוש בפרוטוקול זה נעשו על ידי סדנת האוניברסיטה. אלקטרודות נעשו מ" rondelles "(כיתה פלטינה: 950 Pt / 5 Cu) צלחת פלטינה 0.1 מ"מ. Wi חיבור 0.8 מ"ממחדש היה מבודד באמצעות צינורות פלסטיק.
   6. להעביר בזהירות את כל explant הרשתית מצעד 2.3 לקובט (או מיכל קטן שווה ערך) בעזרת פיפטה פסטר פוליאתילן עם הקצה מנותק לרכוש את גודל טיפ-פתיחה הנכונה עבור explant הרשתית. הימנע משימוש בטיפי פיפטה כמו הרשתית נוטה לצרף לפלסטיק ולקרוע לגזרים.
   7. השתמש פיפטה 100 μl כדי להסיר בעדינות את כל 1x PBS המקיף את טיפול explant לוקח רשתית שלא לגעת ברשתית כדי למנוע את הקריעה.
   8. להוסיף פתרון פלסמיד 100 μl לקובט כדי לכסות את כל explant הרשתית. דחף בעדינות את explant הרשתית עם מלקחיים אם זה צף למעלה. שימוש במלקחיים או אלקטרודות למצב העדשה להתמודד עם כל צד אחד של קובט ועצב הראייה לחלק התחתון של קובט.
   9. מניחים את האלקטרודה החיובית מול העדשה והאלקטרודה השלילית מאחורי הרשתית (איור 2 א), בלי לגעת ברקמה.
   10. החל הנוכחי על ידי לחיצה הרגל על ​​הדוושה. בדקו בועות באלקטרודות המצביעות על שחרור מוצלח.
   11. השתמש פיפטה 100 μl כדי להסיר את כל תערובת פלסמיד מקובט ללא פגיעה ברשתית. תערובת פלסמיד ניתן לעשות שימוש חוזר שלושה עד חמש פעמים.
   12. למלא את קובט עם מחומם מראש (37 ° C) 1x PBS. שימוש במלקחיים כדי לנתק עדינות explant הרשתית מהקיר של קובט. לאחר electroporation הרשתית לעתים מכוסות בבועות, מה שהופך את לדבוק בקיר של קובט.
   13. השתמש בפיפטה פסטר פוליאתילן להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24-המכילה גם (37 מעלות צלזיוס) מדיום תרבות 1 מיליליטר מחומם מראש לכל טוב. דגירה explant רשתית אחד בכל טוב.
   14. דגירה explant הרשתית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל"ד, בתוך תא חממה עם 5% CO ₂ למשך 24 שעות. הסיבוב הוא להבטיח חשיפה המרבית לבינונית ולpreveהידבקות NT של הרשתית לחלק התחתון של צלחת 24 גם.
   15. המשך לשלב 4.
2. טיפול בexplants רשתית השלם עם ריאגנטים כימיים
   הערה: טיפול הכימי של explants רשתית השלם יכול להתבצע מייד לאחר שלב 2.
   1. להכין מדיום תרבות המכיל 1: 1 DMEM: תערובת מזון F12, 10% FBS, 10 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, וL- גלוטמין 2 מ"מ.
   2. השתמש בכפית קטנה להעביר explant הרשתית מצעד 2.3 לתוך צלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר מראש חימם בינונית (37 מעלות צלזיוס) תרבות לכל טוב. דגירה explant רשתית אחד בכל טוב.
   3. דגירה explant רשתית כל במשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל"ד, בתוך תא חממה עם 5% CO ₂ לפני הוספת מגיב כימי או רכב.
   4. הכן את הפתרון הכימי, למשל Cdk1 / 2 מעכב III, מעכב התקדמות M-שלב ^13, בגמרריכוז של 30 מיקרומטר בDMSO.
   5. הסר את צלחת 24 גם, המכיל את כל explant הרשתית, מן חממת התא. הוסף 10 μl של המגיב הכימי או הרכב (DMSO) ישירות למדיום הרשתית, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 300 ננומטר Cdk1 / 2 מעכב שלישי ב0.01% DMSO. באופן ידני לסובב את צלחת 24 גם כדי לאפשר חלוקה שווה של המגיב הכימי או רכב בפתרון.
   6. דגירה explants הרשתית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל"ד, בתוך חממה עם 5% CO ₂ לזמן הרצוי (עד 24 שעות).
   7. המשך לשלב 4.

4. קיבוע והקפאה של כל הפריטים הרשתית Eexplants

1. הסר את צלחת 24 היטב המכילה את explant רשתית כל מטופלים מן חממת התא.
2. השתמש בכפית קטנה להעביר explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם קר כקרח paraformaldehyde 4% ב1xPBS. אינקובטוריםטה על קרח במשך 15 דקות.
3. השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם 1xPBS הקרח הקר לשטוף את הרשתית. דגירה על קרח למשך 10 דקות.
4. השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם סוכרוז 30% קרים כקרח ב1xPBS. לדגור על קרח במשך 1-3 שעות, בהתאם ליום העוברי של הרשתית. לST20 - ST25 רשתית (E3), דגירה עבור שעה 1, רשתית מבוגרת זקוק לזמן דגירה ארוך יותר בסוכרוז.
5. השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית על סרט פרפין המכיל הרכבה בינונית כ -500 הקפאת cryostat μl. הסר ככל סוכרוז ככל האפשר על ידי בעדינות להזיז את explant הרשתית במדיום ההקפאה באמצעות הכפית הקטנה.
6. העבר את explant הרשתית לעובש הטבעה מכיל מדיום הקפאה. מקם את העיניים כדי להקל על חתך בעתיד. שים עובש ההטבעה מכיל את כל explant הרשתית על ד"רקרח y עד הבינוני קפוא מוצק. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה (איור 1 א-ו) וculturing של explants רשתית השלם מעוברי תרנגולת. פרוטוקול זה שמש בהצלחה לכל explants רשתית מעוברים של ST20 (E3) לst31 (E7).

Electroporation של פלסמידים DNA לתוך explants רשתית שלם מאפשר תיוג ומעקב של תאים ברשתית או בי?...

Discussion

בעבודה זו בפרוטוקול מפורט לנתיחה, electroporation או טיפול כימי, וculturing של explants רשתית השלם מעוברי עוף מוצג. פרוטוקול זה הוא קל, מהיר ומאפשר לשניהם שיעור הצלחה גבוה ושחזור תוצאות.

Electroporation של explants רשתית השלם מייצר שטחים גדולים של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm Petri dish	VWR	734-0006
100 μl pipette tips	VWR	613-0798
1.5 ml disposable plastic cuvette	Thomas Scientific	8495V01
24-well plate	Sigma Aldrich	D7039
35 mm Petri dish	VWR	391-1998
70% ethanol	Solveco	1054
Cdk1/2 inhibitor III	217714	Calbiochem	300 nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator	Thermo Forma
Dissecting microscope	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
Electrodes			Platina, custom made
Electro square porator ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Forceps	AgnThos	0108-5-PS
Freezing medium NEG50	Cellab, Sweden	6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
Insulin	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamine	Life Technologies	25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI	Life Technologies	P36935
Paraffin film	VWR	291-1214P
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold	Sigma Aldrich	E6032
Penicillin streptomycin	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Dilution 1/4,000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes	Sonidel	CUY700P4L	Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette	VWR	612-2853
Rotator shaker	VWR	444-2900
Small spoon	VWR	231-2151
Sucrose	VWR	443815S
White Leghorn eggs			Local supplier
Wine cooler	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany