Explants rétiniens entières de poulet embryons pour Traitements électroporation et réactif chimique

Résumé

Ce protocole décrit un procédé pour disséquer, expérimentalement et manipuler des explants de rétine entière de la culture d'embryons de poulet. Les cultures d'explants sont utiles lorsque le taux de réussite élevé, l'efficacité et la reproductibilité sont nécessaires pour tester les effets de plasmides pour l'électroporation et / ou des substances réactives, à savoir, les inhibiteurs enzymatiques.

Résumé

La rétine est un bon modèle pour le système nerveux central en développement. La grande taille de l'œil et surtout l'accessibilité pour les manipulations expérimentales in ovo / in vivo rend le poulet rétine embryonnaire un modèle expérimental polyvalent et très efficace. Bien que la rétine de poulet est facile à cibler in ovo par injections intra-oculaires ou l'électroporation, la concentration efficace et précise des réactifs au sein de la rétine peut être difficile de contrôler entièrement. Cela peut être dû à des variations de site d'injection exact, les fuites à partir de l'œil ou de diffusion irrégulière de ces substances. En outre, la fréquence de malformations et de mortalité après manipulations invasives telles que l'électroporation est plutôt élevé.

Ce protocole décrit un ex ovo technique pour la culture des explants de rétine entière à partir d'embryons de poulet et fournit un procédé pour contrôler l'exposition de la rétine à des réactifs. Le protocol décrit comment disséquer, expérimentalement manipuler et explants rétiniens culture entiers à partir d'embryons de poulet. Les explants peuvent être cultivées pendant environ 24 heures et être soumis à différentes manipulations telles que l'électroporation. Les principaux avantages sont que l'expérience ne dépend pas de la survie de l'embryon et que la concentration du réactif introduit on peut faire varier et contrôlé afin de déterminer et optimiser la concentration efficace. En outre, la technique est rapide, pas cher et, avec son taux de réussite expérimentale haute, il assure reproductible résultats. Il convient de souligner qu'il sert un excellent complément aux expériences réalisées in ovo.

Introduction

La rétine est une partie du système nerveux central et il est, avec sa relative simplicité et de l'architecture cellulaire bien caractérisée, un modèle populaire pour étudier le développement du système nerveux central. L'oeil de l'embryon de poulet est relativement grande en comparaison avec le reste de l'embryon. Il est donc facilement accessible in ovo à des manipulations expérimentales, telles que des injections ou l'électroporation, et sert un excellent outil pour acquérir des connaissances sur cellules rétiniennes et la biologie du développement in vivo. Malgré ces avantages majeurs, la survie des embryons peut être faible lorsque les expériences sont envahissantes comme avec électroporations, des injections répétées, ou des manipulations expérimentales combinées.

L'électroporation de plasmides d'ADN dans l'embryon de poulet in ovo est une technique importante et bien établie ^1. Il permet pour l'étiquetage des neurones, le traçage du destin cellulaire ainsi que voies neuronales dans la NERV centraleous système et il permet l'expression ectopique des gènes à analyser la fonction des protéines in vivo. La technique a été utilisée pour les études de tube neural ^2, Rhombencéphale ^{3, 4} et de la rétine. Électroporation de la rétine embryonnaire in ovo a quelques difficultés expérimentales qui sont liés à la situation in vivo. La position de l'oeil, en raison du pliage du crâne de l'embryon, est relativement proche du cœur. Cette proximité augmente le risque d'un arrêt cardiaque suivant l'électroporation, et le risque augmente avec l'âge de l'embryon. En outre, pour accéder à l'œil, il est nécessaire d'ouvrir les membranes embryonnaires, ce qui augmente le risque de saignement, des malformations et après la viabilité réduite. Lors de l'essai et l'optimisation d'un nouveau plasmide d'ADN souvent sans un résultat phénotypique connu, ces limitations peuvent diminuer l'efficacité et la puissance de la méthode, même pour un expérimentateur expérimenté. Tel que présenté dans ce protocole, la culture de la wexplant trou rétinien, définie comme la rétine neurale ensemble avec l'épithélium pigmentaire enlevée, est un procédé efficace qui complète l'approche en ovo.

Injections intraoculaires de réactifs chimiques sont relativement faciles à réaliser in ovo. Cependant, la concentration efficace et précise des réactifs injectés au sein de la rétine neurale peut être difficile de contrôler entièrement. Le volume injecté peut varier en raison de fuites et l'emplacement exact de l'injection peut affecter à la fois la distribution du réactif dans l'oeil et de la diffusion à travers le corps vitré. La variabilité aura des implications majeures pour l'interprétation des résultats lorsque ie, une courbe dose-réponse pour un inhibiteur de l'enzyme est déterminée; en particulier si l'effet est faible et la fenêtre temporelle de l'effet est étroite. En outre, un seul œil peut être utilisé à partir de chaque embryon lors de l'exécution dans des expériences in ovo en raison des effets potentiels systémiques par le biais du flux sanguinsur l'oeil controlatéral. Age appariement est important lorsque l'on étudie le développement et la variabilité individuelle entre traités et les embryons de contrôle peut conduire à la variabilité expérimentale supplémentaire.

Pour ces raisons, un procédé ex ovo basé sur des explants de rétine embryons de poulet a été développé, dans lequel la rétine neurale peut être exposé à un uniforme et contrôlée condition expérimentale in vitro. Le présent protocole a été développé sur la base de protocoles antérieurs ^5-9. Explants de rétine à partir de l'étape (st) 20 (jours embryonnaires [E] 3) à ST31 (E7) d'embryons de poulet ont été disséquées, cultivées et soumises à une électroporation avec une concentration d'ADN de plasmide défini ou exposées à un milieu contenant une concentration définie d'un réactif chimique. Le protocole présenté ici a été mis en œuvre avec succès dans des publications récentes, utilisant plusieurs réactifs chimiques différents, y compris les régulateurs de la voie de dommages à l'ADN, comme KU55933, SB 218078, et NSC 109555 ditosylate, et le cycle cellulaire, tel que Cdk1 / 2 ^10,11 inhibiteur III.

Protocole

Ce protocole est effectuée en conformité avec les recommandations dans le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie".

1. Manipulation des oeufs et de la collecte des yeux

1. Rangez les oeufs Leghorn blanche à 12-14 ° C pendant plus de 1 semaine. Si possible, utilisez un refroidisseur de vin réfrigéré pour stocker les œufs fécondés.
   Remarque: Des températures plus élevées des magasins conduisent à un développement anormal de l'embryon, alors que des températures plus basses augmente la mortalité. Temps de stockage étendu augmente à la fois la mortalité et le développement anormal.
2. Incuber les oeufs dans un 37,5 ° C et 60% incubateur humidifié avec doux balancement à une fréquence de 5 fois par 24 heures.
3. Retirer les oeufs incubés de l'incubateur d'œufs à l'âge embryonnaire souhaitée.
   Note: l'âge de l'embryon de poulet est déterminé que le temps d'incubation et est désignée par jour embryonnaire (E) ou comme des étapes (st), En fonction de la série de stades de développement décrits par Hamburger et Hamilton ^12.
4. Placez les oeufs sélectionnés dans la hotte à flux laminaire. Essuyez la coquille avec 70% d'éthanol pour éviter la contamination de l'embryon.
   Remarque: Effectuer toutes les procédures dans des conditions aseptiques avec des solutions stériles http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions et des instruments.
5. Appuyez sur le côté de l'oeuf fermement contre une surface dure pour en ouvrir l'œuf. Placer le contenu dans une boîte de Pétri de 100 mm. Utiliser une petite cuillère à transférer l'embryon dans une boîte de Petri de 35 mm contenant préchauffé (37 ° C) 1 x PBS pour empêcher le tissu de séchage.
6. Placez le plat de 35 mm de Pétri contenant le tissu embryonnaire sur un microscope binoculaire stéréoscopique de dissection dans la hotte à flux laminaire. Décapiter l'embryon en pinçant le cou avec une pince fine et jeter le corps.
7. Utilisez une pince fine de faire une incision erugueuse la bouche, ventrale à l'œil. À partir du site de l'incision, déchirer le tissu entourant l'œil entier. Pincez le nerf optique et enlever l'oeil intact de l'orbite de l'œil. Recueillir la fois la gauche et l'œil droit du même embryon pour une utilisation soit comme le contrôle ou l'oeil traité.
8. Utilisez une petite cuillère pour transférer les yeux à un nouveau plat de 35 mm de Pétri contenant préchauffé (37 ° C) 1x PBS.

2. Préparation de l'ensemble de la rétine explants

1. Utilisez des pinces fines pour enlever tous les tissus autour de l'œil, y compris l'ébauche scléral.
   Remarque: Le tissu se détache facilement en laissant la rétine sur le corps vitré et le cristallin de l'épithélium pigmentaire intacte (figure 1A-B).
2. Utilisez des pinces fines pour pincer une petite incision dans l'épithélium pigmentaire à la partie dorsale de l'œil sans endommager la rétine neurale (figure 1C).
3. Utilisez une pince fine à déchirer doucement pour ouvrir la starti de l'épithélium pigmentaireng au niveau du site de l'incision, en laissant la lentille et la rétine entière fixée sur le corps vitreux (figure 1D). Maintenir l'oeil à chaud (37 ° C) 1 x PBS pour faciliter l'élimination de l'épithélium pigmentaire.
   Remarque: L'épithélium pigmentaire peut être difficile à enlever, en particulier le long du corps ciliaire autour de la pupille, dans la région antérieure de l'oeil, et le long de la fissure de la choroïde. Par conséquent, une partie de l'épithélium pigmentaire peut être laissé sur la rétine neurale (figure 1E-F).

3. Traitement de l'ensemble de la rétine explants

1. L'électroporation des explants de rétine entière
   Note: L'électroporation des explants de rétine entière peut être réalisée directement après l'étape 2.
   1. Préparer un milieu de culture contenant de 1: 1 de DMEM: F12 mélange de nutriments, 10% de FBS, 10 U / ml de pénicilline streptomycine, 5 ug / ml d'insuline, et 2 mM de L-glutamine.
   2. Coupez une cuvette de 1,5 ml jetable en plastique (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (ou tout petit récipient capable de contenir solution 300-400 pi) environ 8 mm du fond à l'aide d'une scie à lame fine.
   3. Diluer le plasmide d'ADN de choix dans 1xDPBS à une concentration finale de 0,1 pg / pl.
   4. Activer les paramètres de réglage et électroporateur à 15 V pour ST20 - ST25 (E3-E4) et la rétine 20 V pour ST26 - ST27 (E5) rétine. Définissez les impulsions répétitions à 5 impulsions de 50 ms longueur d'impulsion avec 1 seconde d'intervalle. Utilisez un générateur d'impulsions qui peut être contrôlé par une pédale sur le sol comme deux mains seront nécessaires pour maintenir les électrodes en place.
   5. Connectez deux paddle en forme (plat, diam circulaire. 4 mm) électrodes de platine (figure 2A) à la prise de sortie sur le générateur d'impulsions.
      Remarque: Les électrodes de platine utilisées dans ce protocole ont été faites par l'atelier de l'université. Les électrodes ont été fabriqués à partir de plaque de platine de 0,1 mm "rondelles" (grade de platine: 950 Pt / 5 Cu). Le raccordement 0,8 mm wire a été isolé en utilisant des tubes en plastique.
   6. Soigneusement transférer l'ensemble expiant rétine de l'étape 2.3 de la cuvette (ou petit récipient équivalent) à l'aide d'une pipette Pasteur en polyéthylène avec le bout coupé à acquérir la bonne taille tip-ouverture pour l'expiant rétinienne. Évitez d'utiliser des embouts de pipette que la rétine tend à attacher à la plastique et déchirer.
   7. Utiliser une pipette de 100 pi pour enlever délicatement l'ensemble 1x PBS entourant la rétine en prenant garde de ne pas toucher expiant la rétine pour éviter de déchirer.
   8. Ajouter la solution de plasmide de 100 ul de la cuvette pour couvrir l'ensemble explant rétinienne. Appuyez doucement sur l'explantation de la rétine avec une pince si elle remonte à la surface. Utiliser des pinces ou des électrodes pour positionner la lentille pour faire face à tout un côté de la cuvette et le nerf optique au fond de la cuvette.
   9. Placer l'électrode positive en avant de la lentille et l'électrode négative derrière la rétine (figure 2A), sans toucher le tissu.
   10. Appliquer le courant en appuyant sur la pédale. Vérifiez bulles au niveau des électrodes indiquant acquitter avec succès.
   11. Utiliser une pipette de 100 pi pour enlever toute la composition de plasmide à partir de la cuvette sans endommager la rétine. Le mélange de plasmide peut être réutilisé trois à cinq fois.
   12. Remplir la cuvette avec préchauffé (37 ° C) 1x PBS. Utiliser des pinces pour détacher doucement l'expiant de la rétine à partir de la paroi de la cuvette. Après électroporation de la rétine est parfois recouverte de bulles, ce qui fait adhérer à la paroi de la cuvette.
   13. Utilisez la pipette polyéthylène Pasteur de transférer la totalité de la rétine explant dans une plaque de 24 puits contenant 1 ml préchauffé (37 ° C) milieu de culture par puits. Incuber une explantation de la rétine par puits.
   14. Incuber l'expiant de la rétine à 37 ° C sur un agitateur rotateur, avec une vitesse constante de 50 tours par minute, à l'intérieur d'un incubateur de cellules avec _5% de CO2 pendant 24 heures. La rotation est d'assurer une exposition maximale à moyen et à prevent adhérence de la rétine au fond de la plaque à 24 puits.
   15. Passez à l'étape 4.
2. Le traitement des explants de rétine entières avec des réactifs chimiques
   Remarque: Le traitement chimique des explants de rétine entière peut être réalisée directement après l'étape 2.
   1. Préparer un milieu de culture contenant de 1: 1 de DMEM: F12 mélange de nutriments, 10% de FBS, 10 U / ml de pénicilline streptomycine, 5 ug / ml d'insuline, et 2 mM de L-glutamine.
   2. Utilisez une petite cuillère pour transférer l'expiant de la rétine de l'étape 2.3 dans une plaque de 24 puits contenant 1 ml de pré-chauffé (37 ° C) milieu de culture par puits. Incuber une explantation de la rétine par puits.
   3. Incuber l'ensemble explant rétinienne pendant 60 min à 37 ° C sur un agitateur rotateur, avec une vitesse constante de 50 tours par minute, à l'intérieur d'un incubateur de cellules avec 5% de CO ₂ avant l'ajout d'un réactif chimique ou d'un véhicule.
   4. Préparer la solution chimique, par exemple Cdk1 / 2 inhibiteur III, un inhibiteur de la progression de phase ^M-13, à une finaleconcentration de 30 uM dans du DMSO.
   5. Retirer la plaque de 24 puits, contenant l'ensemble explantation de la rétine, de l'incubateur de cellules. Ajouter 10 ul du réactif chimique ou le véhicule (DMSO) directement au milieu de la rétine, ce qui entraîne une concentration finale de 300 nM Cdk1 / 2 inhibiteur III dans 0,01% de DMSO. Faire tourner manuellement la plaque à 24 puits pour permettre une distribution uniforme du réactif chimique ou d'un véhicule dans la solution.
   6. Incuber les explants de rétine à 37 ° C sur un agitateur rotateur, avec une vitesse constante de 50 tours par minute, à l'intérieur d'un incubateur avec 5% de CO ₂ pendant la durée souhaitée (jusqu'à 24 h).
   7. Passez à l'étape 4.

4. Fixation et congélation plénier rétine Eexplants

1. Retirer la plaque à 24 puits contenant la totalité de la rétine traitée explant de l'incubateur de cellules.
2. Utilisez une petite cuillère pour transférer l'expiant rétinienne à une plaque de 24 puits contenant 1 ml / puits glacé 4% de paraformaldehyde dans 1xPBS. Incubate sur de la glace pendant 15 min.
3. Utilisez une petite cuillère de transférer la totalité de la rétine expiant à une plaque de 24 puits contenant 1 ml / puits 1xPBS froid glace pour laver la rétine. Incuber sur de la glace pendant 10 min.
4. Utilisez une petite cuillère de transférer la totalité de la rétine expiant à une plaque de 24 puits contenant 1 ml / bien glacée de saccharose à 30% en 1xPBS. Incuber sur glace pendant 1-3 heures selon le jour embryonnaire de la rétine. Pour ST20 - ST25 (E3) rétines, incuber pendant 1 h, rétines âgées ont besoin de plus de temps d'incubation en saccharose.
5. Utilisez une petite cuillère de transférer la totalité de la rétine explant sur un film de paraffine contenant environ 500 pi cryostat congélation milieu de montage. Retirez autant de saccharose que possible en déplaçant doucement l'expiant de la rétine dans le milieu de congélation en utilisant la petite cuillère.
6. Transférer l'expiant rétine à un moule contenant intégration milieu de congélation. Positionnez l'œil pour faciliter le sectionnement avenir. Mettez le moule enrobage contenant l'ensemble expiant rétinienne sur dry de la glace jusqu'à ce que le milieu est gelé. Conserver à -80 ° C.

Résultats

Ce protocole décrit la préparation (figure 1A-F) et mise en culture des explants de rétine entière à partir d'embryons de poulet. Ce protocole a été utilisé avec succès pour explants entiers de la rétine à partir d'embryons de ST20 (E3) à ST31 (E7).

Électroporation de plasmides d'ADN dans des explants rétiniens entiers permet l'étiquetage et la traçabilité des cellules souches rétiniennes ou sur-expression de différents produits de gènes. ...

Discussion

Dans ce travail, un protocole détaillé pour la dissection, l'électroporation ou traitement chimique, et la culture des explants rétiniens entiers à partir d'embryons de poulet est présenté. Ce protocole est simple, rapide et permet à la fois un taux de réussite élevé et reproductible résultats.

L'électroporation des explants de rétine entière produit de grandes zones de cellules qui expriment le produit d'assemblage de gène d'intérêt. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm Petri dish	VWR	734-0006
100 μl pipette tips	VWR	613-0798
1.5 ml disposable plastic cuvette	Thomas Scientific	8495V01
24-well plate	Sigma Aldrich	D7039
35 mm Petri dish	VWR	391-1998
70% ethanol	Solveco	1054
Cdk1/2 inhibitor III	217714	Calbiochem	300 nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator	Thermo Forma
Dissecting microscope	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
Electrodes			Platina, custom made
Electro square porator ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Forceps	AgnThos	0108-5-PS
Freezing medium NEG50	Cellab, Sweden	6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
Insulin	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamine	Life Technologies	25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI	Life Technologies	P36935
Paraffin film	VWR	291-1214P
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold	Sigma Aldrich	E6032
Penicillin streptomycin	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Dilution 1/4,000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes	Sonidel	CUY700P4L	Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette	VWR	612-2853
Rotator shaker	VWR	444-2900
Small spoon	VWR	231-2151
Sucrose	VWR	443815S
White Leghorn eggs			Local supplier
Wine cooler	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany