Целые сетчатки Экспланты из куриных эмбрионах для обработок Электропорация и химического реагента

Резюме

Этот протокол описывает метод препарировать, экспериментально манипулировать и культура целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Эксплантата культуры полезны, когда высокий уровень успеха, эффективность и воспроизводимость необходимы, чтобы проверить эффекты плазмид для электропорации и / или реагентов веществ, т.е., ферментативных ингибиторов.

Аннотация

Сетчатка является хорошей моделью для развития центральной нервной системы. Большой размер глаза и, самое главное доступность для экспериментальных манипуляций в яйце / в естественных условиях составляет куриный эмбриональный сетчатки универсальным и очень эффективным экспериментальной модели. Несмотря на то, сетчатке цыпленка легко цели в яйце по внутриглазных инъекций или электропорации, эффективное и точное концентрация реагентов в сетчатке может быть трудно полностью контролировать. Это может быть из-за вариаций точного места инъекции, утечки из глаза или неровной диффузии веществ. Кроме того, частота пороков развития и смертности после инвазивных манипуляций, таких как электропорация достаточно высока.

Этот протокол описывает экс ово техники для культивирования целые эксплантатов сетчатки из куриных эмбрионах и обеспечивает способ контролированной экспозиции сетчатки к реагентам. Протокол описывает, как препарировать, экспериментально манипулировать, и культура целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Эксплантаты можно культивировать в течение примерно 24 ч и подвергают различным манипуляций, таких как электропорация. Основные преимущества в том, что эксперимент не зависит от выживания эмбриона и что концентрация вводимого реагента в можно варьировать и контролировать, чтобы определить и оптимизировать эффективную концентрацию. Кроме того, метод является быстрым, дешевым и вместе с его высокой скоростью успеха экспериментальной, она обеспечивает воспроизводимость Результаты. Следует особо подчеркнуть, что он служит в качестве отличным дополнением к экспериментов, проведенных в яйце.

Введение

Сетчатка является частью центральной нервной системы, и это, с его относительной простотой и хорошо характеризуется сотовой архитектуры, популярной модели для изучения развития центральной нервной системы. Глаз эмбриона курицы является относительно большим по сравнению с остальной частью эмбриона. Поэтому легко доступны в яйце для экспериментальных манипуляций, таких как инъекции или электропорации, и служит отличным инструментом для получения знаний о клетке сетчатки и биологии развития в естественных условиях. Несмотря на эти основные преимущества, выживание эмбрионов может быть низким, когда эксперименты являются инвазивными, такие как с electroporations, повторных инъекций, или в сочетании экспериментальных манипуляций.

Электропорация плазмид ДНК в курином эмбрионе в яйце является важным и хорошо создана методика ^1. Это позволяет для маркировки нейронов, отслеживание судьбы клеток, а также нервных путей в центральной NERVПодразделения системы, и это позволяет внематочной экспрессии генов для анализа функции белка в естественных условиях. Методика была использована для изучения нервной трубки ^{2, 3} заднего мозга, и сетчатки ^4. Электропорация эмбрионального сетчатки в яйце есть некоторые экспериментальные трудности, связанные с в естественных условиях ситуации. Положение глаз, из-за черепно-мозговой складывания эмбриона, находится относительно близко к сердцу. Эта близость повышает риск сердечного приступа следующий электропорации, и риск увеличивается с возрастом эмбрионов. Кроме того, для доступа к глаз, необходимо открыть эмбриональных мембран, тем самым увеличивая риск кровотечения, пороков развития и последующего снижения жизнеспособности. При тестировании и оптимизации новой плазмиды ДНК часто без известной фенотипической исхода, эти ограничения могут снизить эффективность и силу метода даже для опытного экспериментатора. Как представлено в настоящем протоколе, культуры шдыры сетчатки эксплантов, определяется как весь нервной сетчатки с пигментным эпителием удаляется, является эффективным методом, который дополняет в ово подхода.

Интраокулярные инъекции химических реагентов относительно легко выполнить в яйце. Тем не менее, эффективное и точное содержание вводимых реагентов в нейронном сетчатки может быть трудно полностью контролировать. Вводимый объем может изменяться из-за утечки и точное место инъекции может повлиять как на распределение реагента в глаза и распространение через стекловидное тело. Изменчивость будет иметь серьезные последствия для интерпретации результатов при т.е. кривая доза-ответ для ингибитора фермента определяется; в частности, если эффект мал и временного окна эффекта является узким. Кроме того, только один глаз может быть использовано от каждого эмбриона при выполнении экспериментов в ово-за возможных системных эффектов через кровьна противоположной глаза. Возраст соответствия важно при изучении развития и индивидуальную изменчивость между лечение и контрольных эмбрионов может привести к дополнительной экспериментальной изменчивости.

По этим причинам, экс ово методом, основанным на эксплантатов сетчатки от куриных эмбрионах был разработан, в которой нейронные сетчатки могут быть подвержены равномерной и контролируемых экспериментальных условий в пробирке. Настоящий Протокол был разработан на основе предыдущих протоколов ^5-9. Эксплантатов сетчатки от стадии (й) 20 (эмбриональные дней [E] 3) ST31 (Е7) куриных эмбрионов иссекали, культивируют и электропорации с определенной концентрации плазмидной ДНК или подвергается среде, содержащей определенное концентрации химического реагента. Протокол, представленные здесь была успешно реализована в последних публикациях, используя несколько различных химических реагентов, в том числе регуляторов повреждения ДНК пути, такие, как KU55933, SB 218078 и 109555 Дито НСКsylate и клеточный цикл, таких как Cdk1 / 2 ингибитора III ^10,11.

протокол

Этот протокол выполняется в соответствии с рекомендациями в "Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Ассоциации по исследованиям в видении и офтальмологии".

1. Яйцо Обращение и сбор глаз

1. Храните белые Ливорно яйца на 12-14 ° С в течение не более чем 1 недели. Если возможно, используйте охлажденный винный кулер для хранения оплодотворенных яиц.
   Примечание: Более высокие температуры магазин привести к неправильному развитию эмбриона, в то время как более низкие температуры увеличивает смертность. Длительное время хранения увеличивает как смертность и аномалии развития.
2. Выдержите яйца в 37,5 ° C и 60% влажности яйца инкубатора с нежным качалки на частоте 5 раз в 24 часа.
3. Снимите инкубационных яиц из яиц инкубатор в желаемом эмбрионального возраста.
   Примечание: возраст эмбриона курицы определяется как время инкубации и обозначается как эмбриональные дней (Е) или стадии (ST), В соответствии с серией стадий развития, описанных гамбургер и Гамильтон ^12.
4. Поместите выбранный яйца в капюшоне ламинарного потока. Протрите яичную скорлупу с 70% этанола, чтобы избежать загрязнения эмбриона.
   Примечание: Провести все процедуры в асептических условиях с стерильных растворов http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions и инструменты.
5. Нажмите на сторону яйца категорически против твердой поверхности, чтобы взломать яйцо. Поместите содержимое в 100 мм чашки Петри. Используйте маленькую ложку, чтобы передать зародыш в 35 мм чашки Петри, содержащей подогретого (37 ° C) 1x PBS, чтобы предотвратить ткани от высыхания.
6. Поместите 35 мм чашки Петри, содержащую эмбриональную ткань на бинокулярного микроскопа StereoVision рассекает в капюшоне ламинарного потока. Обезглавьте эмбрион, зажимая шею тонким пинцетом и выбросить тело.
7. Используйте тонкий пинцет, чтобы сделать надрез йгрубая рот, брюшной глаза. Начиная с сайта разреза, разорвать ткань, окружающую весь глаз. Повышение от зрительного нерва и снимите неповрежденный глаз от глазницы. Сбор и левый, и правый глаз из той же эмбриона для использования в качестве либо управления или очищенных глаз.
8. Используйте маленькую ложку, чтобы передать глаза на новый 35 мм чашки Петри, содержащей подогретого (37 ° C) 1x PBS.

2. Подготовка всей сетчатки эксплантов

1. Используйте тонкий пинцет, чтобы удалить все ткани вокруг глаз, включая склеры зачатка.
   Примечание: ткань будет отсоединить легко оставив сетчатки на стекловидного тела и хрусталика с пигментным эпителием нетронутыми (1А-Б).
2. Используйте тонкий пинцет, чтобы зажать небольшой разрез в пигментного эпителия в спинной части глаза, не повреждая нервной сетчатки (рис 1в).
3. Используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно разорвать пигментного эпителия ЗАПУСКнг на месте разреза, в результате чего линзы и весь сетчатки, прикрепленный к стекловидного тела (рис 1D). Держать глаз в теплой (37 ° С) 1x PBS, чтобы облегчить удаление пигментного эпителия.
   Примечание: пигментный эпителий может быть трудно удалить, в частности вдоль цилиарного тела вокруг зрачка, в передней части глаза, и вдоль сосудистой борозды. Таким образом, некоторые из пигментного эпителия могут быть оставлены на нервной сетчатки (рис 1E-F).

3. Обработка целых сетчатки эксплантов

1. Электропорация целых сетчатки эксплантов
   Примечание: Электропорация целых сетчатки эксплантов может быть выполнена непосредственно после шага 2.
   1. Подготовьте культуральную среду, содержащую 1: 1 DMEM F12: питательная смесь, 10% FBS, 10 ед / мл пенициллина, стрептомицина 5 мкг / мл инсулина, и 2 мМ L-глутамина.
   2. Отрежьте 1,5 мл одноразовый пластиковый кювету (12,5 мм х 12,5 мм х 45 мм) (или любой маленький контейнер способен удерживать 300-400 мкл раствора) примерно 8 мм от нижней с помощью тонкой лезвием пилы.
   3. Развести плазмидной ДНК выбора в 1xDPBS до конечной концентрации 0,1 мкг / мкл.
   4. Включите электропоратора и заданными параметрами до 15 В для ST20 - ST25 (Е3-Е4) сетчатка и 20 В для ST26 - ST27 (E5) сетчатки. Установите импульсно-повторы до 5 импульсов 50 мс импульса длины с 1 секундными интервалами. Используйте генератор импульсов, что можно управлять с помощью ножной педали на полу, как обе руки будут необходимы, чтобы держать электроды в месте.
   5. Подключите два весла формы (плоские, круговые диам. 4 мм) платиновых электродов (рис 2а) к выходному разъему на генератор импульсов.
      Примечание: платиновые электроды, используемые в настоящем протоколе были сделаны университета мастерской. Электроды были изготовлены из 0,1 мм платины плиты "rondelles" (платина сорта: 950 Pt / Cu 5). Соединительный 0,8 мм WiRe была изолирована с помощью пластиковых трубок.
   6. Тщательно передать весь сетчатки эксплантов с шага 2.3 в кювете (или эквивалентного небольшой контейнер) с использованием полиэтиленовой пипетки Пастера с наконечником отрезаны приобрести правильный размер кончика открытия для сетчатки эксплантов. Избегайте использования наконечников, как сетчатка имеет тенденцию приложить к пластике и разорвать.
   7. Используйте 100 мкл пипетки, чтобы аккуратно удалить всю 1x PBS вокруг сетчатки эксплантов, стараясь не прикасаться к сетчатку, чтобы избежать разрывов.
   8. Добавить 100 мкл раствора плазмиды в кювету, чтобы покрыть всю сетчатки эксплантов. Аккуратно надавите сетчатки эксплантов щипцами, если он всплывает на поверхность. Использование щипцов или электродов для позиционирования линзы к любым одну сторону кюветы и зрительного нерва на дно кюветы.
   9. Поместите положительного электрода в передней части объектива и отрицательным электродом за сетчаткой (фиг.2А), не прикасаясь к ткани.
   10. Применить ток, нажав ножной педали. Проверьте наличие пузырьков на электродах, указывающих успешный разряд.
   11. Использование 100 мкл пипетки, чтобы удалить все плазмиды смесь из кюветы без повреждения сетчатки. Плазмида смесь можно использовать повторно от трех до пяти раз.
   12. Заполните кювету с подогретого (37 ° C) 1x PBS. Используйте пинцет, чтобы аккуратно отсоединить сетчатки эксплантов от стенки кюветы. После электропорации сетчатки иногда покрыты пузырьков, что делает его придерживаться стенку кюветы.
   13. Использование полиэтилена пипетки Пастера, чтобы передать весь сетчатки эксплантов в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл предварительно нагретого (37 ° С) культуральной среды на лунку. Выдержите один сетчатки эксплантов на лунку.
   14. Инкубируйте сетчатки эксплантов при 37 ° С на шейкере вращающей, с постоянной скоростью 50 оборотов в минуту, внутри клеток инкубаторе с _5% CO 2 в течение 24 часов. Вращение является обеспечение максимального воздействия на среду и Превент адгезия сетчатки к нижней части пластины 24-луночного.
   15. Перейдите к шагу 4.
2. Обработка целых эксплантатов сетчатки химическими реагентами
   Примечание: Химическая обработка целых сетчатки эксплантов может быть выполнена непосредственно после шага 2.
   1. Подготовьте культуральную среду, содержащую 1: 1 DMEM F12: питательная смесь, 10% FBS, 10 ед / мл пенициллина, стрептомицина 5 мкг / мл инсулина, и 2 мМ L-глутамина.
   2. С помощью небольшой ложкой, чтобы передать сетчатки эксплантов с шага 2.3 в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл предварительно нагретого (37 ° С) культуральной среды на лунку. Выдержите один сетчатки эксплантов на лунку.
   3. Инкубируют всю сетчатки эксплантов в течение 60 мин при 37 ° С на шейкере вращающей, с постоянной скоростью 50 оборотов в минуту, внутри клеток инкубаторе с 5% CO ₂ перед добавлением химического реагента или транспортное средство.
   4. Подготовка химического раствора, например Cdk1 / 2 ингибитора III, ингибитор М-фазы прогрессии ^13, в конечнойКонцентрация 30 мкМ в ДМСО.
   5. Удалить пластину 24-луночный, содержащий всю сетчатки эксплантов, из клеточной инкубаторе. Добавить 10 мкл химического реагента или транспортного средства (ДМСО) непосредственно на сетчатке среды, в результате чего в конечной концентрации 300 нМ Cdk1 / 2 ингибитора III в 0,01% ДМСО. Вручную повернуть пластину 24-луночный для обеспечения равномерного распределения химического реагента или транспортного средства в растворе.
   6. Инкубируйте эксплантатов сетчатки при 37 ° С на шейкере вращающей, с постоянной скоростью 50 оборотов в минуту, в инкубаторе с _5% CO 2 в течение требуемого времени (до 24 ч).
   7. Перейдите к шагу 4.

4. Фиксация и замораживание всей сетчатки Eexplants

1. Извлеките 24-луночный планшет, содержащий обработанный весь сетчатки эксплантов из клеточной инкубаторе.
2. С помощью небольшой ложкой, чтобы передать сетчатки эксплантов на 24-луночный планшет, содержащий 1 мл / лунку ледяной 4% параформальдегидом в 1xPBS. Инкубаторыте на льду в течение 15 мин.
3. С помощью небольшой ложкой, чтобы передать всю сетчатки эксплантов на 24-луночный планшет, содержащий 1 мл / лунку ледяные 1xPBS мыть сетчатки. Инкубируют на льду в течение 10 мин.
4. С помощью небольшой ложкой, чтобы передать всю сетчатки эксплантов на 24-луночный планшет, содержащий 1 мл / лунку ледяной 30% сахарозы в 1xPBS. Инкубируют на льду в течение 1-3 ч в зависимости от дневных эмбрионов сетчатки. Для ST20 - ST25 (E3) сетчатки, инкубируют в течение 1 часа, пожилые сетчатки нужно больше времени инкубации в сахарозе.
5. Используйте маленькую ложку, чтобы передать всю сетчатки эксплантов на парафиновой пленки, содержащей примерно 500 мкл криостат замерзания монтажную среду. Удалить столько сахарозы, как это возможно, осторожно перемещая сетчатки эксплантов в морозильной среды с помощью небольшого ложку.
6. Передача сетчатки эксплантов до вложения формы, содержащей замораживание среду. Расположите глаза с целью облегчить будущую секционирования. Поставьте вложение формы, содержащий всю сетчатки эксплантов на ДРу льду до среды замерзла. Хранить при -80 ° С.

Результаты

Этот протокол описывает подготовку (1А-F) и культивирование целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Этот протокол был успешно использован для целых сетчатки эксплантов из эмбрионов ST20 (E3) в ST31 (E7).

Электропорация плазмид ДНК в целом сетчатки эксплантов по...

Обсуждение

В этой работе подробно протокол для вскрытия, электропорации или химической обработки, и культивирования целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах представлена. Этот протокол является простым, быстрым и позволяет как для высокой скорости успеха и воспроизводимость Ре...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm Petri dish	VWR	734-0006
100 μl pipette tips	VWR	613-0798
1.5 ml disposable plastic cuvette	Thomas Scientific	8495V01
24-well plate	Sigma Aldrich	D7039
35 mm Petri dish	VWR	391-1998
70% ethanol	Solveco	1054
Cdk1/2 inhibitor III	217714	Calbiochem	300 nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator	Thermo Forma
Dissecting microscope	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
Electrodes			Platina, custom made
Electro square porator ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Forceps	AgnThos	0108-5-PS
Freezing medium NEG50	Cellab, Sweden	6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
Insulin	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamine	Life Technologies	25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI	Life Technologies	P36935
Paraffin film	VWR	291-1214P
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold	Sigma Aldrich	E6032
Penicillin streptomycin	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Dilution 1/4,000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes	Sonidel	CUY700P4L	Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette	VWR	612-2853
Rotator shaker	VWR	444-2900
Small spoon	VWR	231-2151
Sucrose	VWR	443815S
White Leghorn eggs			Local supplier
Wine cooler	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany