כימות התנהגות שחי דגים בתגובה לחשיפה אקוטית של נחושת מהימית באמצעות וידאו בסיוע מחשב דיגיטלי ניתוח תמונה

Summary

מדידת ההשפעות של מזהמים סביבתיים על התנהגות הדגים הוא לעתים קרובות סובייקטיבי מאתגר במיוחד כשדנים נקודות קצה sublethal. אנו מתארים שיטות כוללות טכנולוגיית וידאו לכמת התנהגות שחייה של חדקן הלבן בשלב מוקדם בחיים (חדקן transmontanus) במהלך ואחרי 96 חשיפות hr אקוטיות לריכוזים שונים של נחושת.

Abstract

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.

Introduction

ההבנה כיצד חשיפה מזהמת יכולה להשפיע על ההתנהגות היא בזמנים מאוד מאתגרת וסובייקטיביים. התנהגות מוגדרת בדרך כלל כסדרה של פעילות גלויה, נצפה, כל גוף הפועלות דרך מערכת העצבים המרכזית ולאפשר אורגניזם לשרוד, לגדול, להתרבות. שינויים בהתנהגות עקב חשיפת toxicant הם בין המדדים הרגישים ביותר של לחץ סביבתי לעתים קרובות בין 10-100 פעמים יותר רגיש בהשוואת הישרדות ^1. רוב המחקרים אלו בדקו שחי פעילות, אוורור, ומחפש מזון התנהגות של ^2,3,4 דג. ברכת פעילות היא הנקודה הסופית sublethal הנפוצה ביותר בשימוש בקביעת שינוי התנהגותי בתגובה מזהם בדיקות רעילות ^5. משתנה שחי לכלול את התדירות ומשך תנועה, מהירות ומרחק נסע, תדירות זווית של פונה, עמדה בעמודת המים ואת התבנית של שחייה. פעילות שחייה היאאמצעי יעיל של התנהגות שחייה בעת הערכת רגישות על toxicant מבוסס על הקריטריונים המוצעים בפרק 9 על ידי ראנד ⁶ יסודות בספר טוקסיקולוגיה Aquatic.

מאמר זה מציג מחקר טוקסיקולוגי כדוגמא כיצד הרעיל של נחושת כדי חדקן לבן חיים בשלב מוקדם (transmontanus חדקן) בשלבים שונים של התפתחות המוקדמת במים בלבד חשיפות ביחס חדקן התנהגות שחייה הוערכה ומדגים שיטות לכימות שחיה הִתְנַהֲגוּת.

במחקרים קודמים, תגובות התנהגותיות שליליות ניכרו עם התחלה מוקדמת במהלך הימים הראשונים של חשיפות חריפות וכרוניות לנחושת והפכו בהדרגה חמורה יותר על משך חשיפה ^7,8,9 ריכוז. עוצמת והעיתוי של תחילת תגובות התנהגותיות אלה צפויים מספיק להגביל להישרדות ארוכת טווח ולכן הם בעלי עניין בהתחשב השלכות על recruitment כישלון ^10. כדי לפרש את המשמעות מדויקת של רגישות זו לשיטות חשיפה למתכות ונהלים פותחו לכימות את מהלך הזמן וההיקף של ליקויי התנהגותי ביחס לריכוזים נחושים.

פרוטוקולי מבחן לתפקוד והתפתחות התנהגותית הוקמו על ידי ניתוח דגימות וידאו תקורה של חידקן בתאי חשיפה. דגימות הווידאו ניתנות הערכה איכותנית של התפתחות ותפקוד בקרב טיפולים נחושים לאורך כל תקופת החשיפה. התנהגות ופעילות מחסה שוחרת הוערכה במהלך חשיפות לריכוזים נחושים מימיים כדי לקבוע את הזמן כדי להשפיע וכדי לאפיין את הרצף הזמני של ליקוי משפיע ומחפשים מקלט, עייפות, ברכת קואורדינציה, שיווי משקל, ונשימה. בנוסף, הקלטות וידאו היו עשויים חדקן subsampled מכל לשכפל לצורך המתעדים acti שחייה ספונטנית כמותיתvity. נקודות קצה אלה כללו מדידות של משך או את המשך הזמן נע, שוחה מהירה ומרחק נסעו ^5,11 באמצעות חבילת תוכנה לניתוח תמונה דיגיטלית זמינה מסחרי. תוכנה זו מגדירה את קווי המתאר של כל תמונה בתוך שדה הראייה ומתוך זה, מגדיר את centroid עבור כל תמונה. התוכנה אז יכול לעקוב אחר המיקום של כל centroid בתוך מסגרת בירושה מסגרת לקביעת נתיבי התנועה.

מחקר זה תאם את כל החלקים הרלוונטיים של החוקי הסופי של התקנות חוק צער בעלי החיים (9 CFR) ועם כל ההנחיות המוסדיות לטיפול האנושי של אורגניזמים הבדיקה במהלך התרבות והתנסות. עם סיום המחקר, כל הדגים היו מורדמים בהתאם להנחיות המתאימות כפי שאושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש עבור הגיאולוגי האמריקני, מרכז לחקר הסביבה קולומביה.

Protocol

1. ההגדרה Diluter עבור חשיפת זחל חדקן לריכוזים מימיים נחושת

1. הגדרת חשיפות באמצעות מערכת זרימה דרך כגון הר משונה Brungs ¹² מערכת diluter העמידה בהנחיות ידי ^13,14,15 ASTM הבינלאומי.
2. בחר 25 מיקרוגרם / ליטר כמו הריכוז נחושת הגבוה המבוסס על תוצאות בדיקה הקודמות שבה תופעות נצפו סביב 4-6 מיקרוגרם / ליטר. השתמש שני pentahydrate הנחושת גופרתית מגיב כיתה (> טוהר 98%) ומערבב עד פתרון מניות בדיקה.
   הערה: סדרת ריכוז דוגמה עבור חשיפות 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.0625, ו 0 מיקרוגרם / ליטר. באמצעות 50% דילולי סדרה החל עם 25 מיקרוגרם / ליטר כמו הריכוז הגבוה ימקד מגוון של ריכוזים ציינו לגרום ליקוי התנהגותי.
3. כן פתרון מניות בדיקה בתוך בקבוק מדידת 48 שעות לפני תחילת החשיפה ולהגדיר למסור ספייק לתא ערבוב diluter באמצעותמנפק מזרק אוטומטי.
4. השתמש בתבנית גיליון אלקטרוני כדי לקבוע את המשקל של כימיים שיתווספו 1 ליטר של מים ללא יונים אשר יוביל 25 מיקרוגרם / ליטר ריכוז נחושת, כאשר תא ערבוב diluter הוא מתובל 1 מ"ל של פתרון המניות הבדיקה.
   הערה: איור 1 מתאר דוגמא של תבנית גיליון אלקטרונית עבור להכנת מלאים כימית לבדיקות רעילות diluter.
5. תשקלי 195 מ"ג של pentahydrate סולפט השנייה נחושת כיתה מגיב באמצעות איזון אנליטיים ויוצקים לתוך בקבוק מדידה 1 L ומערבבים עם 1 ליטר מים ללא יונים ריכוז מלאי של 48.65 מ"ג / ליטר.
6. מניח את הצינור הצריך ממתקן המזרק האוטומטי לתוך פתרון מבחן המניות להגדיר את עוצמת ספייק 1 מיליליטר ולהפוך את diluter על ידי מרפרף על מתג ההפעלה ולתת מחזור במשך 48 שעות ולאפשר לו לאזן את הריכוז נחושת המקביל לפני הגרב חִדקָן.
7. צרף במפצל זרימת אונליין 4 כיוונים 16 לכל קו סניקה לחלק זרימת מים בכל אחד מארבעת תאי החשיפה לשכפל באמבט מי diluter. Gravity להאכיל את המים. מחזור המים דרך diluter כאשר הכוח אל diluter מדליק שסתום סולנואיד נפתח ומאפשר למים לזרום אל הטנקים דילול. הגדר את יחידת ילר עד 15 מעלות צלזיוס ולהדליק משאבת מים לזרום מים באמבט מי diluter.
   הערה: תהליך זה מוסדר על ידי שימוש טיימר אוטומטי.
8. הגדר את diluter מחזור כל 30 דקות באמצעות טיימר אוטומטי, וכדי לספק 250 מ"ל מים מבחן עם כל מחזור, וכתוצאה מכך 12 תוספות נפח ליום לכל לשכפל חדר הבדיקה.
9. חדרי בדיקת חשיפה בחרו בהתבסס על הגודל של חידקן לשמור קצב טעינה מקובל וזה <10 משקל רטוב גרם דגים / L בכל תא בכל זמן נתון. לדוגמא, לנהל חשיפות עם 30 יום-פוסט-אץ (DPH) החדק לבן (משקל ממוצע בגרמים 0.17 גרם) להשתמש 12 x21.5 ס"מ ² צנצנות זכוכית עם חור 4 ס"מ בצד. מכסים את הצד הזה עם מסך נירוסטה רשת 30 מיקרון, כדי לאפשר זרימה דרך המים מבחן. היקף מבחן מי צנצנות החשיפה הוא 1 ל
10. באמצעות מזרק פלסטיק 50 מ"ל לקחת שתי דגימות מים לשכפל 50 מיליליטר בכל ריכוז עבור סכום כולל של 12 דגימות ולחלק מבחן מים לתוך כוסות זכוכית 100 מיליליטר ולמדוד חמצן מומס (DO), טמפרטורה, מוליכות, pH, בסיסיות, קשיות, הכוללים אמוניה, קטיונים גדולים, אניוני גדול פחמן אורגני מומס באמצעות ציוד מסחרי רגיל ופעל לפי הוראות היצרן.
    הערה: דגימות צריכות להילקח בייזום סוף החשיפה.
11. כדי לאסוף דגימות תת לאנליזה כימית, השתמש מזרק פלסטיק 25 מיליליטר, להכין כ 24 מיליליטר מי מבחן מתאי החשיפה באמצעות קשית קשית מצורפת המזרק במקום מחט.
12. הסר את קש קשית מן סאיRinge ומקום דיור מחסנית פוליפרופילן מסנן קרום 0.45 מיקרומטר גודל נקבובי, polyethersulfone על מזרק הפלסטיק.
13. Push 4 מיליליטר מי מבחן דרך המסנן ועושה.
14. מחלקים את המים 20 מ"ל של מבחן הנותרים דרך המסנן לתוך בקבוקים פלסטים חומצה-ניקה להפוך לחומצה נפח 1% / נפח עם טוהר גבוה, 16 M חומצה חנקתית לאחסון של עד 3 חודשים.
    הערה: דוגמאות לאנליזה כימית יש לנקוט ב החניכה, האמצע והסוף של חשיפה לאשר ריכוזיים נחושת.
15. ביצוע ניתוח כימי באמצעות ספקטרומטריית מסת פלזמה מצמידה אינדוקטיבי הבא: שיטת סוכנות להגנת הסביבה בארה"ב 6020a ¹⁷
16. לאחר שלקח את כל דגימות מי diluter הוא רכיבה על אופניים, 10 מניות (אקראי, באקראי) החדק בכל לשכפל חדר בדיקה. אסוף את חדקן מהטנק בתרבות שבה הם משוכנים באמצעות רשת קטנה רשת שאינה שוחקת. מניחים חדקן בתוך bucke קטןt עם מי תרבות. סך של 240 דגים נדרשים להתחיל החשיפה.
17. לא להאכיל את הדגים במהלך החשיפה.
    הערה: עיין איור 1 עבור התקנה ויזואלית של עריכת diluter.
18. קראו את הבדיקה כל יום למשך תמותת החשיפה ולהקליט דגים ולפקח שחי התנהגות.
    הערה: נקודות קצה אחרים כדי לחפש כוללים עייפות, אובדן שיווי משקל, שינויים בנשימה, שינויי פיגמנטציה, עמדת הדגים בעמודת המים, מסתתר פעילות וכל מומים אחרים כי ניתן לזהות בעין.
    הערה: קרא את הבדיקה באותו זמן בכל יום עבור עקביות.
19. למדוד ולכמת פעילות שחייה (דגי משך זמן זזים, מהירות והמרחק עבר) באמצעות תוכנת מעקב דיגיטלית זמינה מסחרי.

2. תצפיות וספירות תמותה במהלך חשיפה

1. ראייה לבדוק כל בדיקה chענבר פתק התמותה ותצפיות של התנהגות חריגה באמצעות checklist התנהגותי (טבלה 1) על גיליונות כ באותו זמן יומי במהלך החשיפה 96 שעות, עדיף בבוקר.
   הערה: התנהגויות שאינן להפליא, שלא כהרגלו, באופן סובייקטיבי, שונה באופן מהותי מן שולטת נחשבים חריגים. באופן אופטימלי הצופה אינו מודע של הטיפולים.
   הערה: ההפסד של שיווי משקל מוגדר כחוסר יכולת של דגים כדי לשמור על תנוחה זקופה בתוך בעמודת המים תנועה מוגדרת כחוסר יכולת של דגים להעביר או לשחות אלא דחק. חריגויות אחרות כגון עייפות, היפראקטיביות, עליות או ירידות בנשימה, שינויי צבע, רעידות, עוויתות, בטן נפוחה, עמדה בעמודת המים וכל דפוסי שחייה יוצאי דופן אחרות צריכות גם להיות מוקלטות על גיליון הנתונים.
   הערה: עיין וידאו 1 לדוגמאות של חריגההִתְנַהֲגוּת.
2. שיא ולהסיר חדקן מת יומי.
3. באמצעות כף יד חמצן מומס (DO) מטר עם חללית למדוד את החמצן המומס טמפרטורת מים באתר ולהקליט שני משכפל של כל ריכוז חשיפה ולהקליט על גיליון הנתונים.

3. פעילות שחייה videotaping

1. דגימות נתוני וידאו לכידות באמצעות מצלמת וידאו כף יד רכובות על חצובה ממוקמת בדיוק מעל הראש של חדר הבדיקות לתעד ליקויים התנהגותיים.
2. כדי לכמת פעילות שחייה, לחתוך חתיכה של סנטימטר 13 צינור PVC בקוטר 13 סנטימטרים להשתמש כזירת הבדיקה (איור 1). מניח את צינור ה- PVC של diluter בתוך כל טנקי חשיפת ריכוז נחושת מקבילים. השתמש באזור בתוך צינור PVC כזירת המבחן כמו זה הוא גדול מספיק עבור חדקן לשחות בחופשיות.
3. בסוף החשיפה 96 שעות, subsample אקראי 5 לשרוד חדקן מכל נחושת concentration למדוד לפעילות שחייה ומניח אותם לזירת הבדיקה באמצעות רשת רשת קטנה.
   הערה: בריכוזים הגבוהים במבחנים שבו תמותת חדקן הייתה נפוצה, כל חדקן לשרוד הנותרים יש להשתמש כדי למדוד את פעילות שחייה, ובמקרים מסוימים עשוי להיות פחות מ -5.
4. לאחר שהניח את הדגים לזירת הבדיקה, לאפשר את הדגים להסתגל לתקופה של 30 דק '.
   הערה: מוצלחת, ניתוח נטול שגיאות של הווידאו דורש שתמונה בעלת ניגודיות גבוהה של הדגים על רקע עם מינימום של מבנה שעשוי לטשטש או להסתיר את התמונה של הדג. התמונה של הדגים חייבת להיות בפוקוס טוב חייב להיות חופשי של בוהק משטח או ללא עיוותים בשל העברת מים כך שמערכת diluter חייבת להיות כבויות.
5. לאחר 30 דקות, ידליק את מצלמת וידאו ומוגדר REC כדי להקליט את הפעילות שחי לתקופה של 2 דקות.
6. להרדים את הדג לאחר נטילת הקלטות וידאו כדי לקבוע להיותתופעה.
7. מניחים חדקן בתמיסה מרוכזת של methanesulfonate tricaine (MS222) מים במשך 10 דקות לפחות, כדי לאפשר להפסקת התנועה opercular.
   הערה: ריכוז של לפחות 250 מ"ג / L מומלץ ועשוי להיות הרבה יותר גבוה עבור מינים מסוימים.
8. מניח את חדקן מורדם בשקית ומקום נעילת מיקוד פלסטיק במקפיא לסילוק במועד מאוחר יותר. כבה את מצלמת וידאו ולהעביר את כל קבצי וידאו למחשב לצורך עיבוד פוסט באמצעות תוכנת מעקב דיגיטלי.

4. מדדי פעילות שחייה מ פלייבק וידאו

1. אתר את קבצי נתוני גיליון וידאו נתונים עבור הניסוי להיות מנותחים. כדי להמיר קבצי וידאו בפורמט תואם תוכנת הניתוח הדיגיטלית יכולה להתמודד.
2. העלו את כל הקבצים להיות מעובד לתוך תוכנה. תוכנת מעקב להרחיב על ידי לחיצה על הסמל. הקש על "הניסוי המחדל החדש" תחת "צור ניסוי חדש" option על המסך הראשי.
3. הזן שם עבור הניסוי בתיבת דו-שיח "ניסוי חדש" שמופיע על המסך. בחר קובץ ניסוי מיקום הוא להינצל. לחץ על "אישור". בחר "הגדרות ניסוי" אפשרות תחת "הגדרה" .Choose "מתוך קובץ וידאו" תחת "מקור וידאו".
4. בחר "1" עבור "מספר הזירות". בחר "3" עבור "מספר מקצועות לכל בזירה". בחר "איתור נקודת המרכז" תחת "תכונות במעקב". בחר יחידות רצויות.
5. בחר "רשימת המשפט" אפשרות תחת "הגדרות". לחץ על "הוסף וידאו" בחלק העליון של המסך. בחר "בסדר אלפביתי" תחת האפשרות "סדר מיון" על "וידאו להוסיף" תיבת הדו-שיח שמופיעה על המסך. לחץ על "עיון". נווט אל התיקייה שבה קבצי וידאו ממוקמים.
6. סמן את כל קבצי הווידאו. לחץ על "פתח". לחץ על "הוסף משתנה" בחלק העליון של המסך. זן "ריכוז" לתוך ""תיבה. זן" לייבל ריכוז נחושת מיקרוגרם / L "לתוך" תיבת תיאור ".
7. בחר "נומרית" מן הרשימה הנפתחת עבור "סוג". לחץ על תיבת "ערכים מוגדרים מראש". בחר "הגדר ערכי הפרט" אופציה "ערכים מספריים להגדיר מראש" תיבת הדו-שיח שמופיעה.
8. "0" Enter, "3", "6", "13", "25", ו "50" ב "מראש ערך" בחלל. לחץ על "הוסף >>" בין כל הוספה מספר. הסר את הסימון "אפשר ערכים אחרים" אפשרות. לחץ על "אישור".
9. בחר "משפט" מ לתפריט נשלף בקופסא "סקופ". זן ריכוז מתאים עבור כל ניסוי בקופסות המסופקות. לחץ על "הוסף משתנה" בחלק העליון של המסך. הזן "לחזור" אל התיבה "Label". הזן לפועל "לחזור מספר" לתוך תיבת "תיאור". בחר "נומרית" מן הרשימה הנפתחת עבור "סוג".
10. לחץ על "Pערכים מחדש "תיבה. בחר" גדר ערכי פרט "אופציה" להגדיר מראש ערכים מספריים "תיבת הדו-השיח. זן" 1 "," 2 "," 3 "ו" 4 "ב" מראש ערך "בחלל. לחצו על" הוסיפו >> "בין כל הוספה מספר. הסר את הסימון" אפשר ערכים אחרים "option.Click" אישור ".
11. בחר "משפט" מ לתפריט נשלף בקופסא "סקופ". הזן את המספר לשכפל מתאים עבור כל ניסוי בקופסות המסופקות. בחר "הגדרות ארנה" תחת הלשונית "הגדרות" בחלק העליון של המסך. שם פרטי ההגדרה "ניסיון 1". לחץ על "גזל רקע תמונה" אפשרות "הגדרות ארנה (שפיטה 1)" תיבת הדו-שיח.
12. לחץ על "עיון" על תיבת הדו-שיח "תפוס רקע תמונה". אתר קובץ וידאו עבור ניסיון 1 ולחץ על "פתח". לחץ על אפשרות "גזל" של "תמונה גזל רקע" תיבת הדו-שיח לאחר הסרטון מופיע. לחץ על סמל העיגול הלבן ליד העליון של המסך undאה "הגדרות ארנה".
13. מניפולציות מעגל המופיע כך אזור השחייה כולו מוקף במעגל. סימני אץ להופיע שם באזור בזירה מוגדר. לחץ על "סולם הכיול" סמל ליד החלק העליון של המסך תחת "הגדרות ארנה". שמאל לחץ על קצה זירה אחת. החזק וגרור העכבר למעלה בקצה השני של הזירה. שחרר לחץ על שמאל.
14. הזן "10.5" ב "מרחק העולם האמיתי" תיבת בתיבת הדו-שיח "מרחק כיול" שמופיעה. לחץ על "אישור". במידת הצורך, להתאים קו כיול כך שהוא משתרע על פני בקוטר כולה בזירה עגולה.
15. לחץ על "אמת ארנה הגדרות" אופציה "הגדרות ארנה (1 ניסיון)" תיבת דו שיח. לטפל בכל בעיות אם הגדרות לא תוקפות. קליק ימני על "הגדרות ארנה" תחת האפשרות "הגדרות" מסרגל הכלים "ניסוי Explorer" בצד שמאל של המסך ובחר "חדש" מתפריט.
16. חזור על שלבים 4.11-4.15 עד בזירה הגדרות hותעיף נוצר עבור כל ניסוי. הקפד לבחור את קובץ הווידאו המתאים עבור כל ניסוי. בחר "איתור הגדרות" תחת האפשרות "הגדרות" מסרגל הכלים "אקספלורר ניסוי" בצד שמאל של המסך.
17. בחר "חיסור דינמי" מתוך התפריט הנפתח תחת "שיטת" ב: תיבת הדו-שיח "איתור הגדרות איתור הגדרות 1" כי appears.Choose צבעים מילוי שונים עבור כל נושא תחת "זיהוי נושא" ב: דיאלוג "הגדרות איתור איתור הגדרות 1" קוּפסָה.
18. בחר "וידאו בחר" ולאתר וידאו לניסיון 1.Click "פתח" בחר בכרטיסייה "5.9941" מתוך תיבה "קצב דגימה" תחת "וידאו" ב: תיבת הדו-שיח "הגדרות איתור איתור הגדרות 1". לחץ על "הגדרות" על האפשרות "תמונה הפניה" תחת "איתור" ב: תיבת הדו-שיח "הגדרות איתור איתור הגדרות 1".
19. לחץ על "התחל למידה (C)4; אפשרות בדיאלוג "תמונת ייחוס" box.Wait עבור התוכנית כדי ללמוד תמונת ייחוס. לאחר התמונה ב "תמונת ייחוס" תיבת דו שיח מופיעה ללא חיות, לחץ על "השתמש בתמונה התייחסות דינמית" תחת "הגדרות הרכישה" בתוך תיבת הדו-שיח.
20. לחץ על "סגור". בחר "כהה" מתוך התפריט הנפתח עבור "נושא הוא" תחת "איתור" ב: תיבת הדו-שיח "הגדרות איתור איתור הגדרות 1". גדר מספר קטן אל "33" ומספר גדול יותר "153" עבור "בניגוד אפל" תחת "איתור" "הגדרות איתור: איתור הגדרות 1" תיבה דו שיח.
21. לחץ על "שמור שינויים" לעבר הימנית התחתונה של "הגדרות איתור: איתור הגדרות 1" תיבת דו שיח. לחץ על לחצן ההפעלה על תיבת דו-שיח "בקרת פלייבק" ולאשר תוכנה אשר מעקב אחר בעלי חיים בהצלחה בניגוד הצללים או פסולת. התאם מספרים "הקונטראס Darkt "לפי הצורך.
22. לאחר מעקב מתאים, לחץ על "שמור שינויים" לעבר הימנית התחתונה של "איתור הגדרות: איתור הגדרות 1" תיבת דו שיח. בחר "רכישה" תחת האפשרות "הגדרות" מסרגל הכלים "אקספלורר ניסוי" בצד שמאל של המסך.
23. לחץ על "בדיקה מתוכננת הבאה מסלול" בתיבת הדו-השיח "גדרות רכישה". אשר את המשפט הנכון, הגדרת וידאו בזירה מוצגת תחת "הגדרות" בתיבת הדו-השיח "גדרות רכישה".
24. בדוק את "איתור קובע מהירות" אפשרות בתיבת הדו-שיח "שליטה הרכישה". לחץ על הכפתור עם העיגול הירוק סגור בתוך ריבוע לבן כדי להתחיל בתהליך הרכישה. חזור על שלבים 4.22-4.23 עד שכל הניסויים נספרו.
25. לחץ על "פרופילים נתונים" תחת האפשרות "ניתוח" מסרגל הכלים "אקספלורר ניסוי" בצד שמאל של screen.Choose "זמן" תחת "קינון" option בסרגל הכלים "רכיבים". התאם "כדי" ל "00:02:00" תחת "מרווח בחר מסלול הזמן" הכותרת בתיבת הדו-שיח "זמן". לחץ על "אישור".
26. גרור את תיבת "קן" בין התיבה "התחל" והתיבה "תוצאת 1" באזור "פרופילי נתונים" בצד ימין של המסך. לחץ על "פרופיל ניתוח" תחת האפשרות "ניתוח" מסרגל הכלים "ניסוי Explorer" בצד שמאל של המסך. לחץ על "מהירות" תחת "המרחק והזמן" כותרת בסרגל הכלים "משתנה תלוי" שמופיע.
27. לחץ על "הוסף" על תיבת דו-שיח "מהירות". לחץ על "מרחק עבר" תחת "המרחק והזמן" כותרת בסרגל הכלים "משתנה תלוי". לחץ על "הוסף" על "מרחק עבר" תיבת דו שיח. לחץ על "תנועה" תחת "התנהגות הפרט" כותרת של "משתנה התלוי" toolbar.
28. התאם "מרווח מיצוע" ל "1" תחת "מסנן Outlier" הכותרת בתיבת הדו-שיח "התנועה". התאם "התחל מהירות" ל "2.00" ו "מהירות עצור" ל "1.75" תחת "סף" הכותרת בתיבת הדו-שיח "התנועה".
29. סמן את שתי התיבות עבור "Moving" ו "לא נעים" תחת "הסטטיסטיקה חישוב עבור" כותרת בתיבה "התנועה" דיאלוג. לחץ על "הוסף" בתחתית תיבת הדו-שיח "התנועה". לחץ על "פלט ניתוח" תחת "תוצאות" אפשרות בסרגל הכלים "ניסוי Explorer" בצד שמאל של המסך. לחץ על "חישוב" בחלק העליון של המסך.
30. לאחר משתנים תלויים מחושבים, לחץ על "ייצוא" בחלק העליון של המסך. בחר תיקיית יעד בתיבת הדו-שיח "פלט ניתוח היצוא". בחר "אקסל" מ "סוג הקובץ" תפריט נפתח outpu "ניתוח היצואt "תיבת דו שיח. לחץ על" אישור ".
31. לחץ על "ניסוי שמור" תחת הלשונית "קובץ" בחלק העליון של המסך. סגור את תוכנת מעקב הדיגיטלית. ייבא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני ולנתח באמצעות חבילת תוכנה לניתוח סטטיסטית מסחרית.

תוצאות

ידני עיבוד הנתונים החזותיים תצפיתיים הראו חריגות אחוז גדלו עם ריכוז נחוש הגדלה לאחר רק 72 שעות של חשיפת יזם עם 2 ביום שלאחר צוהר (DPH) חדקן (איור 2). דגימות הווידאו תעדו את ההשפעה הקיצונית של חשיפה נחושה על התנהגות שחי חדקן (וידאו 2) וסייעו בהגדרת ליקוי התנהגותי כתוצאה מכך. בדוגמא נוספת, חדקן 30 DPH הוכיח רגישות לחשיפה נחושת עם ריכוז אפקט קטלן חציון 96 שעות (LC50) של 40.3 מיקרוגרם / ליטר מבוסס על תמותה בלבד. עם זאת, כאשר קצה התנהגותי sublethal של אובדן שיווי המשקל והקיבוע כלול יחד עם תמותה עולה הרגיש עם ריכוז אומדן השפעה 96 שעות החציוני (EC50) החל 2.4 כדי 5.0 מיקרוגרם / ליטר. וידאו תיעוד שנתפסו תופעות sublethal אלה ותצפיות אדם תוקף נוספת של ליקויים התנהגותיים רשמו במהלך החשיפה. השימוש בתוכנת מעקב דיגיטלי הפחית את הזמן שלאחר העיבוד משמעותי בעת ניתוח פעילות שחייה. מהירויות שחיית דגים, את משך הזמן זז, ואת המרחק כל ירד באופן משמעותי (איור 3) עם ריכוז נחושת גובר. ברכת נתיבים הופחתו גם עם ריכוז נחוש הגדלה (איור 4).

איור 1:.. צילום מסך מחשב של תבנית גיליון אלקטרוני המשמש לקביעת מבחן ריכוז פתרון המניות להכנת מלאי כימית לבדיקות רעילות diluter נקבע באמצעות תבנית גיליון אלקטרוני מבוסס על ריכוז היעד אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ב-page = "1">
איור 2:. התקנת Diluter ותכנון ניסויים חיים בשלבים שונים של חדקן לבן נחשפו נחושת. גודלו של diluter המשמש החשיפות נבחר בהתבסס על הגודל של הדגים. (א) חדקן חיים בשלב מוקדם נחשף באמצעות התקנת diluter קטנה (ב) חדקן חי בשלב מבוגרים נחשפו באמצעות התקנת diluter גדולה.

איור 3: ברכת תוצאות התנהגות מתוך חדקן לבן חיים בשלב מוקדם (transmontanus חדקן) חשיפה נחושה 72 שעות (החל 30 יום שלאחר צוהר [DPH] דגים). נקודות קצה פעילות שחייה (א) משך תנועה בין 30 DPH חדקן לבן; (ב) מהירות של שחייה; ו- (ג ) עבר ירד ככל שעלה ריכוז נחושת בין חדקן לבן החשוף במשך 96 שעות. כוכבית מציינת הבדל משמעותי משליטה, ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן.

איור 4: תוצאות מתוך חדקן לבן חיים בשלב מוקדם (transmontanus חדקן) 96 חשיפה נחושת hr (החל עם 2 ביום שלאחר הצוהר [DPH] דגים) שורדים חדקן לבן ב -2 DPH מפגין אובדן שיווי משקל וקיבוע לאחר 72 שעות של. 96 שעות חשיפה ככל שעלה ריכוז נחושת. כוכבית מציינת הבדל משמעותי משליטה, ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן.

איור 5: תוצאות נתיב שחי דוגמא מתוך חדקן לבן חיים בשלב מוקדם (חדקן transmontanus) חשיפה נחושה 96 שעות (בוהה עם צוהר פוסט 30 יום [DPH] דגים). נתיבי שחייה של חידקן דיגיטציה באמצעות תוכנת מעקב דיגיטלי מ (א) לשכפל ביקורת (n = 5 דגים) ו- (ב) מאת טיפול גבוה (50 מיקרוגרם / ליטר) לשכפל (n = 3 דגים) לאחר חשיפת 96 שעות. הערה מספר נתיבי שחייה אינו מייצג את מספר נוכחי דגים בתא בגלל דגים מסוימים היו פעילות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פרמטר מדיד	פרמטרים תצפיתיים
מְהִירוּת	עייפות / היפראקטיביות
מרחק הועבר	אובדן שיווי משקל
משך הזמן המושקע אזור	עוויתות / רעידות / הפוךלְמַטָה
אזור מעבר-מספר מהלכי אורגניזם פעמים בין אזורים שנבחרו	תפקיד בעמודת המים
כותרת לנקודה-מחשב את הסטייה של הנתיב של החיה לעבר נקודת העניין	נשימה (מהיר / איטי)
כותרת מחשבת הכותרת של נקודת הגוף הנבחרת	סוג צבע
הפעל זווית הבדל כותרת בין שתי דגימות	הַסתָרָה
מהירות-מחושבת זוויתי על ידי חלוקת הזווית בתורו על ידי מרווח הדגימה
שוטט-מחושב על ידי חלוקת הזווית בתורו על ידי המרחק שעבר. לערוך השוואה בין מפנה בחיות נעים במהירויות שונות
משך הזמן נע
ניידות המדינה- מחשבת את משך הזמן שבו באזור המלא זוהה כמו חיה משתנה, גם אם אחוזאה נקודה נשארה זהה
סיבוב סיבוב אחד יושלם כאשר נקודת הגוף הנבחרת יש זווית סיבוב מצטברת של 360 מעלות. תורים בכיוון ההפוך של פחות מהסף הם התעלמו.
ניידות רציפה מחשבת את אחוז הניידות באזור המלא של החיה המזוהית, גם אם נקודת המרכז נשארת זהה.
מרחק בין נושאים-מחשבת מרחק בין כל השחקנים ואת המקלטים שנבחרו
קרבה-מחשבת את משך הזמן שבו השחקן הוא או היא לא בסמיכות למקלט
תנועה יחסית
תנועה-The משוקלל נטו התנועה של השחקן כדי (חיובי) וממנה (שלילית) את השפופרת, משוקלל על פי המרחק ביניהם
תנועה משוקללת מ-moveme NT של השחקן מהמקלט, משוקלל על פי המרחק ביניהם.
תנועה משוקללת ל-תנועה של השחקן למקלט, משוקלל על פי המרחק ביניהם
מלא תקופת ניסיון על מחוסרים בין שני אירועים של רכיבי בקרת המשפט, או בתוך אלמנט אחד
אירוע-רגע שליטת התנסות שבה אירוע בתוך אלמנט שהגדרה בקרת משפט מתרחש.

טבלה 1:. נקודות קצה התנהגות לכמת באמצעות תוכנת מעקב דיגיטלית נקודות קצה אלה יכולים לשמש על יחידים או קבוצות וכן לשמש כרשימה לבדיקות חזותיות תצפיתי של ליקוי התנהגותי במהלך החשיפה.

/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> וידאו ^1:. הגדרה חזותית של התנהגות חריגה שהפגינה חדקן לבן מושפע (קליק ימני להוריד) רשימת תיוג תצפיתי יומית שמשה לתעד חריגות. אובדן שיווי המשקל והקיבוע היו הליקויים הנפוצים ביותר שנצפו במהלך החשיפות. השונות מן Calfee et al. ⁷

וידאו 2: תיעוד חזותי הדגשת כדוגמה להתנהגות שחייה חדקן לבן. (קליק ימני להוריד) חדקן לבן פעילות שחייה הייתה פחותה בהרבה עם חשיפת ריכוז נחושת גובר. חדקן מתואר בסרט הזה הוא מתוך שליטה, מעורב מסורתי, וכן טיפול גבוה בסוף של נחושת 96 שעות מימיותחֲשִׂיפָה. למרות חדקן הלבן היה עדיין בחיים ברור הדגים היו פגומים מאוד הטיפולים בהשוואה לקבוצת הביקורת. שונה מן Calfee et al. ⁷

Discussion

שינויים בהתנהגות כתוצאה מחשיפה זיהום משמשים לעתים קרובות נקודת קצה לרעילות תת-קטלני, אבל יכול להיות קשה למדוד. באופן כללי, תגובות התנהגות נמדדות על ידי תצפיות חזותיות וניתוח נתונים ידני אשר דורש הרבה זמן כדי לעבד. עם זאת עם טכנולוגיה מתקדמת, שיטות לפעילות שחייה לכימות התמקדו באמצעות צילום וידאו ¹⁸ וניתוח תנועה או תוכנת מעקב דיגיטלי אשר מפחית את זמן העיבוד וניתוח. במהלך הניתוח של הווידאו שנתפס נתונים, לכימותים משתנה שחייה ידנית היו מאוד זמן רב כל כך בשימוש בהקלטות נתוני וידאו ותוכנות מעקב דגים ספקו דרך אפקטיבית ויעילה יותר כשמדובר בניתוח התנהגות שחי חדקן. למרות ההליך הדגיש שחי התנהגות של דג, התאמה האישית של אורגניזמים אחרים כגון דו-חיים וחסרי חוליות מימיות ידרשו שינויים פשוטים. תלוי מה endpoin התנהגותיts שפונים, מערכות עיצוב מצלמת ניסוי ניתן שפותחו לשימוש עם כמעט כל חבילת תוכנת מעקב זמינה מסחרי.

השיטה מודגמת באמצעות נחושת מומסת, אבל הוא ישים מזהם מימי אחר או מאפיינים כגון טמפרטורה או תוכן חמצן. הפרוטוקולים שפותחו המוצגים במאמר זה מנוצל מצלמת וידאו דיגיטלית פשוטה כמו מכשיר ההקלטה. הקבצים הדיגיטליים מועברים בקלות למחשב ונטענו לתוכנת ניתוח תנועה. השיטות אינן מפסיקות שונות ומעודנות כדי לייעל את תהליך כימות. זה הכרחי כי איכות הווידאו להיות ב- High Definition על מנת תוכנת ניתוח לזהות כל דגים בודדים למעקב אחר. כל רקע שאינו מול אופי הדגים יגרום לבעיות כאשר מנסים לעבד את קבצי נתונים. עוד בעיה נפוצה עם שני מעקב וידאו ממדי היא אנשים מזהיםכאשר נתיבים שחיו לחצות. ניתן לתקן זאת באופן ידני על ידי זיהוי כל דגים במהלך מעבר הנתיב והקישור את מקטעי הנתיב בתוך התוכנה. לחלופין, מסך הפעילות ניתן לקבוע מן החדר כל לשכפל כממוצע הקבוצה. מספר תאים נפרדים עם כל אחד המכיל דגים אפשר להצטלם באותו שדה הראייה לחשב תנועות של דגים בודדים.

נכון לעכשיו יש לנו לשדרג את באמצעות סדרה של מצלמות מעקב תקורה מעל לתאי החשיפה צמודים מכשיר הקלטת וידאו דיגיטלי באבחנה גבוהה (HD-DVR). עם זאת, השימוש של כל מערכת מצלמה שיכולה להקליט קטעי וידאו MPEG-4 באבחנה גבוהה יעבוד. ה HD-DVR ניתן להגדיר שיא בזמן מסוים מתוכנת עד 7 ימים. הידיים- off זה אוטומטית גישה מאפשר ללכוד של כמה קטעי וידאו בו זמנית לשמור על עקביות תוך מזעור הפרעות חיצוניות אשר עלול לסכן את התנהגות דגים. Syste HD-DVRms מחוברים ברשת פנימית כך העברת קבצים היא פשוטה יחסית. בעוד מערכת המצלמה האוטומטית היא טכניקה השתפרה מאוד לכימות התנהגות שחייה, זה עדיין מועיל ביצוע תצפיות ויזואלית לשרת מידע תומך נוסף כמו לתיעוד ליקוי התנהגותי במהלך בדיקות רעילות.

יש היסטוריה ארוכה של התנהגות הדגים שינו המתעדת ספרות הנובעים מחשיפה למתכות שראשיתה בתחילת שנות ה -1960 ^19,20,21. נחושת הוכח לגרום לשינויים ברמות פעילות כגון hypoactivity ב bluegill ²² (Lepomis macrochirus rafinesque) ושינויים של תנועה ופעילות האכלה של ברוק פורל ²³ (Salvelinus fontinalis). לפחות חלק דגי נעורים להסתמך על חוש הריח שלהם כדי לזהות ולהימנע טורפים, וחסך chemosensory הנגרם נחושת עשוי להשפיע התנהגויות הקשורות כימיקלי אזעקה לגילוי ^24,25,26 . אפיתל הרחת ניזוק עקב חשיפה נחושת ובכך להשפיע מנגנונים תחושתיים אשר עלול לגרום בלבול, הימנעות התנהגותית, האכלה מופחתת וכל התנהגויות אחרות הם מודרכים על ידי חוש ריח ^27. התנהגויות שינו אלה עלו בקנה אחד עם מה שנצפה במהלך החשיפות.

התנהגות שהחייה של חדקן לבן הושפעה מאוד במהלך חשיפת sublethal לריכוזים נחושים מימיים .. תוצאות אלו ממחישות כיצד התנהגות מושפעת בריכוזי sublethal של נחושת וניתן להשתמש בו כאינדיקטור לחץ רעיל. הניתוח מבוסס וידאו הוכחו כיעילות בכימות התנהגות שחייה ושימש גם תיעוד חזותי איכותי של ההשפעות החמורות על חדקן חשוף נחושת. תוכנת הניתוח היא גם מסוגלת לכימות נקודות קצה התנהגותיות שונות אחרות. אנא עיין בטבלה 1 עבור רשימה. מערכת החשיפה יכולה להיות שונה כדי לטפל כל נקודת קצה במצב בזמן אמת וניתן להשתמש בו כדי לכמת הבדלים בהתנהגות הקשור לחשיפה מזהמת שונה של דאגה.

שימוש נקודות קצה התנהגותי במחקר טוקסיקולוגית מימי מועסק יותר ויותר וצריך לקחת בחשבון בעת הערכת ההשפעות של מזהמים כי הפונקציה התנהגותית אדפטיבית היא קריטית בקביעת פגיעה סביבתית ^9. ההשפעות של מזהמים סביבתיים להתנהגות דגים בדרך כלל סובייקטיבי מאתגר במיוחד כשדנים נקודות קצה sublethal בהעדר שיטות סטנדרטיות ..

בריכת פעילות כמו לכמת באמצעות שיטות אלה ניתן לפקח בקפדנות, הוא שאינו הרסני עם מתח מינימלי לאורגניזם וניתן לחזור. שחי התנהגות הוא מדד תקף ועקבי של רעילויות sublethal כי צריך להיות משולבת פרוטוקולי בדיקה כדי להרחיב את הרגישות של בדיקות רעילות תקן ^5.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
copper II sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich		contaminant of concern
syringe dispenser	Hamilton MicroLab 600 Series		apparatus to spike chemical
2 L volumetric flask			container for holding stock solution
24-1.5 L glass jars			test chamber for 2 dph sturgeon
video camera	Sony Handycam HDR-CX550V
digital tracking software	Noldus Ethovision
3-17" flat screen monitors
24 surveillance cameras	Model CL101
3-16 channel digital recording devices
DO meter	YSI
pH meter	Orion 940
ph probe	Orion
ammonia meter
ammonia probe	Orion
chiller unit
recirculating water pump