Quantificare Pesce Nuoto Comportamento in risposta all'esposizione acuta acquosa di rame utilizzando Computer Assisted Video e Digital Image Analysis

Riepilogo

Misurare l'impatto dei contaminanti ambientali sul comportamento del pesce è spesso soggettiva e impegnativo soprattutto quando si tratta di endpoint subletali. Descriviamo metodi tra cui la tecnologia video per quantificare il comportamento di nuoto della vita fase iniziale bianco storione (Acipenser transmontanus) durante e dopo 96 ore esposizioni acute a varie concentrazioni di rame.

Abstract

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.

Introduzione

Capire come l'esposizione contaminante può influenzare il comportamento a volte è molto difficile e soggettiva. Comportamento è tipicamente definito come una serie di attività palesi, osservabili, corpo intero che operano attraverso il sistema nervoso centrale e consentono un organismo di sopravvivere, crescere e riprodursi. Cambiamenti nel comportamento a causa di esposizione a una sostanza tossica sono tra gli indicatori più sensibili di stress ambientale spesso tra 10-100 volte più sensibile rispetto alla sopravvivenza ^1. La maggior parte di questi studi ha esaminato il nuoto attività, ventilazione e del comportamento alimentare di ^2,3,4 pesci. Nuoto attività è la più utilizzata endpoint subletali determinare un cambiamento comportamentale in risposta ad un contaminante nel test di tossicità ^5. variabili nuoto includono la frequenza e la durata del movimento, la velocità e la distanza percorsa, la frequenza e l'angolo di giri, la posizione nella colonna d'acqua e il modello di nuoto. Il nuoto è l'attivitàuna misura efficace di comportamento di nuoto nel valutare la sensibilità di una sostanza tossica sulla base dei criteri proposti nel capitolo 9 da Rand ⁶ nei fondamenti del libro di Aquatic Toxicology.

Questo documento presenta uno studio tossicologico come un esempio di come la tossicità del rame di storione bianco presto la vita allo stadio (Acipenser transmontanus) nelle varie fasi di sviluppo precoce in acqua solo esposizioni relative al storione comportamento di nuoto è stato valutato e illustra i metodi per quantificare il nuoto comportamento.

In studi precedenti, le risposte comportamentali avversi sono stati evidenti con esordio precoce durante i primi giorni di esposizioni acute e croniche di rame e sono diventati progressivamente più grave lungo la durata dell'esposizione e ^7,8,9 concentrazione. L'entità e la tempistica di insorgenza di queste risposte comportamentali sono suscettibili sufficienti a limitare la sopravvivenza a lungo termine e quindi sono fonte di preoccupazione date le implicazioni per recruitment fallimento ^10. Per interpretare accuratamente il significato di questa sensibilità ai metodi e procedure esposizione metallici sono stati sviluppati per quantificare l'andamento temporale e l'entità di disturbi comportamentali relativi alle concentrazioni di rame.

protocolli di test per la funzione del comportamento e lo sviluppo sono stati stabiliti analizzando campioni di video generali di storione in camere di esposizione. I video campioni forniti valutazione qualitativa di sviluppo e di funzione tra i trattamenti di rame durante il periodo di esposizione. Comportamento e riparo in cerca di attività sono state valutate durante le esposizioni a concentrazioni di rame acquose per determinare il tempo necessario per effettuare e per caratterizzare la sequenza temporale di deterioramento che colpisce in cerca di rifugio, letargia, il nuoto coordinazione, equilibrio, e la respirazione. Inoltre, registrazioni video sono state fatte di storione subsampled da ciascuna replica allo scopo di documentare quantitativamente acti nuoto spontaneavità. Questi endpoint inclusi misure di durata o il tempo trascorso in movimento, il nuoto la velocità e la distanza percorsa ^5,11 utilizzando un pacchetto software per l'analisi di immagini digitali disponibili in commercio. Questo software definisce il contorno di ciascuna immagine all'interno di un campo di vista e da questa, definisce il centroide per ogni immagine. Il software quindi in grado di monitorare la posizione di ciascun baricentro in un fotogramma per fotogramma successione per determinare i percorsi di movimento.

Questo studio ha rispettato tutte le sezioni applicabili delle Regole Definitive dei regolamenti Animal Welfare Act (9 CFR) e con tutte le linee guida istituzionali per il trattamento umano degli organismi di prova durante la coltura e la sperimentazione. Al termine dello studio, tutti i pesci sono stati eutanasia secondo le linee guida appropriate, come approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso di animali per la US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.

Protocollo

1. Diluitore installazione per larvale Sturgeon L'esposizione a concentrazioni acquose di rame

1. Impostare esposizioni che utilizzano un sistema a flusso continuo, come un sistema di ¹² diluitore Monte e Brungs modificato seguenti linee guida da parte della ASTM International ^13,14,15.
2. Selezionare 25 mg / L come l'alta concentrazione di rame in base ai risultati dei test precedenti, in cui sono stati osservati effetti intorno 4-6 mg / L. Utilizzare il reagente grado di rame II pentaidrato solfato (> 98% di purezza) e miscelare una soluzione di test magazzino.
   NOTA: Serie concentrazione Esempio per le esposizioni sono 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.0625 e 0 mg / L. Utilizzando diluizioni seriali del 50% a partire con 25 mg / L come l'alta concentrazione si rivolgerà una gamma di concentrazioni osservate di causare compromissione comportamentale.
3. Preparare la soluzione di test di magazzino in un pallone tarato 48 ore prima dell'inizio dell'esposizione e impostare per consegnare a picco la camera di miscelazione con un diluitoredispenser siringa automatizzato.
4. Utilizzare un modello di foglio per determinare il peso di sostanza chimica da aggiungere a 1 L di acqua deionizzata che si tradurrà in 25 mg / L concentrazione di rame, quando la camera di miscelazione diluitore è drogata con 1 ml della soluzione di prova stock.
   NOTA: La figura 1 illustra un esempio di un modello di foglio di chimico stock preparazione per i test di tossicità diluitore.
5. Pesare 195 mg di reagente grado di rame II pentaidrato solfato usando una bilancia analitica e versare in un pallone tarato da 1 L e mescolare con 1 L di acqua deionizzata per uno stock concentrazione di 48.65 mg / l.
6. Posizionare il tubo di aspirazione dal distributore della siringa automatizzato nella soluzione di prova magazzino e impostare il volume picco di 1 ml e girare il diluente sulla spostando l'interruttore di accensione e lasciare ciclo per 48 ore lasciarlo equilibrare la concentrazione di rame corrispondente prima di stoccaggio storione.
7. Montare un filtro in linea a 4 vie splitter flusso ^{16 per ciascuna linea di erogazione di partizionare flusso d'acqua a ciascuno dei quattro camere di esposizione ripetute nel bagnomaria diluitore. A caduta l'acqua. Ciclo l'acqua attraverso il diluitore quando l'alimentazione al diluitore accende e una elettrovalvola viene aperta permettendo all'acqua di fluire verso i serbatoi di diluizione. Impostare gruppo frigorifero a 15 ° C e accendere pompa per far circolare l'acqua nel bagnomaria diluitore.
   NOTA: Questo processo è regolato mediante l'uso di un timer automatico.}
8. Impostare il diluente per ciclo ogni 30 minuti utilizzando il timer automatico e per fornire 250 ml di acqua di prova con ogni ciclo, con conseguente 12 quantità aggiuntive al giorno per ogni replicare camera di prova.
9. Seleziona camere di prova di esposizione in base alle dimensioni dello storione per mantenere tasso accettabile di carico che è <10 g di peso umido di pesce / L in ogni camera in un dato momento. Ad esempio, per condurre esposizioni con 30 giorni-dopo la schiusa (DPH) storione bianco (peso medio in grammi 0,17 g) utilizzare 12 x21,5 cm ² vasetti di vetro con un foro di 4 cm di lato. Coprire questo lato con uno schermo in acciaio inox di maglia 30 micron per consentire il flusso attraverso di acqua di prova. Il volume di acqua di prova nei vasetti di esposizione è di 1 L.
10. Usando una siringa di plastica da 50 ml prendere due replicati 50 ml campioni di acqua a ciascuna concentrazione per un totale di 12 campioni ed erogare acqua di prova in 100 bicchieri di vetro ml e misurare l'ossigeno disciolto (DO), temperatura, conducibilità, pH, alcalinità, durezza, totale ammoniaca, i principali cationi, anioni principali e carbonio organico disciolto utilizzando attrezzature commerciale standard e seguire le istruzioni del produttore.
    NOTA: i campioni devono essere prelevati presso l'inizio e fine dell'esposizione.
11. Per raccogliere sotto-campioni per l'analisi chimica, usare una siringa di plastica da 25 ml, elaborare circa 24 ml di acqua di prova dalle camere di esposizione usando una cannuccia sipper attaccato alla siringa, invece di un ago.
12. Rimuovere la paglia di aspirazione dal syRinge e posizionare un contenitore cartuccia filtrante in polipropilene a 0,45 micron dimensione dei pori, la membrana polietersulfone sulla siringa di plastica.
13. Premere 4 ml di acqua di prova attraverso il filtro e smaltire.
14. Erogare i restanti 20 ml di acqua di prova attraverso il filtro in una bottiglia di polietilene acidi puliti e acidificare al 1% volume / volume con elevata purezza, 16 di acido nitrico, M per la memorizzazione di un massimo di 3 mesi.
    NOTA: I campioni per le analisi chimiche devono essere prese al iniziazione, metà e fine dell'esposizione per confermare le concentrazioni di rame.
15. Eseguire l'analisi chimica utilizzando ad accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma seguente US Environmental Protection Agency Metodo 6020a ¹⁷
16. Dopo aver preso tutti i campioni di acqua e il diluitore è ciclismo, magazzino 10 (a caso a caso,) storione in ogni replicare camera di prova. Raccogliere lo storione dal serbatoio di cultura in cui sono ospitati usando una piccola rete della maglia non abrasivo. Mettere storione in un piccolo Bucket con acqua cultura. Un totale di 240 pesci sono necessari per iniziare l'esposizione.
17. Non mangiare ai pesci durante l'esposizione.
    NOTA: Si prega di fare riferimento alla Figura 1 per una configurazione visiva del layout diluitore.
18. Leggere il test ogni giorno per la durata dell'esposizione e pesce registrare la mortalità e monitorare nuoto comportamento.
    NOTA: Altri endpoint per cercare includono letargia, perdita di equilibrio, i cambiamenti nella respirazione, cambiamenti nella pigmentazione, posizione pesci sono nella colonna d'acqua, nascondendo l'attività e le eventuali altre anomalie che possono essere identificati visivamente.
    NOTA: Leggere il test, allo stesso tempo ogni giorno per coerenza.
19. Misurare e quantificare l'attività di nuoto (pesce tempo trascorso in movimento, la velocità e la distanza spostato) utilizzando un programma software di monitoraggio digitale reperibile in commercio.

2. Osservazioni e Conti di mortalità durante l'esposizione

1. Visivamente ogni ch provaambra e mortalità nota e osservazioni del comportamento anomalo utilizzando una lista di controllo comportamentale (Tabella 1) sulle schede approssimativamente allo stesso tempo quotidiano durante l'esposizione a 96 ore, preferibilmente al mattino.
   NOTA: comportamenti che sono sorprendentemente, stranamente, soggettivamente, qualitativamente differente dai controlli sono considerati anormali. In modo ottimale l'osservatore non è a conoscenza dei trattamenti.
   NOTA: La perdita di equilibrio è definita come l'incapacità di pesci di mantenere una posizione eretta nella colonna d'acqua e l'immobilità è definita come l'incapacità di pesci di muoversi o nuotare meno spronato. Altre anomalie come letargia, iperattività, aumenta o diminuisce di respirazione, cambiamenti di colore, tremori, spasmi, addome gonfio, posizione nella colonna d'acqua e tutti gli altri modelli di nuoto insoliti dovrebbero essere registrate sulla scheda tecnica.
   NOTA: Vedere Video 1 per esempi di anormalecomportamento.
2. Record e rimuovere lo storione morti al giorno.
3. Usando una mano tesa ossigeno disciolto (DO) metri con sonda misurare l'ossigeno disciolto in temperatura dell'acqua in situ e registrare in due repliche di ciascuna concentrazione di esposizione e registrare sulla scheda tecnica.

3. videocassetta il nuoto Activity

1. campioni di dati cattura video con una videocamera a mano montato su un treppiede posizionato direttamente sopra della camera di test per documentare anomalie comportamentali.
2. Per quantificare l'attività di nuoto, tagliare un pezzo di PVC 13 tubi cm di diametro e 13 cm di altezza da utilizzare come campo di prova (Figura 1). Posizionare il tubo in PVC nel diluitore all'interno di ogni corrispondenti vasche di esposizione concentrazione di rame. Utilizzare l'area all'interno del tubo in PVC, come l'arena di test come questo è abbastanza grande per lo storione a nuotare liberamente.
3. Al termine dell'esposizione a 96 ore, in modo casuale sottocampionare 5 sopravvivere storione da ogni concentratio ramen su misura per l'attività di nuoto e metterli in all'arena test utilizzando una piccola rete mesh.
   NOTA: Nelle concentrazioni di prova più elevate dove la mortalità storione era prevalente, deve essere utilizzato qualsiasi storione sopravvissuto rimanendo per misurare l'attività di nuoto e, in alcuni casi può essere inferiore a 5.
4. Dopo aver posizionato il pesce al campo di prova, consentono il pesce acclimatare per un periodo di 30 min.
   NOTA: buon fine, errore un'analisi gratuita del video richiede un'immagine ad alto contrasto del pesce su uno sfondo con un minimo di struttura che possono oscurare o nascondere l'immagine del pesce. L'immagine dei pesci devono essere in buona messa a fuoco e deve essere privo di abbagliamento superficie o privo di distorsioni dovute ad acqua che si muove in modo che il sistema diluitore deve essere spento.
5. Dopo 30 minuti, spegnere la videocamera e impostato in REC per registrare l'attività di nuoto per un periodo di 2 min.
6. Euthanize il pesce dopo aver preso le registrazioni video per determinare esserecomporta-.
7. Posizionare storione in una soluzione concentrata di tricaine metansolfonato dell'acqua (MS222) per almeno 10 minuti per consentire la cessazione del movimento dell'opercolo.
   NOTA: Una concentrazione di almeno 250 mg / L è raccomandato e potrebbe essere molto più elevato per alcune specie.
8. Posizionare lo storione eutanasia in un sacchetto a chiusura zip di plastica e posto nel congelatore per lo smaltimento in un secondo momento. Spegnere la fotocamera video e trasferire tutti i file video in un computer per la post-elaborazione utilizzando il software di monitoraggio digitale.

4. Le misure di nuoto attività di riproduzione video

1. Individuare i file di dati foglio di dati e video per l'esperimento da analizzare. Convertire i file video in un formato compatibile con il software di analisi digitale in grado di gestire.
2. Carica tutti i file da elaborare nel software. Aperto software di monitoraggio facendo clic sull'icona. Clicca su "sperimentare nuove default" sotto la "Creazione di un nuovo esperimento" option sulla schermata principale.
3. Inserire il nome di esperimento di "nuovo esperimento" finestra di dialogo che appare sullo schermo. Scegli file posizione esperimento deve essere salvato. Fai clic su "OK". Scegliere "Impostazioni esperimento" opzione in "Setup" Scelga "Da file video" sotto "di sorgente video".
4. Selezionare "1" per "Numero di arene". Selezionare "3" per "Numero di soggetti per arena". Selezionare "rilevazione Centro-point" sotto "Caratteristiche cingolati". Selezionare le unità desiderate.
5. Selezionare l'opzione "elenco di prova" sotto "Setup". Fai clic su "Aggiungi video" nella parte superiore della schermata. Scegliere "ordine alfabetico" in opzione "ordinamento" nella finestra di dialogo "Aggiungi Video" che appare sullo schermo. Fai clic su "Sfoglia". Passare alla cartella in cui si trovano i file video.
6. Evidenziare tutti i file video. Fai clic su "Apri". Fai clic su "Aggiungi variabile" nella parte superiore dello schermo. Inserire "Concentrazione" in ""Scatola. Enter" Etichetta concentrazione di rame in microgrammi / L "in" scatola Descrizione ".
7. Scegliere "numerico" dal menu a discesa per "Tipo". Clicca su scatola "Valori predefiniti". Scegliere "Definire i valori individuali" nella finestra di dialogo "predefinire i valori numerici" che appare.
8. Inserire "0", "3", "6", "13", "25" e "50" nello spazio "predefinito valore". Fai clic su "Aggiungi >>" tra ogni aggiunta numero. Deselezionare "Consenti altri valori" opzione. Fai clic su "OK".
9. Scegliere "di prova" dal menu a discesa nella casella "Ambito di applicazione". Inserisci concentrazione adeguata per ogni processo in caselle. Fai clic su "Aggiungi variabile" nella parte superiore dello schermo. Inserire "Replica" in box "Label". Inserire il "numero di Replica" in box "Descrizione". Scegliere "numerico" dal menu a discesa per "Tipo".
10. Clicca su "PI valori ridefiniti "scatola. Scegliere" definire i valori individuali "nella" predefinire i valori numerici "finestra di dialogo. Inserire" 1 "," 2 "," 3 "e" 4 "in" predefinito valore "spazio. Fare clic su" Aggiungi >> "tra ogni aggiunta numero. Deseleziona" Consenti altri valori "option.Click" OK ".
11. Scegliere "di prova" dal menu a discesa nella casella "Ambito di applicazione". Inserire il numero di replica appropriato per ogni processo in caselle. Scegliere "Impostazioni Arena" nella scheda "Configurazione" nella parte superiore dello schermo. Nome prima impostazione "Trial 1". Clicca opzione "Grab Immagine di sfondo" da "(1 prova) Impostazioni Arena" finestra di dialogo.
12. Fai clic su "Sfoglia" nella finestra di dialogo "Grab Immagine di sfondo". Individuare il file video per la prova 1 e fare clic su "Apri". Clicca opzione "afferrare" nella finestra di dialogo "Grab Immagine di sfondo" dopo la visualizzazione di video. Fare clic sul cerchio icona bianca vicino superiore dello schermo undER "Impostazioni Arena".
13. Manipolare cerchio che appare in modo che l'intera area della piscina è racchiuso nel cerchio. separatori appaiono in cui l'area dell'arena è definita. Fare clic sull'icona "Scala Calibrazione" nei pressi superiore dello schermo in "Impostazioni Arena". A sinistra click su un bordo di arena. Tenere premuto e trascinare il mouse sopra al lato opposto dell'arena. Rilasciare tasto sinistro del mouse.
14. Inserire "10.5" in box "Real distanza mondo" nella finestra di dialogo "Calibration Distance" che appare. Fai clic su "OK". Se necessario, regolare la linea di taratura in modo che abbraccia l'intero diametro di arena circolare.
15. Clicca opzione "Convalida impostazioni dello stadio" on "(1 prova) Impostazioni Arena" finestra di dialogo. Risolvere eventuali problemi se le impostazioni non vengono convalidati. Fare clic destro su "Impostazioni Arena" sotto l'opzione "Setup" dalla barra degli strumenti "Experiment Explorer" a sinistra dello schermo e scegliere "Nuovo" dal menu.
16. Ripetere i passaggi 4,11-4,15 fino Arena Opzioni have stato creato per ogni prova. Essere sicuri di scegliere il file video appropriato per ogni prova. Scegliere "Impostazioni rilevamento" sotto l'opzione "Setup" dalla barra degli strumenti "Experiment Explorer" a sinistra dello schermo.
17. Scegliere "Dynamic sottrazione" dal menu a discesa sotto "Metodo" in "di rilevamento Regolazioni: Impostazioni di rilevamento 1" finestra di dialogo che appears.Choose diversi colori di riempimento per ogni soggetto in "Soggetto Identificazione" nel dialogo: "impostazioni di rilevamento delle impostazioni di rilevamento 1" scatola.
18. Scegliere "Selezionare Video" e individuare video per Trial 1.Click "Open" .Selezionare "5,9941" dalla scatola "frequenza di campionamento" nella sezione "Video" in "di rilevamento Regolazioni: Impostazioni di rilevamento 1" finestra di dialogo. Fai clic su "Impostazioni" per l'opzione "immagine di riferimento" sotto "Detection" nella finestra di dialogo: "La diagnosi Impostazioni Impostazioni di rilevamento 1".
19. Fai clic su "Start Learning (C)4; opzione nel "Immagine di riferimento" dialogo box.Wait per il programma di imparare immagine di riferimento. Una volta che l'immagine nella finestra di dialogo "Immagine di riferimento" appare senza animali, fai clic su "Usa immagine di riferimento dinamico" in "Impostazioni di acquisizione" all'interno della finestra di dialogo.
20. Fai clic su "Chiudi". Scegliere "Darker" dal menu a tendina per "Il soggetto è" sotto "Detection" nella finestra di dialogo: "La diagnosi Impostazioni Impostazioni di rilevamento 1". Impostare numero minore di "33" e il maggior numero di "153" per "contrasto scuro" sotto "di rilevamento Impostazioni" Rilevamento ": Impostazioni di rilevamento 1 finestra di dialogo".
21. Fai clic su "Salva modifiche" in basso a destra della finestra di dialogo: "La diagnosi Impostazioni Impostazioni di rilevamento 1". Fare clic sul pulsante di riproduzione nella finestra di dialogo "Playback Control" e confermare che il software sta monitorando con successo gli animali invece di ombre o detriti. Regolare i numeri per "contras scuret "come necessario.
22. Una volta che il monitoraggio è opportuno, fare clic su "Salva modifiche" in basso a destra della finestra di dialogo: "La diagnosi Impostazioni Impostazioni di rilevamento 1". Scegliere "Acquisition" in opzione "Setup" dalla barra degli strumenti "Experiment Explorer" a sinistra dello schermo.
23. Fai clic su "Track prova successiva pianificato" nella finestra di dialogo "Impostazioni di acquisizione". Confermare l'impostazione di prova, video e Arena corretta viene visualizzata in "Impostazioni" nella finestra di dialogo "Impostazioni di acquisizione".
24. Selezionare l'opzione "rilevamento determina la velocità" nella finestra di dialogo "Acquisizione di controllo". Fare clic sul pulsante con il cerchio verde racchiusa in un quadrato bianco per iniziare il processo di acquisizione. Ripetere i passaggi 4,22-4,23 fino a quando tutti gli studi sono stati monitorati.
25. Fai clic su "Profili dati" in opzione "Analisi" dalla barra degli strumenti "Experiment Explorer" a sinistra di screen.Choose "Time" sotto "Nesting" option nella barra degli strumenti "Componenti". Regolare "A" a "00:02:00" sotto il "intervallo di tempo Selezione del brano" voce nella finestra di dialogo "Time". Fai clic su "OK".
26. Trascinare la casella "nido" tra la casella "Start" e la casella "Risultato 1" nell'area "profili di dati" sul lato destro dello schermo. Fai clic su "analisi del profilo" sotto l'opzione "Analisi" dalla barra degli strumenti "Experiment Explorer" a sinistra dello schermo. Fai clic su "Velocity" sotto il "tempo e distanza" voce nella barra degli strumenti "variabili dipendenti" che appare.
27. Fai clic su "Aggiungi" nella finestra di dialogo "Velocity". Fai clic su "distanza percorsa" sotto il "tempo e distanza" voce nella barra degli strumenti "variabili dipendenti". Fare clic su "Aggiungi" nella finestra di dialogo "distanza percorsa". Fai clic su "Movimento" sotto il "comportamento individuale" voce nelle "Variabili dipendenti" toolbar.
28. Regolare "intervallo della media" a "1" sotto il "filtro Outlier" voce nella finestra di dialogo "Movimento". Regolare "velocità di avvio" da e per "velocità Stop" "2.00" a "1,75" sotto la "soglia" voce nella finestra di dialogo "Movimento".
29. Controllare entrambe le caselle per "Moving" e "Non si muove" sotto la voce "Calcolo statistiche per" voce nella finestra di dialogo "Movimento". Fai clic su "Aggiungi" nella parte inferiore della finestra di dialogo "Movimento". Fai clic su "Analisi di uscita" in opzione "Risultati" nella barra degli strumenti "Experiment Explorer" a sinistra dello schermo. Fai clic su "Calcola" nella parte superiore dello schermo.
30. Una volta che le variabili dipendenti sono calcolati, fai clic su "Esporta" nella parte superiore dello schermo. Scegliete la cartella di destinazione in "Uscita Analisi Export" finestra di dialogo. Selezionare "Excel" dal menu a discesa "Tipo di file" in "Export Analisi output "finestra di dialogo. Fare clic su" OK ".
31. Fai clic su "Salva Experiment" nella scheda "File" nella parte superiore dello schermo. Chiudere il software di monitoraggio digitale. Importare i dati in un file di foglio di calcolo e l'analisi statistica utilizzando un pacchetto software di analisi commerciale.

Risultati

Elaborazione manuale dei dati osservazionali hanno mostrato anomalie visive per cento un aumento di concentrazione di rame aumentando dopo appena 72 ore di esposizione avviato con il post portello di due giorni (DPH) storione (Figura 2). I video campioni documentati estrema impatto dell'esposizione rame sul comportamento storione nuoto (Video 2) e aiutato nella definizione della compromissione comportamentale come risultato. In un altro esempio, storione al 30 DPH dimostrato sensibile all'esposizione di rame con una 96 ore concentrazione media effetto letale (LC50) di 40,3 mg / L in base ai solo la mortalità. Tuttavia, quando gli endpoint comportamentali subletali di perdita di equilibrio e di immobilizzazione sono inclusi insieme con la mortalità le sensibilità aumenta con una concentrazione stimata a 96 ore effetto mediana (CE50) che vanno 2,4-5,0 mg / L. Documentazione video catturati questi effetti subletali e ulteriormente validati osservazioni umani di anomalie comportamentali registratidurante l'esposizione. L'uso di software di monitoraggio digitale ha ridotto il tempo di post-elaborazione in modo significativo quando si analizza l'attività di nuoto. Pesce velocità di nuoto, il tempo trascorso in movimento, e la distanza percorsa tutti significativamente diminuita (Figura 3) con la concentrazione di rame in aumento. Percorsi nuoto sono stati ridotti all'aumentare della concentrazione di rame (Figura 4).

Figura 1:.. Computer screenshot di un modello di foglio di calcolo utilizzato per determinare test di concentrazione della soluzione di preparazione chimica magazzino per i test di tossicità diluitore è stato determinato utilizzando un modello di foglio sulla base di una concentrazione target Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2:. Impostazione Diluitore e disegno sperimentale Vari vita stadi di storione bianco sono stati esposti al rame. La dimensione del diluitore utilizzato per le esposizioni è stato selezionato in base alle dimensioni del pesce. (A) di storione Vita in anticipo allo stadio sono stati esposti con un piccolo setup diluitore e (b) più vecchie vita stadi storione sono stati esposti con una grande messa a punto diluitore.

Figura 3: Nuoto risultati di comportamento da un storione bianco precoce vita stadi (Acipenser transmontanus) l'esposizione di rame 72 ore (a partire da 30 giorni dopo il portello [DPH] pesce). Endpoint attività natatoria (a) la durata del movimento fra 30 dph storione bianco; (B) la velocità di nuoto; e (c ) mosso è diminuita con l'aumentare della concentrazione di rame tra storione bianco esposto per 96 ore. L'asterisco indica una differenza significativa dal controllo, le barre di errore rappresentano la deviazione standard.

Figura 4: I risultati di uno storione bianco precoce vita stadi (Acipenser transmontanus) 96 l'esposizione di rame ore (a partire da due giorni dopo il portello [DPH] pesce) Surviving storione bianco a 2 dph esporre la perdita di equilibrio e immobilizzazione dopo 72 ore di una. esposizione 96 ore con l'aumentare della concentrazione di rame. L'asterisco indica una differenza significativa dal controllo, le barre di errore rappresentano la deviazione standard.

Figura 5: Esempio di nuoto percorso deriva da un storione bianco precoce vita stadi (Acipenser transmontanus) l'esposizione di rame a 96 ore (fissando con 30 giorni dopo il portello [DPH] pesce). percorsi di nuoto di storione digitalizzati utilizzando il software di monitoraggio digitale da (a) replica di controllo (n = 5 pesce) e (b) da un trattamento ad alta (50 ug / L) replicando (n = 3 pesci) dopo un'esposizione a 96 ore. Si noti il numero di percorsi di nuoto non rappresenta il numero di pesci presenti nella camera a causa di alcuni pesci erano inattivi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Parametro quantificabile	Parametri osservazionali
Velocità	Letargia / iperattività
distanza percorsa	Perdita di equilibrio
Durata del tempo trascorso nella zona	Spasmi / tremori / a testagiù
Zona di transizione-numero di volte organismo si muove tra le zone selezionate	Posizione nella colonna d'acqua
Intenzione di andare a punto calcola la deviazione del percorso dell'animale verso un punto di interesse	La respirazione (veloce / lento)
Intestazione calcola il titolo del punto selezionato corpo	Colorazione
Girare l'angolo-differenza di voce tra due campioni	occultamento
Velocità angolare-calcolato dividendo l'angolo di svolta per l'intervallo di campionamento
Meandro calcolato dividendo l'angolo turno dal distanza percorsa. Usato per confrontare trasformare in animali in movimento a velocità diverse
Il tempo trascorso in movimento
Mobility stato calcola la durata per cui l'intera area rilevato come animale sta cambiando, anche se il centpunto ER rimane la stessa
Rotazione-una rotazione viene completato quando il punto selezionato corpo ha un angolo di giro cumulativo di 360 °. Attiva nella direzione opposta inferiore alla soglia vengono ignorati.
Mobility continuo calcola la percentuale della mobilità per l'intera area dell'animale rilevato, anche se il punto centrale rimane lo stesso.
Distanza tra i soggetti-calcola la distanza tra tutti gli attori ed i ricevitori selezionati
Proximity-calcola la durata per cui l'attore è o non è in prossimità del ricevitore
movimento relativo
pesata movimento-La Rete movimento del attore (positivo) e da (negativo) il ricevitore, ponderata con la distanza tra loro
movimento ponderata da-moveme nt dell'attore dal ricevitore, ponderata con la distanza tra loro.
movimento ponderata to circolazione dell'attore al ricevitore, ponderata con la distanza tra loro
Controllo di prova periodo di dichiarazione tra due eventi degli elementi di controllo di prova, o all'interno di un elemento
Controllo di prova evento-momento in cui un evento all'interno di un elemento è stato definito nel controllo di prova si verifica.

Tabella 1:. Endpoint comportamentali quantificati attraverso software di monitoraggio digitale Questi endpoint può essere utilizzato su individui o gruppi e servono anche come una lista per i controlli di osservazione visiva delle alterazioni del comportamento durante l'esposizione.

/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> Video ^1:. visiva definizione di comportamento anomalo esibito da interessata storione bianco (clic destro per il download) un elenco di controllo di osservazione giornaliera è stata utilizzata per documentare le anomalie The. perdita di equilibrio e immobilizzazione erano le anomalie più frequenti osservati durante le esposizioni. Modificato da Calfee et al. ⁷

Video 2: documentazione di Visual evidenziando un esempio di comportamento bianco storioni nuoto. (Clic destro per il download) l'attività di nuoto storione bianco è stato notevolmente ridotto con l'esposizione a concentrazioni di rame in aumento. Lo storione raffigurato in questo video sono da un controllo, medio basso, e un'elevata trattamento al termine di rame acquosa 96 hresposizione. Sebbene la storione bianco fosse ancora vivo è evidente il pesce sono stati notevolmente compromessa nei trattamenti rispetto ai controlli. Modificato da Calfee et al. ⁷

Discussione

Cambiamenti nel comportamento a causa di esposizione a un contaminante sono spesso utilizzati come endpoint per la tossicità sub-letali, ma possono essere difficili da misurare. In generale, le risposte comportamentali sono misurati con osservazioni visive e analisi manuale dei dati che richiede un sacco di tempo per elaborare. Tuttavia, con l'avanzare della tecnologia, i metodi per quantificare l'attività di nuoto si sono concentrati sull'utilizzo di videografia ¹⁸ e analisi del movimento o il software di monitoraggio digitale che riduce il tempo di elaborazione e di analisi. Durante l'analisi del video catturato dati, quantificare le variabili di nuoto manualmente sarebbe stato molto tempo quindi l'uso di registrazioni di dati video e software di monitoraggio pesce fornito un modo più efficace ed efficiente per analizzare il comportamento di storione nuoto. Anche se la procedura ha evidenziato il nuoto comportamento di un pesce, la personalizzazione di altri organismi come anfibi e invertebrati acquatici richiederebbero semplici modifiche. A seconda di cosa Punto finale comportamentalets sono affrontati, sistemi di progettazione e di telecamere sperimentali possono essere sviluppate per l'utilizzo con qualsiasi pacchetto software di monitoraggio disponibile in commercio.

Il metodo è dimostrata utilizzando rame disciolto, ma è applicabile ad altri contaminanti o caratteristiche come la temperatura o il contenuto di ossigeno acquosi. I protocolli sviluppati e presentati in questo documento utilizzato un semplice videocamera digitale come dispositivo di registrazione. I file digitali possono essere facilmente trasferiti su un computer e caricati al software di analisi del movimento. I metodi sono costantemente modificato e perfezionato per semplificare il processo di quantificazione. È indispensabile che la qualità video sia in alta definizione in modo che il software di analisi per identificare ogni singolo pesce per il monitoraggio. Qualsiasi sfondo che non contrasta con il pesce può causare problemi quando si cerca di elaborare i file di dati. Un altro problema comune con due video tracking tridimensionale è individui che identificanoquando i percorsi si incrociano nuoto. Questo può essere corretto manualmente identificando ogni pesce durante la traversata percorso e che collega i segmenti di percorso all'interno del software. In alternativa, l'attività totale può essere determinata da ciascuna camera di replica come media gruppo. Diverse camere individuali con ognuno contenente un pesce possono essere girati nello stesso campo visivo per calcolare i movimenti di singoli pesci.

Attualmente abbiamo aggiornato per utilizzare una serie di telecamere di sorveglianza in testa sopra le camere di esposizione che sono collegati a un dispositivo di registrazione video digitale ad alta definizione (HD-DVR). Tuttavia, l'uso di qualsiasi sistema di telecamere in grado di registrare ad alta definizione MPEG-4 video funzionerà. L'HD-DVR può essere impostato per registrare in un momento specifico e programmato per un massimo di 7 giorni. Questo hands-off approccio automatizzato permette la cattura di diversi video contemporaneamente di mantenere la coerenza minimizzando disturbi esterni che potrebbero compromettere comportamento dei pesci. Il siste HD-DVRms sono collegati ad una rete interna così il trasferimento di file è relativamente semplice. Mentre il sistema di telecamere automatizzato è una tecnica molto migliorata per quantificare il comportamento di nuoto, è ancora utile per effettuare osservazioni visive per servire come informazioni di supporto aggiuntive per documentare deterioramento del comportamento durante i test di tossicità.

C'è una lunga storia della letteratura che documentano il comportamento dei pesci alterato derivante dall'esposizione a metalli risalenti ai primi anni del 1960 ^19,20,21. Il rame ha dimostrato di causare cambiamenti nei livelli di attività, come ipoattività a persico sole ²² (Lepomis macrochirus Rafinesque) e le variazioni delle locomotoria e l'attività di alimentazione della trota di ruscello ²³ (Salvelinus fontinalis). Almeno alcuni novellame contare sul loro senso dell'olfatto per rilevare ed evitare i predatori, e rame-indotta chemosensory privazione può avere un impatto comportamenti legati al rilevamento di sostanze chimiche di allarme ^24,25,26 . L'epitelio olfattivo è danneggiata a causa di esposizione di rame che ciò pregiudichi meccanismi sensoriali che potrebbe tradursi in disorientamento, evitamento del comportamento, l'alimentazione ridotta e tutti gli altri comportamenti che sono guidate da all'olfatto ^27. Questi comportamenti alterati erano coerenti con quanto osservato durante le esposizioni.

Il comportamento di nuoto di storione bianco è stato notevolmente influenzato durante l'esposizione subletale a concentrazioni di rame acquose .. Questi risultati illustrano come il comportamento è influenzato a concentrazioni subletali di rame e può essere usata come indicatore di stress tossici. L'analisi basato il video si è rivelato efficace nel quantificare il comportamento di nuoto e serviva anche come qualitativa documentazione visiva dei gravi impatti sulla storione esposti al rame. Il software di analisi è anche in grado di quantificare altri vari endpoint comportamentali. Si prega di fare riferimento alla Tabella 1 per una lista. Il sistema di esposizione può essere modificato per indirizzare ciascun endpointmodalità in tempo reale e può essere utilizzato per quantificare le differenze di comportamento associato all'esposizione a vari contaminanti di interesse.

L'uso di endpoint di comportamento nella ricerca tossicologica acquatico è sempre più impiegato e dovrebbe essere considerato al momento di valutare gli effetti dei contaminanti perché la funzione del comportamento adattivo è cruciale nella determinazione del danno ambientale ^9. Gli impatti dei contaminanti ambientali per il comportamento dei pesci è spesso soggettiva e impegnativo soprattutto quando si tratta di endpoint subletali in assenza di metodi standard ..

Nuoto attività quantificato utilizzando questi metodi possono essere rigorosamente monitorati, è non distruttivo con il minimo stress per l'organismo e può essere ripetuto. Nuoto comportamento è un indice valido e coerente di tossicità subletale che dovrebbe essere incorporato in protocolli di prova ad ampliare la sensibilità dei test di tossicità standard di ^5.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
copper II sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich		contaminant of concern
syringe dispenser	Hamilton MicroLab 600 Series		apparatus to spike chemical
2 L volumetric flask			container for holding stock solution
24-1.5 L glass jars			test chamber for 2 dph sturgeon
video camera	Sony Handycam HDR-CX550V
digital tracking software	Noldus Ethovision
3-17" flat screen monitors
24 surveillance cameras	Model CL101
3-16 channel digital recording devices
DO meter	YSI
pH meter	Orion 940
ph probe	Orion
ammonia meter
ammonia probe	Orion
chiller unit
recirculating water pump