Quantifizieren Fisch Schwimmverhalten in Reaktion auf akute Exposition von wässrigen Kupfer Form von computergestützten Video und digitale Bildanalyse

Zusammenfassung

Die Messung der Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf Fischverhalten ist oft subjektiv und eine Herausforderung vor allem, wenn mit subletalen Endpunkten zu tun haben. Wir beschreiben Methoden , einschließlich Videotechnik Schwimmverhalten der frühen Lebensphase weißen Stör (Acipenser transmontanus) während und nach 96 Stunden akute Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Kupfer zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.

Einleitung

Zu verstehen, wie Schadstoffbelastung Verhalten beeinflussen kann manchmal sehr schwierig und subjektiv. Verhalten wird typischerweise als eine Reihe von manifesten, beobachtbar, Ganzkörper-Aktivitäten definiert, die durch das zentrale Nervensystem betreiben und einen Organismus ermöglichen, zu überleben, zu wachsen und sich vermehren. Verhaltensänderungen aufgrund der Exposition zu einer toxicant gehören zu den sensibelsten Indikatoren für Umweltstress oft zwischen 10-100 - mal empfindlicher als im Vergleich zum Überleben ^1. Die meisten dieser Studien untersuchten Schwimmaktivität, Belüftung und Verhalten der Fische ^2,3,4 Nahrungssuche. Aktivität Schwimmen ist die am häufigsten verwendete subletalen Endpunkt in ⁵ eine Verhaltensänderung in Reaktion auf eine Verunreinigung in Toxizitätstests zu bestimmen. Schwimmen Variablen umfassen die Häufigkeit und Dauer der Bewegung, Geschwindigkeit und zurückgelegte Strecke, die Frequenz und die Winkel der Drehungen, die Position in der Wassersäule und das Muster des Schwimmens. Schwimmen Aktivitäteine wirksame Maßnahme der Schwimmverhalten , wenn die Empfindlichkeit auf einen toxicant über die Kriterien vorgeschlagen in Kapitel 9 von Rand ⁶ in dem Buch Fundamentals of Aquatic Toxicology Basis der Bewertung.

Dieser Beitrag stellt eine toxikologische Untersuchung als ein Beispiel dafür , wie die Toxizität von Kupfer zu Frühstadium von weißen Stör (Acipenser transmontanus) in verschiedenen Stadien der frühen Entwicklung in wasser nur der Engagements Schwimmverhalten zu Stör wurde ausgewertet und stellt Methoden zum Schwimmen Quantifizierung Verhalten.

In früheren Studien waren die Nebenverhaltensreaktionen offensichtlich mit frühem Beginn in den ersten Tagen der akuten und chronischen Exposition gegenüber Kupfer und wurde immer schwerer über Expositionsdauer und Konzentration ^7.8.9. Die Größe und der Zeitpunkt des Beginns dieser Verhaltensreaktionen sind wahrscheinlich ausreichend langfristige Überleben zu begrenzen und somit bedenklich sind angesichts der Auswirkungen auf recruitment Ausfall ^10. Um wurden die Bedeutung dieser Empfindlichkeit gegenüber Metallexposition Methoden und Verfahren, um genau zu interpretieren zur Quantifizierung der zeitlichen Verlauf und Ausmaß von Verhaltensstörungen in Bezug auf Kupferkonzentrationen entwickelt.

Testprotokolle für die Verhaltensfunktion und Entwicklung wurden durch die Analyse von Überkopfvideoproben von Stör in Expositionskammern hergestellt. Die Videoproben qualitative Bewertung der Entwicklung und Funktion unter Kupfer-Behandlungen in der gesamten Belichtungszeit zur Verfügung gestellt. Verhalten und Schutz suchenden Aktivität wurden bei Expositionen gegenüber wässrigen Kupferkonzentrationen ausgewertet, um die Zeit zu bestimmen, zu bewirken und die zeitliche Abfolge der Beeinträchtigung zu charakterisieren, die Zuflucht such betrifft, Lethargie, Schwimmen Koordination, Gleichgewicht und Atmung. Darüber hinaus wurden Videoaufnahmen von Stör aus jeder unterabgetasteten replizieren zum Zwecke der quantitativ zu dokumentieren spontane Schwimmen aktivität. Diese Endpunkte umfassten Maßnahmen von Dauer oder die Zeit bewegen, Schwimmen Geschwindigkeit und Distanz ^5,11 gereist eines im Handel erhältlichen digitalen Bildanalyse - Software - Paket. Diese Software definiert den Umriss jedes Bild innerhalb eines Sichtfeldes und von diesem, definiert den Schwerpunkt für jedes Bild. Die Software kann in einem Frame für Frame nacheinander bestimmen die Wege der Bewegung der Position jedes Schwerpunktverfolgungs.

Diese Studie mit allen anwendbaren Abschnitten der Schlussregeln der Tierschutzgesetz Vorschriften (9 CFR) und mit allen institutionellen Richtlinien für die humane Behandlung der Testorganismen während der Kultur und des Experimentierens halten. Nach Beendigung der Studie wurden alle Fische nach entsprechenden Richtlinien eingeschläfert wie von der Institutional Animal Care und Use Committee für die US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center genehmigt.

Protokoll

1. Setup-Diluter für Larval Stör Exposition gegenüber wässrigen Kupferkonzentrationen

1. Richten Sie Forderungen , die einen Durchflusssystem wie einem modifizierten Berg und Brungs ¹² Diluters System folgende Richtlinien der ASTM International ^13,14,15 verwenden.
2. Wählen Sie 25 ug / L als hohe Kupferkonzentration auf der Grundlage früherer Prüfergebnisse, mit denen Effekte etwa 4-6 ug / l beobachtet. Verwenden Sie Reagenzqualität Kupfer II-Sulfat-Pentahydrat (> 98% Reinheit) und eine Teststammlösung mischen.
   HINWEIS: Beispiel Konzentrationsreihe für die Forderungen sind 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,0625 und 0 ug / l. Unter Verwendung von 50% Verdünnungsreihen, beginnend mit 25 ug / l als die hohe Konzentration wird eine Reihe von Konzentrationen beobachtet Zielverhaltens Beeinträchtigung verursachen.
3. Bereiten Sie die Test-Stammlösung in einem Messkolben 48 Stunden vor dem Beginn der Belichtung und auf liefern die Diluters Mischkammer mit einem Spikeautomatische Spritze Spender.
4. Verwenden Sie eine Tabellenvorlage das Gewicht der Chemikalie zu bestimmen, auf 1 l entsalztem Wasser hinzugefügt werden, die in 25 & mgr; g / l Kupferkonzentration, wenn Diluters Mischkammer mit 1 ml der Teststammlösung versetzt wird zur Folge haben wird.
   HINWEIS: 1 zeigt ein Beispiel einer Tabellenvorlage für chemische Stoffaufbereitung für Tests Dilutor Toxizität.
5. Man wiegt 195 mg analysenreines Kupfer II-Sulfat-Pentahydrat einer Analysenwaage mit abgemessen und in einen 1-Liter-Messkolben und mischen mit 1 l VE-Wasser für eine Stammkonzentration von 48,65 mg / L.
6. Legen Sie das Ansaugrohr aus dem automatisierten Spritzenspender in die Teststammlösung und stellen Sie den Spike-Volumen auf 1 ml und drehen Sie den Diluters auf mit dem Netzschalter Spiegeln und lassen Zyklus für 48 Stunden erlauben es auf die entsprechende Kupferkonzentration vor dem Strumpf äquilibrieren Stör.
7. Bringen Sie eine Inline-4-Wege-Stromteiler 16 an jede Förderleitung Wasserfluss zu jedem der vier Wiederholungsexpositionskammern im Diluters Wasserbad zu partitionieren. Gravity füttern das Wasser. Zyklus das Wasser durch die Verdünnungsvorrichtung, wenn die Stromversorgung des Verdünners einschaltet und ein Magnetventil geöffnet wird, so dass Wasser in den Verdünnungsbehälter zu fließen. Stellen Sie Kühleinheit auf 15 ° C an und schalten Sie Wasserpumpe Wasser im Verdünnungs Wasserbad zu zirkulieren.
   Hinweis: Dieser Vorgang durch die Verwendung eines automatisierten Timer geregelt wird.
8. Stellen Sie den Verdünner zu Zyklus alle 30 Minuten den automatischen Timer und 250 ml Testwasser mit jedem Zyklus zu liefern, was zu 12 Volumenzugaben pro Tag zu jeder replizieren Prüfkammer.
9. Wählen Sie Belichtungs Prüfkammern auf die Größe des Stör basierend auf akzeptable Laderate aufrechtzuerhalten, die <10 g Fisch Nassgewicht / L in jeder Kammer zu einem bestimmten Zeitpunkt. Zum Beispiel Aufnahmen mit 30 Tage-post-Luke (DPH) weiß Stör (durchschnittliche Gewicht in Gramm 0,17 g) verwenden, um durchzuführen 12 x21,5 cm ² Gläser mit einem 4 cm großes Loch in der Seite. Decken Sie diese Seite mit einem 30 Mikron Maschen Sieb aus rostfreiem Stahl für die Strömung durch des Testwassers zu ermöglichen. Das Volumen des Testwassers in den Expositions Gläser 1 L.
10. Unter Verwendung einer 50 ml Plastikspritze nehmen zwei replicate 50 ml Wasserproben bei jeder Konzentration für insgesamt 12 Proben und Testwasser in 100 ml Glasbecher verzichten und Messung von gelöstem Sauerstoff (DO), Temperatur, Leitfähigkeit, pH, Alkalinität, Härte, Gesamt Ammoniak, großen Kationen, großen Anionen und gelösten organischen Kohlenstoff mit handelsüblichen Geräten und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Proben sollten bei Beginn und Ende der Exposition entnommen werden.
11. So sammeln Teilproben für die chemische Analyse, verwenden Sie eine 25 ml Plastikspritze, ziehen bis etwa 24 ml Testwasser aus den Expositionskammern eine sipper Stroh auf die Spritze statt einer Nadel befestigt werden.
12. Entfernen Sie die sipper Stroh aus dem syRinge und legen Sie eine Polypropylen-Filterpatronengehäuse einen 0,45 um Porengröße, Polyethersulfon-Membran auf der Plastikspritze.
13. Drücken Sie 4 ml Testwasser durch den Filter und entsorgen.
14. Verzichtet werden die restlichen 20 ml Testwasser durch den Filter in ein Säurereinigten Polyethylen-Flasche und säuert bis 1% Volumen / Volumen mit hoher Reinheit, 16 M Salpetersäure für die Speicherung von bis zu 3 Monaten.
    HINWEIS: Die Proben für die chemische Analyse sollte bei Beginn, Mitte und Ende der Exposition genommen werden Kupferkonzentrationen zu bestätigen.
15. Führen Sie die chemische Analyse mit induktiv gekoppelter Plasma - Massenspektrometrie unter Verwendung von folgenden US Environmental Protection Agency Method 6020A ¹⁷
16. Nach der Einnahme von allen Wasserproben und die Diluters ist das Radfahren, Lager 10 (random, planlos) Stör in jeder replizieren Prüfkammer. Sammeln Sie die Stör aus dem Kulturbehälter, wo sie ein kleines Gitter nicht abrasiv Netz untergebracht sind, verwendet wird. Platzieren Sie Stör in einem kleinen bucket mit Kultur Wasser. Insgesamt 240 Fische werden benötigt, um die Belichtung zu starten.
17. Sie füttern die Fische während der Belichtung nicht.
    HINWEIS: Beachten Sie 1 für eine visuelle Einrichtung des Diluters Layout Abbildung.
18. Lesen Sie den Test jeden Tag für die Dauer der Exposition und Rekordfischsterblichkeit und überwachen Verhalten schwimmen.
    HINWEIS: Weitere Endpunkte zu suchen sind Lethargie, Verlust des Gleichgewichts, Veränderungen der Atmung, Veränderungen in der Pigmentierung, Position Fische sind in der Wassersäule, versteckt Aktivität und andere Anomalien , die visuell identifiziert werden kann.
    HINWEIS: Lesen Sie den Test zur gleichen Zeit jeden Tag für Konsistenz.
19. Messen und zu quantifizieren Schwimmaktivität (Zeit Fisch verbrachte bewegen, die Geschwindigkeit und der Abstand bewegt) einen im Handel erhältlichen digitalen Tracking-Software-Programm.

2. Beobachtungen und die Mortalität während der Belichtung

1. jeden Test ch SichtprüfungBernstein und Mitteilungs Sterblichkeit und Beobachtungen von abnormalem Verhalten eines Verhaltenscheckliste (Tabelle 1) auf die Datenblätter etwa zur gleichen Zeit täglich während der 96 Stunden Belichtung, vorzugsweise am Morgen mit.
   HINWEIS: Behaviors , die auffallend sind, untypisch, subjektiv, qualitativ verschieden von den Kontrollen abnormal angesehen werden. Optimal ist der Beobachter keine Ahnung von den Behandlungen.
   HINWEIS: Die Gleichgewichtsverlust wird als die Unfähigkeit der Fisch definiert eine aufrechte Position in der Wassersäule und Unbeweglichkeit ist definiert als die Unfähigkeit der Fische zu halten , es sei denn prodded zu bewegen oder zu schwimmen. Andere Anomalien wie Lethargie, Hyperaktivität, erhöht oder vermindert sich bei der Atmung, Farbveränderungen, Zittern, Krämpfe, aufgeblähten Bäuchen, Position in der Wassersäule und andere Auffälligkeiten Schwimmen Muster sollte auch auf dem Datenblatt aufgezeichnet werden.
   HINWEIS: Siehe Video 1 für Beispiele von abnormenVerhalten.
2. Die Bilanz und entfernen Sie täglich toten Stör.
3. Mit messen eine Hand Gelöster Sauerstoff (DO) Gerät mit Sonde den gelösten Sauerstoff in situ und Rekordwassertemperatur in zwei Wiederholungen jeder Expositionskonzentration und Aufzeichnung auf dem Datenblatt.

3. Videotaping Schwimmen Aktivität

1. Verarbeitet Videodatenproben eine Handvideokamera montiert auf einem Stativ direkt über der Prüfkammer positioniert Verhaltensauffälligkeiten zu dokumentieren.
2. Um Schwimmaktivität zu quantifizieren, schneiden Sie ein Stück PVC - Rohr 13 cm Durchmesser und 13 cm groß zu verwenden , wie der Test - Arena (Abbildung 1). Legen Sie die PVC-Rohr in der Diluters innerhalb jeder entsprechenden Kupferkonzentration Exposition Tanks. Verwenden Sie den Bereich innerhalb des PVC-Rohr als Test Arena, wie diese groß genug ist, Stör, sich frei zu schwimmen.
3. Am Ende der 96 Stunden Belichtung, unterabzutasten zufällig 5 überlebenden Stör aus jeder Kupfer concentration für Schwimmaktivität zu messen und sie in dem Test-Arena ein kleines Mesh-Netz verwendet wird.
   HINWEIS: In den höheren Testkonzentrationen wo Stör Sterblichkeit weit verbreitet war, sollten alle verbleibenden überlebenden Stör verwendet werden Schwimmaktivität zu messen und in manchen Fällen weniger als 5 sein.
4. Nach dem Einlegen der Fische in dem Test-Arena, lassen Sie den Fisch für einen Zeitraum von 30 min zu akklimatisieren.
   HINWEIS: Erfolgreich, fehlerfreie Auswertung des Video erfordert ein kontrastreiches Bild des Fisches vor einem Hintergrund mit einem Minimum an Struktur, die das Bild des Fisches verschleiern oder zu verbergen könnte. Das Bild der Fische in einem guten Fokus sein muss und Wasser zu bewegen aufgrund frei von Oberflächenblendung oder frei von Verzerrungen sein, so muss das Diluters System ausgeschaltet werden.
5. Nach 30 Minuten, schalten Sie die Kamera ein und auf REC die Schwimmaktivität für einen Zeitraum von 2 min zu erfassen.
6. Euthanize die Fische nach dem die Videoaufnahmen nehmen, zu bestimmen,haltens.
7. Platzieren Sie Stör in einer konzentrierten Lösung von Tricaine methansulfonat (MS222) Wasser für mindestens 10 Minuten für die Einstellung der opercularen Bewegung zu ermöglichen.
   HINWEIS: Eine Konzentration von mindestens 250 mg / l empfohlen und könnte viel höher für bestimmte Arten sein.
8. Legen Sie die eingeschläfert Stör in einem Kunststoff-Zip-Lock-Beutel und in den Gefrierschrank zur Entsorgung zu einem späteren Zeitpunkt. Schalten Sie die Kamera aus und übertragen alle Video-Dateien auf einen Computer für die Nachbearbeitung mit digitalen Tracking-Software.

4. Maßnahmen der Schwimmaktivität von Video-Wiedergabe

1. Suchen Sie die Datenblatt und Videodateien für das Experiment analysiert werden. Konvertieren von Videodateien in ein kompatibles Format die digitale Analyse-Software verarbeiten kann.
2. Laden Sie alle Dateien in Software verarbeitet werden. Öffnen Sie Tracking-Software auf das Symbol anklicken. Klicken Sie auf das "Neue Standardexperiment" unter "Erstellen Sie ein neues Experiment" option auf dem Hauptbildschirm.
3. Geben Sie den Namen für das Experiment in "New Experiment" Dialogfeld, das auf dem Bildschirm erscheint. Stadt wählen Experiment Datei gespeichert werden soll. Klicken Sie auf "OK". Wählen Sie "Experiment Settings" Option unter "Setup" .Wählen "von Video-Datei" unter "Video Source".
4. Wählen Sie "1" für "Anzahl der Arenen". Wählen Sie "3" für "Anzahl der Probanden pro Arena". Wählen Sie "Mitte-Punkt-Erkennung" unter "Raupen Features". Wählen Sie die gewünschte Einheiten.
5. Wählen Sie "Testliste" unter "Setup". Klicken Sie auf "Add Videos" an der Spitze der Bildschirm. Wählen Sie "Alphabetische Reihenfolge" unter "Sortierung" Option auf "Add Videos" Dialogfeld, das auf dem Bildschirm erscheint. Klicken Sie auf "Durchsuchen". Navigieren Sie zum Ordner, wo Video-Dateien befinden.
6. Markieren Sie alle Video-Dateien. Klicken Sie auf "Öffnen". Klicken Sie auf "Variable hinzufügen" an der Spitze der Bildschirm. Geben Sie "Konzentration" in "Label "ein. Geben Sie" Kupfer-Konzentration in Mikrogramm / L "in" Beschreibung "ein.
7. Wählen Sie "Numerische" aus der Dropdown-Liste für "Typ". Klicken Sie auf "Vordefinierte Werte" -Box. Wählen Sie "definieren Einzelwerte" Option in der "vordefinieren Numerische Werte" im Dialogfeld, das angezeigt wird.
8. Geben Sie "0", "3", "6", "13", "25" und "50" in "Vordefinierte Value" Raum. Klicken Sie auf "Hinzufügen >>" zwischen jeder Nummer Zusatz. Deaktivieren Sie die Option Option "andere Werte zulassen". Klicken Sie auf "OK".
9. Wählen Sie "Trial" aus der Dropdown-Menü in "Scope" -Box. Geben Sie geeignete Konzentration für jeden Versuch in Kisten zur Verfügung gestellt. Klicken Sie auf "Variable hinzufügen" an der Spitze der Bildschirm. Geben Sie "Replizieren" in "Label" -Box. Geben Sie "Replizieren Nummer" in "Beschreibung" ein. Wählen Sie "Numerische" aus der Dropdown-Liste für "Typ".
10. Klicken Sie auf "Pneu definierten Werte "ein. Wählen Sie" Einzelwerte "Option in der" numerischen Werte vordefinieren definieren "im Dialogfeld. Geben Sie" 1 "," 2 "," 3 "und" 4 "in" Vordefinierte Value "Raum. Klicken Sie auf" Hinzufügen >> "zwischen jeder Nummer Zusatz. Deaktivieren Sie die Option" Allow andere Werte "option.Click" OK ".
11. Wählen Sie "Trial" aus der Dropdown-Menü in "Scope" -Box. Geben Sie die entsprechenden Wiederholungszahl für jeden Versuch in Kisten zur Verfügung gestellt. Wählen Sie "Arena-Einstellungen" unter "Setup" -Reiter am oberen Bildschirmrand. Name des ersten Einstellung "Versuch 1". Klicken Sie auf "Grab Hintergrundbild" aus "Arena-Einstellungen (Versuch 1)" im Dialogfeld.
12. Klicken Sie auf "Durchsuchen" auf dem "Grab Hintergrundbild" im Dialogfeld. Suchen Video-Datei für Versuch 1 und klicken Sie auf "Öffnen". Klicken Sie auf "Grab" Option im "Grab Hintergrundbild" im Dialogfeld nach Video erscheint. Klicken Sie auf den weißen Kreis-Symbol in der Nähe von oben auf dem Bildschirm under "Arena Settings".
13. Manipulieren Kreis, so zeigt sich, dass gesamte Badebereich im Kreis umschlossen ist. Hatch Markierungen erscheinen, wo die Arena Bereich definiert ist. Klicken Sie auf "Calibration Scale" Symbol in der Nähe von oben auf dem Bildschirm unter "Arena Settings". Ein Linksklick auf einen Rand der Arena. Halten und ziehen die Maus über das zu entgegengesetzten Ende der Arena. Lassen Sie der linken Maustaste.
14. Geben Sie "10.5" in der "realen Welt Abstand" Box in der "Calibration Distance" Dialogfenster, das erscheint. Klicken Sie auf "OK". Falls erforderlich, Kalibrierungslinie anzupassen, so dass es den gesamten Durchmesser der kreisförmigen Arena erstreckt.
15. Klicken Sie auf "Validate Arena Einstellungen" die Option "Arena-Einstellungen (Versuch 1) Das Dialogfeld". Adresse keine Probleme, wenn die Einstellungen nicht überprüft werden. Rechtsklick auf "Arena-Einstellungen" unter "Setup" aus der Symbolleiste "Experiment Explorer" auf dem Bildschirm nach links und wählen Sie "Neu" aus dem Menü.
16. Wiederholen Sie die Schritte 4,11-4,15 bis Arena Einstellungen have wurde für jeden Versuch erstellt. Achten Sie darauf, die entsprechende Videodatei für jeden Versuch zu wählen. Wählen Sie "Erkennungseinstellungen" unter "Setup" aus dem "Experiment Explorer" in der Symbolleiste auf dem Bildschirm nach links.
17. Wählen Sie "Dynamic Subtraction" von Drop-Down-Menü unter "Methode" in der "Erkennungseinstellungen: Erkennung Einstellungen 1" Dialogbox, die unterschiedliche Füllfarben für jedes Thema unter "Betreff Identification" in der appears.Choose "Erkennungseinstellungen: Erkennung Einstellungen 1" Dialog Box.
18. Wählen Sie "Select Video" und suchen Sie Video für Test 1.Click "Open" .Select "5,9941" von "Sample-Rate" Box unter "Video" in der "Erkennungseinstellungen: Erkennung Einstellungen 1" Dialogfeld. Klicken Sie auf "Einstellungen" für die "Referenzbild" Option unter "Detection" in der "Erkennungseinstellungen: Erkennung Einstellungen 1" Dialogfeld.
19. Klicken Sie auf "Start Lernen (C)4; Option in der "Referenzbild" Dialog box.Wait für Programm Referenzbild zu lernen. Sobald das Bild in "Referenzbild" Dialogbox ohne Tiere angezeigt wird, klicken Sie auf "Verwenden Sie dynamische Referenzbild" unter "Acquisition Einstellungen" im Dialogfeld.
20. Klicken Sie auf "Schließen". Wählen Sie "Darker" aus dem Drop-Down-Menü für "Betreff ist" unter "Detection" in der "Erkennungseinstellungen: Erkennung Einstellungen 1" Dialogfeld. Stellen kleinere Zahl auf "33" und größere Anzahl an "153" für "Dunkel-Kontrast" unter "Detection" "Erkennungseinstellungen: Erkennung Einstellungen 1" Dialogfeld.
21. Klicken Sie auf "Änderungen speichern" unten rechts "Detektions Einstellungen: Erkennungseinstellungen 1" Dialogfeld. Klicken Sie auf die Play-Taste auf der "Playback Control" Dialogfenster und bestätigen, dass die Software erfolgreich Tiere verfolgt wie auf Schatten oder Schmutz entgegen. Passen Sie Zahlen für "Dark contrast ", wie notwendig.
22. Sobald Tracking geeignet ist, klicken Sie auf "Änderungen speichern" unten rechts "Detektions Einstellungen: Erkennungseinstellungen 1" Dialogfeld. Wählen Sie "Acquisition" unter "Setup" aus dem "Experiment Explorer" in der Symbolleiste auf dem Bildschirm nach links.
23. Klicken Sie auf "Track nächste geplante Studie" in der "Acquisition Settings" Dialogfeld. Bestätigen Sie die richtige Studie, Video und Arena Einstellung unter "Einstellungen" wird im "Acquisition Settings" Dialogfeld.
24. Überprüfen Sie die "Erkennung bestimmt Geschwindigkeit" Option in der "Acquisition Control" Dialogfeld. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem grünen Kreis eingeschlossen in einem weißen Quadrat den Akquisitionsprozess zu beginnen. Wiederholen Sie die Schritte 4,22-4,23, bis alle Versuche verfolgt wurden.
25. Klicken Sie auf "Data Profile" unter "Analyse" Option in der Symbolleiste "Experiment Explorer" auf der linken Seite von screen.Choose "Time" unter "Nesting" option in der "Komponenten" in der Symbolleiste. Stellen Sie "An" auf "00.02.00" unter dem "Select Track Zeitintervall" Überschrift in der "Zeit" Dialogfeld. Klicken Sie auf "OK".
26. Ziehen Sie das "Nest" Feld zwischen dem "Start" Feld und die "1" in der Gruppe "Datenprofile" Bereich auf der rechten Seite des Bildschirms. Klicken Sie auf "Analysis Profil" unter der "Analyse" Option in der Symbolleiste "Experiment Explorer" auf dem Bildschirm nach links. Klicken Sie auf "Geschwindigkeit" im Rahmen der "Entfernung und Zeit" Überschrift in der "abhängigen Variablen" Symbolleiste, die angezeigt wird.
27. Klicken Sie auf "Hinzufügen", auf dem "Velocity" Dialogfeld. Klicken Sie unter dem "Abstand und Zeit" "Entfernung bewegt" in der "abhängigen Variablen" Symbolleiste Überschrift. Klicken Sie auf "Hinzufügen" auf der "Entfernung bewegt" Dialogfeld. Klicken Sie auf "Bewegung" im Rahmen der "individuellen Verhalten" Überschrift in der "abhängigen Variablen" toolbar.
28. Stellen Sie "Averaging Intervall" auf "1" unter dem "Ausreißer Filter" Überschrift in der "Bewegung" Dialogfeld. Stellen Sie "Startgeschwindigkeit" auf "2,00" und "Stop Geschwindigkeit" auf "1.75" unter dem "Threshold" Überschrift in der "Bewegung" Dialogfeld.
29. Überprüfen Sie beide Boxen für "Moving" und unter den "Berechnen Statistiken für" "Nicht bewegen" in der "Bewegung" Dialogfeld Überschrift. Klicken Sie auf "Hinzufügen" am unteren Rand der "Bewegung" Dialogfeld. Klicken Sie auf "Analysis Output" unter "Ergebnisse" Option in der Symbolleiste "Experiment Explorer" auf dem Bildschirm nach links. Klicken Sie auf "Berechnen" an der Spitze der Bildschirm.
30. Sobald abhängigen Variablen berechnet werden, klicken Sie auf "Export" an der Spitze der Bildschirm. Wählen Sie den Zielordner in "Export Analysis Output" Dialogfeld. Wählen Sie "Excel" aus "Dateityp" Drop-Down-Menü in der "Export Analysis Output "Dialogfeld. Klicken Sie auf" OK ".
31. Klicken Sie auf "Save Experiment" unter der Registerkarte "Datei" am oberen Rand des Bildschirms. Schließen Sie die digitalen Tracking-Software. Importieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei und analysieren, um eine kommerzielle statistische Analyse-Software-Paket.

Ergebnisse

Manuelle Verarbeitung zeigte die visuellen Beobachtungsdaten Prozent mit steigender Kupferkonzentration erhöht Anomalien nach nur 72 Stunden der Exposition mit 2 Tage nach dem Schlüpfen (DPH) Stör (Abbildung 2) eingeleitet. Die Videoproben dokumentiert die extreme Auswirkungen von Kupfer-Exposition auf die Stör Schwimmverhalten (Video 2) und bei der Festlegung der Verhaltens Beeinträchtigung als Folge unterstützt. In einem anderen Beispiel Stör bei 30 dph erwies sich als empfindlich gegenüber Kupfer Exposition mit einer 96 h mittlere letale Wirkung Konzentration (LC50) von 40,3 g / l, bezogen auf die Mortalität nur. Wenn jedoch subletalen Verhaltensendpunkte der Verlust des Gleichgewichts und der Immobilisierung werden zusammen mit der Sterblichkeit nimmt die Empfindlichkeit mit einem geschätzten 96 Stunden Median-Effekt-Konzentration enthalten (EC50) im Bereich von 2,4 bis 5,0 g / L. Videodokumentation erfasst diese subletale Effekte und weitere validiert menschlichen Beobachtungen von Verhaltensauffälligkeiten aufgezeichnetwährend der Belichtung. Die Verwendung von digitalen Tracking-Software deutlich reduziert die Nachbearbeitung Zeit, als Schwimmaktivität zu analysieren. Fische schwimmen Geschwindigkeit, verbrachte die Zeit zu bewegen, und die zurückgelegte Strecke alle deutlich zurückgegangen (Abbildung 3) mit zunehmender Kupferkonzentration. Schwimmwege wurden ebenfalls mit zunehmender Kupferkonzentration (Abbildung 4) reduziert.

Abbildung 1:.. Computer - Screenshot einer Tabellenvorlage verwendet , um Test - Stammlösung Konzentration bestimmen Chemische Stoffaufbereitung für die Diluters Toxizitätstests wurde unter Verwendung eines Tabellenvorlage bestimmt basierend auf einer Zielkonzentration Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2:. Diluter Setup und experimentelles Design Verschiedene Lebensphasen der weißen Stör wurden Kupfer ausgesetzt. Die Größe des Verdünners für die Belichtungen verwendet wurde, basierend auf der Größe des Fisches ausgewählt. (A) Frühstadium von Stör wurden mit einem kleinen Diluters Setup ausgesetzt und (b) ältere Lebensphasen Stör wurden mit einem großen Diluters Setup ausgesetzt.

Abbildung 3: Schwimmverhalten resultiert aus einem Frühstadium von weißen Stör (Acipenser transmontanus) 72 Stunden Kupfer Exposition (beginnend mit 30 Tage nach dem Schlüpfen [dph] Fisch). Schwimmen Aktivität Endpunkte (a) die Dauer der Bewegung unter 30 dph weißen Stör; (B) Geschwindigkeit des Schwimmens; und (c ) Abstand bewegt sank mit 96 h ausgesetzt Kupferkonzentration unter weißen Stör zu erhöhen. Asterisk zeigt signifikanten Unterschied von der Kontrolle, Fehlerbalken stellen die Standardabweichung.

Abbildung 4: Ergebnisse von einem frühen Lebensstadium weißen Stör (Acipenser transmontanus) 96 Stunden Kupfer Exposition (beginnend mit 2 Tage nach dem Schlüpfen [dph] Fisch) Surviving weißen Stör bei 2 dph ausstellenden Verlust des Gleichgewichts und der Immobilisierung nach 72 h ein. 96 Stunden Belichtung mit Kupferkonzentration zu erhöhen. Asterisk zeigt signifikanten Unterschied von der Kontrolle, Fehlerbalken stellen die Standardabweichung.

Abbildung 5: Beispiel Schwimm Weg ergibt sich aus einer frühen Lebensstadium weißen Stör (Acipenser TRANSMOntanus) 96 Stunden Kupfer Exposition (starrt mit 30 Tage nach dem Schlüpfen [dph] Fisch). Schwimmen Wege von Stör mit digitalisierten digitalen Tracking - Software aus (a) Kontrollreplikat (n = 5 Fisch) und (b) von einer hohen Behandlung (50 ug / l) Wiederholung (n = 3 Fisch) nach einer 96 Stunden Exposition. Notieren Sie die Anzahl der Schwimmbahnen nicht die Anzahl der Fische in der Kammer dar , weil einige Fische inaktiv waren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

quantifizierbare Parameter	Beobachtende Parameter
Geschwindigkeit	Lethargie / Hyperaktivitäts
Entfernung bewegt	Der Verlust des Gleichgewichts
Dauer der Zeit, in der Zone ausgegeben	Spasmen / Zittern / Kopfnach unten
Zone Übergangs Anzahl der Male Organismus bewegt sich zwischen ausgewählten Zonen	Position in der Wassersäule
Unterwegs zu punkt berechnet die Abweichung von dem Weg des Tieres zu einem Point of Interest	Respiration (schnell / langsam)
Überschrift berechnet die Überschrift der ausgewählten Körperstelle	Färbung
Drehwinkel-Differenz in der Position zwischen zwei Proben	Ausblenden
Winkelgeschwindigkeit berechnet, indem der Drehwinkel durch die Probenintervall dividiert
Meander-berechnet, indem der Drehwinkel dividiert durch den Abstand bewegt. Verwendet in den Tieren zu vergleichen drehen sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen
Die Zeit, zu bewegen
Mobilitätszustand-berechnet die Dauer, für die die gesamte Fläche als Tier detektiert verändert sich, selbst wenn der center Punkt bleibt gleich
Rotations eine Umdrehung beendet ist, wenn der ausgewählte Körperstelle einen kumulativen Drehwinkel von 360 ° aufweist. Dreht sich in die entgegengesetzte Richtung von weniger als der Schwellenwert sind, ignoriert.
Mobilitäts kontinuierlichen berechnet den Prozentsatz von Mobilität für den gesamten Bereich des Tieres erfasst wird, selbst wenn der Mittelpunkt gleich bleibt.
Die Entfernung zwischen den Themen-berechnet Distanz zwischen allen Akteuren und den ausgewählten Empfängern
Proximity-berechnet die Dauer, für die der Schauspieler ist oder nicht in der Nähe des Empfängers
Relative Bewegung
Net gewichtete Bewegungs Die Bewegung des Schauspieler (positiv) und von (negativen) der Empfänger, um den Abstand zwischen ihnen gewichtet
Die gewichteten Bewegung von-moveme nt des Aktors von dem Empfänger, um den Abstand zwischen ihnen gewichtet.
Gewichtete Bewegung to- Bewegung des Darstellers zu dem Empfänger, um den Abstand zwischen ihnen gewichtet
Teststeuerrechnung Zeitraum zwischen zwei Ereignissen der Elemente Teststeuerung oder innerhalb eines Elements
Teststeuerung Ereignis-Moment, in dem ein Ereignis innerhalb eines Elements Sie in Teststeuerung definiert haben auftritt.

Tabelle 1:. Verhaltensendpunkte quantifiziert durch digitale Tracking - Software Diese Endpunkte können auf Einzelpersonen oder Gruppen verwendet werden und auch als Liste für die visuelle Beobachtung Kontrollen von Verhaltens Beeinträchtigung während der Belichtung dienen.

/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> Video . 1: Visuelle Definition von abnormalem Verhalten von betroffenen weißen Stör ausgestellt (Rechtsklick zum Download) Eine tägliche Beobachtungscheckliste verwendet wurde , Anomalien zu dokumentieren Der. Verlust des Gleichgewichts und der Immobilisierung waren die am häufigsten während der Expositionen beobachtet Anomalien. Geändert von Calfee et al. ⁷

Video 2: Visuelle Dokumentation ein Beispiel für weißen Stör Schwimmverhalten hervorheben. (Rechtsklick zum Download) Weiße Stör Schwimmaktivität wurde stark reduziert mit der Exposition gegenüber steigenden Kupferkonzentration. Der Stör in diesem Video dargestellt sind von einer Steuer, mittel gering und eine hohe Behandlung am Ende einer 96 h wässrigen KupferBelichtung. Obwohl die weißen Stör noch am Leben waren, ist es der Fisch offensichtlich stark in den Vergleich zu den Kontrollen Behandlungen beeinträchtigt wurden. Geändert von Calfee et al. ⁷

Diskussion

Verhaltensänderungen aufgrund der Exposition gegen Verunreinigung häufig als Endpunkt für die subletale Toxizität verwendet, kann aber schwierig sein, zu messen. Im Allgemeinen werden Verhalten Antworten durch visuelle Beobachtungen und manuelle Datenanalyse gemessen, die sehr viel Zeit erfordert, zu verarbeiten. Allerdings Technologie mit fortschreitendem haben Methoden zur Quantifizierung von Schwimmaktivität konzentrierte sich auf mit Videografie ¹⁸ und Bewegungsanalyse oder digitale Tracking - Software , die die Verarbeitung und Analyse Zeit reduziert. Bei der Analyse der Video erfassten Daten, Quantifizierung Schwimmen Variablen manuell sehr zeitaufwendig gewesen wäre, so die Verwendung von Videodaten Aufnahmen und Fisch-Tracking-Software, eine effektive und effiziente Möglichkeit zur Analyse von Stör Schwimmverhalten zur Verfügung gestellt. Obwohl das Verfahren hervorgehoben Verhalten eines Fisches schwimmen, für andere Organismen, wie Amphibien und wirbellose Wasser Anpassung würden einfache Modifikationen erfordern. Je nachdem, was Verhaltens Endpunts werden adressiert, experimentelles Design und Kamerasysteme können mit fast jedem handelsüblichen Tracking-Software-Paket für den Einsatz entwickelt werden.

Das Verfahren wird unter Verwendung von gelöstem Kupfer gezeigt, ist aber auch auf andere wässrige Verunreinigungen oder Eigenschaften wie Temperatur oder Sauerstoffgehalt. Die Protokolle in dieser Arbeit entwickelt und präsentiert dazu verwendet, eine einfache digitale Videokamera als Aufzeichnungsgerät. Die digitalen Dateien werden einfach auf einen Computer übertragen und in die Bewegungsanalyse-Software hochgeladen. Die Methoden werden ständig modifiziert und verfeinert, um die Quantifizierung Prozess zu optimieren. Es ist zwingend notwendig, dass die Videoqualität für die Analyse-Software, um in High-Definition sein, jede einzelne Fische zu identifizieren, für die Verfolgung. Jeder Hintergrund, die mit den Fisch nicht Kontrast wird zu Problemen führen, wenn man versucht, die Datendateien zu verarbeiten. Ein weiteres häufiges Problem mit zweidimensionalen Videotracking ist Identifizierung von Personenbeim Schwimmen Wege kreuzen. Dies kann manuell korrigiert werden, indem jeder Fisch während des Bahnübergang zu identifizieren und die Pfadsegmente innerhalb der Software-Verknüpfung. Alternativ kann die Gesamtaktivität von jeder Wiederholungskammer als Gruppendurchschnitt bestimmt werden. Mehreren einzelnen Kammern mit jeweils einem einen Fisch enthalten, können im gleichen Sichtfeld gefilmt werden Bewegungen einzelner Fisch zu berechnen.

Zur Zeit haben wir über den Expositionskammern mit einer Reihe von Kopfüberwachungskameras aufgerüstet, das Aufzeichnungsgerät digitale Video zu einer High-Definition (HD-DVR) verbunden sind. die Verwendung eines Kamerasystems jedoch, die High-Definition-MPEG-4-Videos aufzeichnen kann funktionieren. Der HD-DVR kann zu einem bestimmten Zeitpunkt und programmiert für bis zu 7 Tage zum Datensatz gesetzt werden. Diese hands-off automatisierten Ansatz ermöglicht die Erfassung von mehreren Videos gleichzeitig die Konsistenz zu halten, während externe Störungen zu minimieren, die Fischverhalten beeinträchtigen könnten. Der HD-DVR Systems sind mit einem internen Netzwerk so der Übertragung von Dateien ist relativ einfach. Während die automatische Kamerasystem eine viel bessere Technik für die Quantifizierung von Schwimmverhalten ist, ist es immer noch vorteilhaft visuelle Beobachtungen durchzuführen als zusätzliche unterstützende Informationen zur Dokumentation von Verhaltens Beeinträchtigung bei Toxizitätstests dienen.

Es gibt eine lange Geschichte der Literatur Dokumentieren verändert Fischverhalten von der Exposition gegenüber Metallen resultierenden aus dem Anfang der 1960er Jahre ^19,20,21. Kupfer hat sich gezeigt , um zu bewirken Veränderungen im Tätigkeitsniveau wie Hypoaktivität in bluegill ²² (Lepomis macrochirus Rafinesque) und Veränderungen in der Bewegungs- und der Nahrungsaufnahme von Bachforelle ²³ (Salvelinus fontinalis). Wenigstens einige Jungfische verlassen sich auf ihren Geruchssinn zu erkennen und Räuber zu vermeiden, und Kupfer-induzierte chemosensorische Deprivation kann Verhaltensweisen beeinflussen ^24,25,26 in Bezug auf Erkennung Alarm Chemikalien . Das Riechepithel ist beschädigt durch Kupfer Exposition dadurch sensorischen Mechanismen beeinflussen , die in Desorientierung, Verhaltensvermeidung, reduziert Fütterung und alle anderen Verhaltensweisen , die geführt werden von olfaction ²⁷ führen könnte. Diese veränderten Verhaltensweisen wurden im Einklang mit dem, was während der Expositionen beobachtet wurde.

Das Schwimmverhalten von weißen Stör wurde stark bei subletalen Exposition gegenüber wässrigen Kupferkonzentrationen beeinflusst .. Diese Ergebnisse veranschaulichen, wie das Verhalten bei subletalen Konzentrationen von Kupfer beeinflusst und kann als Indikator für toxische Belastung verwendet werden. Die Video-basierte Analyse erwies sich als wirksam bei der Schwimmverhalten zu quantifizieren und diente auch als qualitative visuelle Dokumentation der schwerwiegende Auswirkungen auf die Stör Kupfer ausgesetzt. Die Analyse-Software ist auch in der Lage andere verschiedene Verhaltensendpunkte zu quantifizieren. Siehe Tabelle 1 für eine Liste. Das Belichtungssystem kann modifiziert werden, um jeden Endpunkt zu adressieren inEchtzeit-Modus und kann verwendet werden, Unterschiede im Verhalten mit der Exposition gegenüber verschiedenen Verunreinigungen von Belang zu quantifizieren.

Die Verwendung von Verhaltensendpunkte in Wasser toxikologischen Forschung ist zunehmend beschäftigt und sollte in Betracht gezogen werden , wenn die Auswirkungen von Verunreinigungen Auswertung , da adaptive Verhaltensfunktion bei der Bestimmung von Umweltschäden ⁹ von entscheidender Bedeutung ist. Die Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf Fischverhalten ist oft subjektiv und eine Herausforderung vor allem, wenn mit subletalen Endpunkte in Abwesenheit von Standard-Methoden zu tun ..

als quantifiziert Schwimmaktivität durch diese Verfahren verwenden, können streng überwacht werden, ist zerstörungsfrei mit minimaler Spannung auf den Organismus und wiederholt werden kann. Verhalten Schwimmen ist eine gültige und konsistente Index der subletale Toxizität , die in Testprotokolle aufgenommen werden sollte ⁵ die Empfindlichkeit der Standard - Toxizitätstests zu erweitern.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
copper II sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich		contaminant of concern
syringe dispenser	Hamilton MicroLab 600 Series		apparatus to spike chemical
2 L volumetric flask			container for holding stock solution
24-1.5 L glass jars			test chamber for 2 dph sturgeon
video camera	Sony Handycam HDR-CX550V
digital tracking software	Noldus Ethovision
3-17" flat screen monitors
24 surveillance cameras	Model CL101
3-16 channel digital recording devices
DO meter	YSI
pH meter	Orion 940
ph probe	Orion
ammonia meter
ammonia probe	Orion
chiller unit
recirculating water pump