JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Abstract

Exosomes הוא שלפוחית ​​קטנה החל בגודל 30 ננומטר ל -100 ננומטר שפורסמו constitutively והן על גירוי ממגוון רחב של סוגי תאים. הם נמצאים במספר הנוזלים ביולוגיים וידועים לבצע מגוון רחב של חלבונים, שומנים, ומולקולות של חומצות גרעין. חשב במקור להיות קצת יותר ממאגרים לסלולריים פסולת, את התפקידים של exosomes ויסות תהליכים ביולוגיים ובמחלות מוערכות יותר ויותר.

כמה שיטות שתוארו לבידוד exosomes מתקשורת והתרבות התאית ונוזלים ביולוגיים. בשל גודלם הקטן וצפיפות נמוכה, ultracentrifugation ההפרש ו / או אולטרה הן הטכניקות הנפוצות ביותר לבידוד exosome. עם זאת, פלזמה של HIV-1 אנשים נגועים מכילה שני exosomes וחלקיקים נגיפיים HIV, אשר דומה בגודל ובצפיפות. כך, הפרדה יעילה של exosomes מחלקיקים נגיפיים HIV בפלזמה אנושית הייתהאתגר.

כדי לטפל במגבלה זו, פיתחנו הליך שונה מCantin et. al., 2008 לטיהור exosomes מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית. מילויים מהירות iodixanol שמשו להפרדת exosomes מHIV-1 חלקיקים בפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים. חלקיקי נגיף זוהו על ידי p24 ELISA. Exosomes זוהו על בסיס acetylcholinesterase סמני exosome (AChE), ואנטיגנים CD9, CD63, CD45 ו. הליך השיפוע שלנו הניב הכנות exosome חופשיות של חלקיקי נגיף. הטיהור היעילה של exosomes מפלסמה אנושית אפשרה לנו לבחון את התוכן של exosomes המופק מפלזמה ולחקור את הפוטנציאל שלהם חיסוני modulatory ופונקציות ביולוגיות אחרות.

Introduction

מגיפת HIV-1 ממשיכה להשפיע באופן משמעותי בכל העולם. נכון לשנת 2013, כ -35 מיליון אנשים ברחבי העולם חיים עם HIV, ו -2.1 מיליון מהם היו אנשים נגועים חדש 1. אסטרטגיות מניעה וגישה משופרת לטיפול התרופתי היו מועילות בהפחתת הרכישה הכוללת של HIV. עם זאת, אוכלוסיות בודדות עדיין חווים עליות ברכישת 1 HIV. לפיכך, יש צורך במאמצים המשיכו לטפל במגיפה זו.

אחד המנבאים החזקים ביותר להתקדמות המחלה HIV הוא הפעלה חיסונית כרונית (CIA) 2-10. שהוגדר על ידי רמות גבוהות של ציטוקינים בהתמדה לזיהוי סמני ביטוי גבוהים על פני השטח של לימפוציטים מסוג T, ה- CIA יוחס ל: i) ייצור תאים דנדריטים רציף של סוג אני IFN 11; (Ii) הפעלה חיסונית ישירה מונעת על ידי חלבוני HIV טאט, Nef וgp120 12; (Iiiטרנסלוקציה) של חלבונים חיידקיים בתאי מערכת חיסון במעיים הקשורים 6. עם זאת, המנגנון המדויק (ים) כרוני, הפעלה חיסונית מערכתית בהידבקות ב- HIV להישאר להיות הובהר במלואו.

קבוצת המחקר שלנו ואחרים הוכיחו תפקיד של exosomes בפתוגנזה של HIV 15-18. הקבוצה שלנו קבעה כי חלבון Nef מופרש מהתאים נגועים בexosomes 15, וexosomal Nef (exNef) נמצא בפלזמה של אנשים שנדבקו ב- HIV ברמות ננוגרם 18. הראינו עובר אורח שCD4 + T-תאים שנחשפו לexNef הסתיימו במוות תא מושרה הפעלה תלויה במסלול CXCR4 19, 20. לחלופין, מונוציטים / מקרופאגים היו עקשן לאפופטוזיס המושרה exNef, אבל הצגתי פונקציות סלולריות שינו וביטוי ציטוקינים. exosomes לאחרונה, הקבוצה שלנו הראתה מבודד מהפלזמה של אנשים שנדבקו ב- HIV מכיל מגוון של ציטוקינים פרו-דלקתיים. פוrther, תאי mononuclear נאיביים דם היקפי נחשפו לexosomes המופק מפלזמה מחולים נגועים באיידס נגרמים ביטוי של CD38 על תאי זיכרון נאיבי ומרכזי מסוג CD4 + CD8 + T ו. זה סביר תורם לדלקת מערכתית והתפשטות נגיפית באמצעות תא עובר אורח הפעלה 21, ומצביע על כך שexosomes לשחק תפקיד משמעותי בפתוגנזה HIV.

בחקירת תפקידו של exosomes בפתוגנזה HIV, אתגר אחד הוא פיתוח טכניקות לexosomes יעילות נפרדת מחלקיקי HIV תוך שמירה על תוכן exosomal כמו גם יכולת modulatory התפקודית החיסונית. כמה שיטות שתוארו לבידוד exosomes מתרבית תאים ונוזלים ביולוגיים 22,23. בגלל גודלם הקטן והצפיפות נמוכה (exosomes לצוף בצפיפות של 1.15-1.19 g / מיליליטר), ultracentrifugation ההפרש ו / או אולטרה הן הטכניקות הנפוצות ביותר לבידוד exosome 23.עם זאת, supernatants תרבית תאים נגוע ב- HIV והפלזמה של החולים מכילים את שני exosomes וHIV-1 חלקיקים נגיפיים. Exosomes וHIV-1 חלקיקים דומים מאוד בגודל וצפיפות. לחלופין, לנצל את הביטוי של סמני exosomal ייחודיים כגון CD63, CD45, CD81 ו, exosomes היה מבודד בשיטות לכידה immunoaffinity 23. הליך זה יכול להפריד בין וירוס מexosomes. עם זאת, החסרון של שיטה זו הוא הקובץ המצורף ההדוק של נוגדנים לexosomes המטוהר, אשר יכול להפריע להערכת הפוטנציאל של המערכת החיסונית exosomes בתרבות.

כדי לטפל במגבלות אלה, פיתחנו הליך טיהור exosomes מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית שונה מCantin ועמיתים לעבודה באמצעות 22 הדרגתיים מהירות iodixanol. Exosomes נמצא להפריד בצפיפות נמוכה / שברים העליונים של מילויים iodixanol, ואילו חלקיקי נגיף הפרדה בגבוהצפיפות / שברים נמוכים יותר. חלקיקי נגיף זוהו על ידי p24 ELISA וexosomes זוהו באמצעות סמני exosome AChE, CD9, CD63, CD45 ו. שברים בצפיפות נמוכה העליונים נאספו הכילו exosomes שהיו שליליים לזיהום p24 HIV-1. הטיהור וההפרדה היעילה של exosomes מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית מאפשרת בדיקה מדויקת של התוכן של exosomes נגזר מפלסמה אנושית, כמו גם החקירה של פוטנציאל modulatory החיסון שלהם וערך האבחון ופרוגנוסטיים של exosomes בפתוגנזה של HIV-1.

Protocol

תרשים כללי של הליך בידוד exosome וטיהור מסופק באיור 1. שלם דם שהתקבל מתורמים מתנדבים בריאים ומאנשים עם HIV אינו מקבלים theraoy התרופתי השתתפות מרפאת התקווה של אוניברסיטת אמורי ותכנית מחלות מדבקות של מערכת בריאות גריידי באטלנטה, ג'ורג'יה. מחקר זה אושר על ידי לוחות הסקירה המוסדיים של אוניברסיטת אמורי ובית הספר לרפואה מורהאוס. כל האנשים שהשתתפו במחקר נתנו בכתב והסכמה מדעת.

1. הכנת Exosomes מפלסמת הדם

  1. איסוף דם אדם ועיבוד
    1. לאסוף 10 מיליליטר של דם היקפי על ידי venipuncture בצינורות איסוף דם EDTA (המכילים אשלגן 18 מ"ג EDTA), בעדינות להפוך חמש פעמים כדי לערבב.
    2. צנטריפוגה צינורות איסוף דם XG ב 1000 עבור 20 דקות ב RT לגלולת תאי דם. השתמש pipet סטריליte להעביר את החלק היחסי פלזמה (4-5 מיליליטר) לצינור חרוטי 25 מיליליטר. לדלל את הפלזמה עם 10 מיליליטר של 1 X PBS. בטל תאי דם (תאי דם אדום ותאים לבנים, הידוע גם בPBMC) במכל כראוי מסומן לפסולת ביולוגית מסוכנת.
      הערה: במקרה של דגימות דם תורם נגוע, PBMC ניתן להזמין לשימוש נוסף (ראה הליך IV.2, להלן).
    3. אחסן את דגימות הפלזמה בC o 4 לטווח קצר (2-3 ימים) או בC o -80 לאחסון לטווח ארוך יותר.
      הערה: תביא כל דגימות פלזמה קפוא עד 4 מעלות צלזיוס לפני עיבוד נוסף.
  2. הכנת שבר Exosome מפלסמה
    1. הפלזמה צנטריפוגה ב 10,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת הסלולר. השתמש פיפטה סרולוגיות סטרילי להעביר את supernatant הפלזמה פינה לצינור ultracentrifuge 25 מיליליטר נקי. זורק את הכדור במכל Biohazard.
    2. צנטריפוגה הפלזמה פינתה ב100,000 XG במשך 2שעות על 4 מעלות צלזיוס להסרת שלפוחית ​​גדולה. הסר את supernatant 100,000 XG בקפידה על ידי pipetting, ולהשליך בפסולת ביולוגית מסוכנת. Resuspend גלולה 100,000 XG ב 1 מיליליטר של 1X PBS בצינור נקי ולדגור על RT למשך 30 דקות, בעדינות כדי לסלק מתערבל וחלקיקים נפרדים.
    3. שטוף את כדור exosome / וירוס 100,000 XG הושעה על ידי הוספת 25 מיליליטר של PBS. בעדינות להפוך את הצינור חמש פעמים כדי לערבב, אז צנטריפוגות שוב ב100,000 XG לשעה 2 ב 4 מעלות צלזיוס. מחק את הפתרון לשטוף PBS במכל הפסולת הביולוגית המסוכנת.
    4. Resuspend גלולה 100,000 XG ב 1 מיליליטר של 1 X PBS לדגור על RT למשך 30 דקות מתערבלות בעדינות כדי לסלק ולפזר את גלולה.
      הערה: אם לא ניתן להמשיך ישירות לצעד שיפוע iodixanol, לאחסן גלולה, המכילים exosomes וחלקיקי נגיף, על 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 ימים עד שלב שיפוע iodixanol.

2. טיהור Exosomes

  1. צור 6% veloc -18%מילויים ity של iodixanol באמצעות מנגנון לשעבר שיפוע כפול קאמרי.
    1. הכן את פתרונות 6% ו -18% של מגיב iodixanol, מסופקים כפתרון 60% במים, על ידי דילול ב PBS. 5.5 מיליליטר pipet של פתרון 18% לתא עורר, וpipet 5.5 מיליליטר של פתרון 6% לתא המאגר. הפעל את הבוחש, פתח את השסתום, ולאפשר לכל שיפוע לזרום לתוך צינור ultracentrifuge 14 מיליליטר.
      הערה: או להשתמש מייד או לאחסן הדרגתיים מוכן O / N ב 4 ° C לפני שימוש.
    2. שכבה בזהירות 1 מיליליטר של פתרון exosome / וירוס על החלק העליון של כל שיפוע 11 מיליליטר. מילויים צנטריפוגה ב 250,000 XG לשעה 2 ב 4 ° C, באמצעות הרוטור דלי מתנדנד SW40Ti.
    3. תווית עשר (12) 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. הסר 1.0 מיליליטר מהחלק העליון של השיפוע ולהעביר לצינור # 1. העבר את השברים 1ml נותרים לצינורות 2-12 בסדר רציף.
      הערה: כך החלק העליון יהיה מס '1, החלק התחתון, # 12. רחובבצר השברים השיפוע ב 4 מעלות צלזיוס. Exosomes המטוהר, שאמורה להיות בברים 1-3 בחלק העליון של השיפוע, יציב במשך 3-4 שבועות, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס.

3. Exosome אפיון

  1. Acetylcholinesterase Assay פעילות (AChE)
    1. הכן מניית מצע 100 מ"מ על ידי ערבוב acetylthiocholine מ"ג 28.9 יודיד ב 1 מיליליטר של 1X PBS. מניית מצע חנות ב -20 ° C עד חודש 1.
    2. הכן מניית מחוון צבע 10 מ"מ על ידי הערבוב ביקרבונט 39.6mg החומצה ונתרן benzoic 15 מ"ג ב 10 מיליליטר של 1X PBS. מניית חנות מחוון צבע על 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים.
    3. הכן מגיב assay ידי 1X PBS ערבוב, מצע, ומחוון צבע ביחס של 100: 2: 5 (לדוגמא, 10 מיליליטר 1X PBS + 200 מחוון צבע μl מצע + 500 μl).
    4. העברה 50 μl מצינור 1.5 מיליליטר שיפוע חלק (שכותרת 1-12, מIII.3 ההליך) לבארות של microtite 96-היטבצלחת r. הכן בארות כפולות עבור כל דגימת שיפוע.
    5. להכין סט של סטנדרטים על ידי ביצוע מניית μU / מיליליטר AChE 2,000 הראשון בPBS. הפוך עשר (11) 2-לקפל דילולים סידוריים של מניות זה ולהוסיף 50 μl של כל דילול וליחיד של צלחת microtiter, כך ש# סטנדרטי 1 = 2,000 μU / מיליליטר, מס '2 = 1,000 μU / מיליליטר, # 3 = 500 μU / מיליליטר, וכו 'עד # 12 = 0.98 μU / מיליליטר. שנים עשר תקני כאב ובכך יתפסו שורה אחת של צלחת assay 96-היטב.
    6. הוסף 200 μl של תערובת מגיב assay לכל היטב דגירה 20 דקות (בחושך) ב RT כדי לאפשר פיתוח של מוצר תגובה בצבע. למדוד את פעילות AChE באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא microplate ניאון.
      הערה: אחוז החומר המוצא שנותר לאחר טיהור exosome מוערך על ידי assay כאב של הפלזמה unfractionated.
  2. ניתוח immunoblot
    1. חלבונים נפרדים בשברי שיפוע 1-12 (מprocedיור 2.1.3) על ידי SDS-עמוד בג'לים טרומי 4-20% טריס-HCl ב100V x 1 שעות. העבר את החלבונים בג'ל לקרום nitrocellulose באמצעות תא העברה סופג-אלקטרו-פי הוראות היצרן. לאפשר ההעברות למחוק ל12-16 שעות (O / N) ב350V.
    2. להסיר את הקרום מהמנגנון הסופג ולשטוף בטריס שנאגרו מלוח (TBS) במשך 5 דקות. לחסום עם 5% שומן חלב בTTBS (TBS עם 0.1% Tween 20) במשך שעה 1 על ידי טלטול על RT.
    3. דגירה הממברנה עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים לexosomes (CD9, CD45, CD63) או חלבון HIV-1 קפסיד (p24) ב 5% חלב ללא שומן עם הרעד ב 4 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות (O / N). דילולים של נוגדנים עיקריים לimmunoblots נעים בין 1: 2,000 -1: 5000.
    4. לשטוף את הכתם בTTBS במשך 20 דקות, ואחריו דגירה עם דילול 1: 2,000 של peroxidase חזרת (HRP) -conjugated לאנטי-IgG (נוגדנים משני), 5% חלב ללא שומן לשעה 1 ב RT. לשטוף את הכתם 3 פעמים עם TTBS, 10 דקות לכל לשטוף.
    5. דגירה הכתם עם מגיב מצע לומינול לפי הוראות היצרן, כדי ליצור אות chemiluminescent מהחלבונים שכותרת HRP זיהוי אות chemiluminescent באמצעות מערכת הדמיה אלקטרונית עם מצלמת CCD.
    6. שמור את התמונות כקבצי TIFF שניתן לראות ב- Adobe Photoshop. ביצוע ניתוח צפיפות של להקות באמצעות תוכנת ImageJ (המכון הלאומי לבריאות, Bethesda, MD).
  3. Assay ציטוקין
    1. לפני assay ציטוקינים, לשבש מתחמים חיסוניים שהם בדרך כלל נוכחים בפלזמה אנושית על ידי ניתוק חומצה וlyse exosomes על ידי טיפול חומר ניקוי. Assay שני דגימות הפלזמה מתחילות והכנות exosome מטוהרות.
      1. לפלזמה אנושית 100 μl להוסיף 100 μl 0.33 N HCL ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הוספת 100 μl 0.33 N NaOH לנטרל פלזמה שטופלה חומצה. להוסיף דגימות שתי פלזמה מנוטרלת וexosome המטוהר לTriton X-100, לFiריכוז סופי של 1%, לגרום תמוגה של exosomes.
    2. עבור assay זה (הליך המבוסס על חרוז ניאון), משתמשים בחרוזים מגנטיים מראש מצופים בנוגדנים על ידי היצרן. השתמש בלוח מעוצב מותאם אישית של חרוזים מצופים נוגדן ציטוקינים אנטי-אנושיים; מפורט בטבלה 1. ורטקס חרוזים מגנטיים מצופה נוגדן מערכת assay ציטוקינים למשך 30 שניות ולהוסיף 50 חרוזים μl היטב בכל צלחת 96-היטב לשימוש בassay.
    3. הכן סדרת דילול של סטנדרטים במאגר סטנדרטי פלזמה (שני כלולים בערכת assay ציטוקינים) כפי שמתוארת במדריך הוראות לערכת assay ציטוקינים, כדי ליצור עקומת סטנדרט 8 נקודות.
    4. להוסיף 150 μl של חיץ לשטוף 1X (מערכה) היטב כל אחד ולשטוף את החרוזים באמצעות מכונת כביסה חרוז מגנטית, כפי שמתואר במדריך. הוסף 25 חיץ assay μl הפלזמה (מערכה) היטב כל אחד. הוסף 25 μl של סטנדרטים ודוגמאות לכל הבארות בשימוש assay. הוסף 25 μl של פלזמהמאגר מדגם לבארות שליטה שליליות. לאטום ולנער את הצלחת ב 700 סל"ד במשך 60 דקות ב RT ודגירת O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    5. להוסיף 150 μl של חיץ לשטוף 1X היטב כל אחד ולשטוף את הצלחת (כמו בשלב 3.3.4, לעיל). הוסף 25 μl של נוגדני זיהוי לכל טוב, חותם ולנער את הצלחת ב 700 סל"ד במשך 30 דקות ב RT. חזור על שלב הכביסה.
    6. הוסף 50 μl של פתרון streptavidin (SAPE, מערכה) לכל אחד גם, חותם ולנער את הצלחת ב 700 סל"ד במשך 30 דקות ב RT. שוטף צלחת חזור כמו ב3.3.4.
    7. להוסיף 120 μl של חיץ קריאה (מערכה) לכל היטב ולנער על שייקר שולחן מעבדה ב 700 סל"ד במשך 5 דקות ב RT כדי לאפשר את אות הניאון לפתח. קראו צלחת על קורא הצלחת לפי הוראות היצרן.
    8. כדי להסביר את כמות exosomes איבד במהלך הליך הבידוד, להשתמש במשוואה הבאה: [(מקורי קריאה / נפח פלזמה) x 66.6 = קריאת ציטוקינים הותאמה].

4. Assay עבור פוטנציאל מערכת חיסוני

  1. הכנת תרבות בינונית עם סרום שור עוברי מדולדל-Exosome
    1. צנטריפוגה 500 מיליליטר של סרום שור עוברי (FBS) ב100,000 XG במשך 20 שעות ב 4 ° C עד גלולה זיהום exosomes וmicrovesicles. מוציא בזהירות ולשמור את supernatant FBS המדולדל exosome. זורק את הכדור בפסולת הביולוגית המסוכנת.
    2. לשלב 20% מsupernatant FBS המדולדל exosome עם 500 מיליליטר של רוזוול פרק זיכרון מכון 1640 (RPMI 1640) בינונית. סינון הבינוני דרך פילטר קרום 0.45 מיקרומטר.
    3. להוסיף סטרפטומיצין (100 U / ml), פניצילין (100 U / ml), L- גלוטמין (2 מ"מ), תמיסת מלח HEPES שנאגר (10 מיקרומטר), ו- IL-2 (20 U / ml) למדיום המסונן.
  2. תרבית תאים וחשיפת Exosome
    1. לחשוף exosomes לתאי תורם היקפיים mononuclear הדם (PBMC) מתקבלים ממתנדבי מרפאת בריאים. להשעות PBMC בהכין מדיום התרבות ולספור את התאים באמצעות דלפק תא / חלקיקים (על פי השיטה סטנדרטית של היצרן).
      הערה: PBMC מתקבל במהלך תקופת הכנת הפלזמה שתוארה לעיל (שלב 1.2).
    2. באמצעות מדיום מוכן מהליך 4.1.3 שיתוף תרבות, 3.0 x 10 6 (PBMC) עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של exosomes אספו משלושה (3) HIV-1 נגוע מחשבה או משלושה (3) HIV-1 אנשים seronegative בסך הכל נפח של 1 מיליליטר בבארות של צלחת 12 גם תרבות (עם מכסה). דגירה תרבויות במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
    3. הכן תרבויות שלא טופלו PBMC ותרבויות שטופלו בconcanavalin (קון; 5 מיקרוגרם / מיליליטר) לשרת בקרות שליליות וחיוביות כ, בהתאמה, כפי שתואר לעיל (4.2.2). דגירה כל תרבויות PBMC במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
    4. מייד לפני קצירת התאים, להכין דילולים של הנוגדנים הבאים fluorochrome מצומדות חד שבטיים: אלקסה פלואוריד 700 שכותרתו אנטי-CD3 (1: 400 דילול), allophycocyעאנין (APC) / cyanine 7 (Cy7) -labeled אנטי CD4 (1: 400), peridinin חלבון כלורופיל אנטי CD4 (1: 400) שכותרתו מורכבת, שכותרתו V450 אנטי CD8 (1: 400), biotin- כותרתו אנטי-CD45RA (1: 1000), Phycoerythrin (PE) / Cy7 שכותרתו אנטי-CD62L (1: 1000), PE / cyanine 5 (Cy5) -labeled אנטי-CD38 (1: 200), PE-טקסס אדומית אנטי-streptavidin שכותרתו (1: 2000), ושליטה שכותרתו Cy5 PE / העכבר IgG1K אלוטיפ (1: 200).
    5. לאחר תקופת הדגירה 48 שעות, לקצור את PBMC. לשטוף PBMC בPBS להסיר exosomes ולהכתים את התאים על ידי דגירה של 1 שעות ב 4 ° C עם נוגדנים מתויג fluorochrome בודדים. נתח את PBMC המוכתם על ידי cytometry זרימה לכמת את הביטוי של כמוקינים (כמתואר 21).

תוצאות

Exosomes הם מטוהרים ביעילות מHIV-1 בפלזמה אנושית חיובית. Exosomes מבודד שנוצר על ידי acetylcholinesterase פעילות (AChE), הפרדה בשברי צפיפות נמוכה 1-3 בחלק העליון של מילויים iodixanol, ואילו חלקיקי נגיף שנוצר על ידי p24 אנטיגן-1 HIV , הפרדה בשברים גבוהה יותר בצפיפות (10-12, קרו?...

Discussion

הפעלה כרונית חיסונית (CIA) ודלדול של תאי CD4 + שני סימני ההיכר חשובים של זיהום HIV-1. הם הוקמו כמנבאים לפתוגנזה, עם ה- CIA להיות המנבא הטוב ביותר. עם זאת, מנגנוני נהיגה הפעלה כרונית מערכתית חיסונית וירידה של תאי CD4 + עדיין לא הובהרו במלואו. אנחנו ומעבדות אחרות פיתחנו ראיות מוצקו?...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) Becton Dickinson368589pink top tubes
Lymphoprep Ficoll reagentCosmo BioAXS-1114545
Optiprep iodixanol reagentSigmaD1556
14ml ultracentrifuge tubesBeckman Coulter344060ultraclear tubes
Gradient Former Model 485BIO-RAD165-4120
Acetylthiocholine iodideSigma1480
Benzoic AcidSigmaD8130
Sodium BicarbonateSigmaS5761
Acetyl CholinesteraseSigmaC3389
96-well clear microtiter plateMedical Supply PartnersTR5003
SpectraMax 190 microplate readerMolecular Devices190Fluorescent plate reader
Criterion Gel Electrophoresis CellBIO-RAD165-6001
Transblot Gel BIO-RAD170-3910
Transfer Cell
Tris-HCl Criterion precast gelsBIO-RAD567-1093
Anti-CD45 antibody Abcam Ab10558
CD63 Antibody (H-193)Santa Cruz Biotech, Inc.SC-15363
CD9 Antibody (H-110)Santa Cruz Biotech, Inc.SC-9148
Rabbit pAb p24 HIV-1 ImmunoDX, LLC1303
Nitrocellulose membrane BIO-RADG1472430
Tris Buffered SalineBIO-RAD170-6435
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibodyThermo Scientific31460Goat-Anti-Rabbit
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibodyThermo Scientific31430Goat-Anti-Mouse
Western Blotting Luminol ReagentSanta Cruz Biotech, Inc.SC-2048
GE LAS-4010 ImagerGE HealthcareLAS-4010
Human Procarta Cytokine Immunoassay KitAffymetrix N/ACustom immunoassay panel
Bio-Plex 200 Immunobead ReaderBIO-RAD171-000201
Coulter Z2 Particle CounterBeckman Coulter383552Cell counter
Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3BD Bioscience (UCHT1)300424
APC/Cy7-labeled anti-CD4Biolegend (OKT4)317418
PerCP-labeled anti-CD4BD Bioscience (RPA-T8)550631
V450-labeled anti-CD8BD Bioscience (RPA-T8)560347
Biotin-labeled anti-CD45RABD Bioscience (HI100)555487
PE/Cy7-labeled anti-CD62LBiolegend (DREG-56)304822
PE/Cy5-labeled anti-CD38Biolegend (HIT2)303508
APC/Cy7-labeled anti-HLADRBiolegend (L243)307618
PE-Texas Red-labeled anti-streptavidinBD Bioscience551487
PE/Cy5-labeled mouse IgG1KBiolegend (MOPC-21)400116
APC/Cy7-labeled mouse IgG2aKBiolegend (MOPC-173)400229

References

  1. Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). . UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).
  2. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
  3. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
  4. Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
  5. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
  6. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
  7. Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
  8. Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
  9. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
  10. Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
  11. O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
  12. Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
  13. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  14. Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
  15. Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
  16. Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
  17. Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
  18. Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
  19. James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
  20. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
  21. Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
  22. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
  23. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  24. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
  25. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
  26. Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

107ExosomesHIV 1iodixanol

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved