HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Özet

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Özet

Eksozomlar hücre tipleri çok çeşitli hem yapısal olarak ve uyarım üzerine salınan olan 30 nm ile 100 nm arasında değişen büyüklükte küçük veziküllerdir. Bunlar, biyolojik sıvılarla bir dizi bulunmuştur ve bu proteinler, lipidler ve nükleik asit molekülleri, çeşitli taşıdığı bilinmektedir. Başlangıçta hücresel enkaz için rezervuarların daha az biyolojik süreçleri düzenleyen eksozom ve hastalıkları rolleri giderek takdir edilmektedir olduğu düşünülen.

Çeşitli yöntemler, hücresel kültür ortamı ve biyolojik sıvılardan izole etmek için eksozomlar tarif edilmiştir. Nedeniyle, küçük boyut ve düşük yoğunluk, ayırıcı ultra-santrifüj ve / veya ultra filtre eksozom izolasyonu için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, HIV-1 bulaşmış kişilerin plazma büyüklüğüne ve yoğunluğuna içindeki hem eksozomlar ve HIV viral partikülleri içerir. Bu nedenle, insan plazmasında HIV viral parçacıklardan eksozom etkin ayrılması olmuşturmeydan okuma.

Bu sınırlama gidermek için, Cantin et tadil edilen bir prosedür geliştirilmiştir. al., insan plazmasında HIV parçacıklardan eksozom saflaştırılması için 2008. Iyodiksanol gradyanları hızı, HIV-1 pozitif bireylerin plazmasındaki HIV-1 parçacıklardan eksozomlar ayırmak için kullanıldı. Virüs partikülleri p24 ELISA ile tespit edilmiştir. Eksozomlar eksozom belirteçleri asetilkolinesteraz temelinde (AChE) ve CD9, CD63, ve CD45 antijenleri üzerinde belirlenmiştir. Bizim degrade prosedürü virüs parçacıklarının serbest eksozom hazırlıklarını vermiştir. Insan plazmasından eksozomlann verimli arıtma plazma türevi eksozom içeriğini incelemek ve bağışıklık düzenleyici potansiyeli ve diğer biyolojik fonksiyonlarını araştırmak sağladı.

Giriş

HIV-1 salgını dünya çapında önemli bir etkiye sahip devam ediyor. 2013 yılı itibariyle, dünya genelinde yaklaşık 35 milyon kişi HIV ile yaşadığı ve bunlardan 2,1 milyon yeni enfekte bireyler ¹ idi. Önleme stratejileri ve antiretroviral tedaviye artan erişim HIV genel edinimini azaltmada yararlı olmuştur. Ancak, bireysel popülasyonları halen HIV ¹ edinimi yükselir yaşıyoruz. Bu nedenle, bu salgının ele almaya devam çabaları için bir ihtiyaç vardır.

HIV hastalığın ilerlemesi güçlü belirleyicileri biri kronik immün aktivasyon (CIA) ^2-10 olduğunu. Saptanabilir sitokinler ve T lenfositlerinin yüzeyinde yükseltilmiş ifade belirteçleri sürekli olarak yüksek seviyelerde tarafından tanımlanan, CIA sanılıyor: Ben ¹¹ IFN Tip i) sürekli dendritik hücre üretimi; HIV proteinleri Tat, Nef ve gp120 ¹² tarafından tahrik edilen, (ii) direkt immün aktivasyon; (iiiGut ilişkili bağışıklık hücreleri ⁶ bakteriyel proteinlerin) translokasyonu. Ancak, tam mekanizması (ler) altında yatan kronik HIV enfeksiyonu sistemik bağışıklık aktivasyon tam olarak aydınlatılamamıştır beklemektedir.

Araştırma grubumuz ve diğerleri HIV patogenezinde ^15-18 yılında eksozomlann rol göstermiştir. Bizim grup Nef proteini eksozom ^15, enfekte hücrelerden salgılanan olduğunu belirlemiştir ve exosomal Nef (exNef) nanogram seviyeleri ¹⁸ HIV bulaşmış kişilerin plazmasında mevcut bulunmaktadır. Bu alternatif olarak, monosit / makrofajlar exNef kaynaklı apoptosise karşı kolay işlenemezdir. ExNef maruz CD4 + T-hücreleri, CXCR4 yolunun ^{19, 20} bağlıdır aktivasyonu ile indüklenen hücre ölümü sonuçlandı oradan geçmekte göstermiştir, fakat değiştirilmiş hücresel fonksiyonları ve sitokin ekspresyonunu sergilemişlerdir. HIV ile infekte olmuş bireylerin plazmasındaki izole Son zamanlarda, bir grup göstermiştir eksozomlar pro-enflamatuar sitokinlerin çeşitli içerir. Further, saf ve merkezi bellek CD4 + ve CD8 + T hücreleri üzerinde CD38 ekspresyonunu indüklediği HIV bulaşmış hastalarda plazma türevi eksozom maruz saf periferal kan tek-çekirdekli hücreleri. Bu büyük olasılıkla sistemik inflamasyon ve seyirci hücre aktivasyonu ²¹ üzerinden viral yayılma katkıda bulunur ve eksozomlar HIV patogenezinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.

HIV patogenezinde eksozomlann rolünü araştıran, bir meydan HIV parçacıklar verimli ayrı eksozomlar exosomal içeriği korurken yanı sıra işlevsel immün modülatör yeteneği teknikleri geliştiriyor. Çeşitli yöntemler, hücre kültürü ve biyolojik sıvılarda ^22,23 den eksozomlar izole etmek için tarif edilmiştir. Çünkü küçük boyutları ve düşük yoğunluklu (eksozomlar 1.15 yoğunluğunda yüzer - 1.19 g / ml), ayırıcı ultrasantrifüjleme ve / veya ultrafiltrasyon eksozom izolasyonu ²³ için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir.Bununla birlikte, HIV ile infekte olmuş hücre kültürü süpernatanları, hastaların plazma eksozomlar ve HİV-1 virüs partiküllerini içerir. Eksozomlar ve HİV-1 parçacıkların boyutu ve yoğunluğu açısından oldukça benzerdir. Seçenek olarak ise, örneğin CD63, CD45 ve CD81 gibi benzersiz exosomal markerlerin ekspresyonu yararlanarak, eksozomlar immünoafinite yakalama yöntemleri ²³ kullanılarak izole edilmiştir. Bu prosedür eksozom virüsü ayırabilirsiniz. Bununla birlikte, bu tekniğin dezavantajı, kültür eksozomlann bağışıklık potansiyelinin değerlendirilmesi ile etkileşime girebilir saflaştırılmış eksozom, antikorların sıkı ektir.

Bu sınırlamaları için, iyodiksanol gradyanları kullanılarak hızı HIV Cantin modifiye insan plazması içinde parçacıklar ve arkadaşları ²² eksozomlann saflaştırılması için bir yöntem geliştirdi. Virüs parçacıkları yüksek- içinde ayrılmış oysa eksozomlar, düşük yoğunluk iyodiksanol geçişlerini / üst fraksiyonları ayırmak bulunduyoğunluk / düşük kesirler. Virüs partikülleri p24 ELISA ile belirlenmiştir ve eksozomlar eksozom işaretleri AChE, CD9, CD63, ve CD45 ile tespit edilmiştir. Toplanan üst düşük yoğunluklu parçacıkları HİV-1 p24 kirlenme için negatifti eksozomlar ihtiva etmiştir. Insan plazması HIV parçacıklardan eksozom etkin bir biçimde saflaştırılabilir ve ayırma insan plazması gibi bağışıklık modülatör potansiyelinin incelenmesi ve HIV-1 patojenezinde eksozom tanısal ve prognostik değerinden türetilen bir eksozom içeriği doğru inceleme sağlar.

Protokol

Exosome izolasyon ve saflaştırma prosedürü genel bir diyagram Şekil 1'de verilmiştir. Tüm kan sağlıklı gönüllü donörlerden ve Emory Üniversitesi'nden Umut Kliniği ve Grady Sağlık Sistemi Bulaşıcı Hastalık Programı katılıyor antiretroviral theraoy almayan HIV pozitif bireylerin elde edilmiştir Atlanta, Georgia. Bu çalışma Emory Üniversitesi Tıp Morehouse Okulu kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanmıştır. Çalışmaya katılan tüm kişilerin yazılı ve bilgilendirilmiş onam formu.

Kan Plazma eksozomlann hazırlanması 1.

1. İnsan Kan Toplama ve İşleme
   1. (18 mg potasyum EDTA ihtiva eden) EDTA kan toplama tüpleri içinde damar delme ile periferal kanın 10 ml toplamak ve hafifçe karıştırın beş kez ters çevirin.
   2. Kan hücreleri topaklamak üzere oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1000 x g'de, kan toplama tüpleri santrifüjleyin. Steril pipeti kullanınte 25 ml'lik konik tüp plazma kısmını (4-5 ml) aktarmak için. 1 x 10 ml PBS ile plazma seyreltin. Biohazard atıklar için uygun işaretli kapta (aynı zamanda PBMC'de olarak bilinen kırmızı kan hücreleri, beyaz hücreler) kan hücrelerini atın.
      Not: enfekte edilmemiş verici kan örnekleri durumunda, PBMC, daha fazla kullanım (aşağıdaki prosedür IV.2 bakınız) için ayrılmış olabilir.
   3. Kısa vadede (2-3 gün) veya daha uzun süreli saklama için -80 ^{o C'de} 4 ^{o C'de} plazma örnekleri saklayın.
      NOT: Daha fazla işlemeden önce 4 ^{o C} herhangi donmuş plazma örnekleri getirin.
2. Plazma Exosome Kesir hazırlanması
   1. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin plazma hücre tortularım çıkartmak için. Temiz bir 25 ml'lik ultrasantrifüjdeki tüp temizlenir plazma süpernatant aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın. Biohazard konteyner pelet atın.
   2. 2 100,000 xg'de temizlenir plazma santrifüj4 ° C'de saat büyük kesecikler kaldırın. Pipetle dikkatli 100.000 xg Süpernatantı ve biyolojik tehlike atıklar atın. Temiz bir tüp içinde 1X PBS 1 ml 100,000 x g pelet yeniden süspanse edin ve yavaşça çıkarmak ve ayrı partiküller dönen, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   3. PBS 25 ml ilave etmek suretiyle süspansiyon haline 100,000 x g eksozom / virüs pelet yıkayın. Yavaşça, sonra karışımı 4 ° C 'de 2 saat boyunca 100,000 x g hızında tekrar santrifüj tüpü, beş kez ters çevirin. Biyolojik tehlikeli atık kabı PBS yıkama solüsyonu atın.
   4. 1 x PBS, 1 ml 100,000 x g pelet yeniden süspanse edin ve yerinden ve pelet çözmek için hafifçe dönen 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
      NOT: iyodiksanol gradyan aşamasına kadar 1-2 gün süreyle 4 ° C 'de, eksozomlar ve virüs parçacıkları içeren, iyodiksanol gradyan doğrudan ilgili adıma pelet saklamak mümkün değilse.

Eksozom 2. saflaştırılması

1. % 6 -18% veloc üretBir iki odacıklı degrade eski cihazı kullanılarak iyodiksanol bir Sığ gradiyentleri.
   1. PBS içinde seyreltilerek, su içinde% 60 çözelti olarak temin iyodiksanol reaktifi% 6 ve% 18 çözümleri hazırlayın. Pipet 5,5 karıştırıldı odasına 18% çözelti ml ve pipet depolama haznesine% 6 çözeltisi 5.5 mi. , Karıştırıcı açın musluğunu açık ve her gradyan, 14 ml ultra santrifüj tüpüne akmasına izin verir.
      NOT: hemen kullanın veya kullanmadan önce 4 ° C'de hazırlanan degradeler O / N saklamak ya.
   2. Dikkatle her 11 ml degrade üst kısmına eksozom / virüs çözümü 1 ml katman. Bir SW40Ti sallanan bir kova rotor kullanılarak 4 ° C 'de 2 saat için 250,000 x g'de santrifüjleyin gradyanlar.
   3. On iki (12), 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin. Degrade üstünden 1.0 ml çıkarın ve tüp 1. transfer. Sırayla tüpleri 2-12 kalan 1ml kesirler aktarın.
      NOT: En üstteki kısım böylece 1. alt kısmı, 12. olacaktır. St4 ° C 'de gradyan fraksiyonları yardımcı olmaktadır. 4 ° C'de depolanan gradyan üstündeki fraksiyonları 1-3 olmalıdır saflaştırılmış eksozomlar, 3-4 hafta boyunca stabildir.

3. Exosome Karakterizasyonu

1. Asetilkolinesteraz (AChE) Aktivite Deneyi
   1. 1X PBS, 1 ml asetiltiyoklolin iyodür 28,9 mg karıştırılarak 100 mM substrat stok hazırlayın. 1 ay -20 ° C de saklayınız substrat stoku.
   2. 1X PBS, 10 ml benzoik asit 39.6mg ve sodyum bikarbonat 15 mg karıştırılarak 10 mM renk göstergesi stok hazırlayın. Iki hafta 4 ° C'de saklayın renk göstergesi hisse senedi.
   3. (Örneğin, 10 mi 1X PBS + 200 ul substrat + 500 ul renk indikatörü) 5: 2: 100 bir oranda karıştırma 1X PBS, alt-tabaka ve renk göstergesi ile analiz reaktifi hazırlayın.
   4. Bir 96-yuvalı microtite kuyularına Transferi (III.3 prosedürü ile ilgili, 1-12 etiketli), her 1.5 ml gradyan fraksiyon tüpten 50 ulr plakası. Her degrade numune için yinelenen kuyu hazırlayın.
   5. İlk PBS içinde 2000 μU / ml AChE stok yaparak bir dizi standardı hazırlayın. Yap on (11) 2-kat, bu stoklar seri dilüsyonları ve bir mikrotiter plakasının bir tek oyuğuna her seyreltme 50 ul, böylece standart # 1 = 2000 μU / ml, # 2 = 1.000 μU / ml, # 3 = 500 μU / ml, vb # 12 = 0.98 μU / ml kadar. On iki AChE standartları, böylece, 96 oyuklu bir deney plakasının bir tek sıra kaplayacaktır.
   6. Her bir deney reaktif karışımı 200 ul de ekleyin ve renkli reaksiyon ürününün gelişimi sağlamak için oda sıcaklığında (karanlıkta) 20 dakika inkübe edilir. Bir flüoresan mikro levha okuyucusu kullanarak 450 nm'lik bir dalga boyunda AChE aktivitesi ölçülür.
      Not: eksozom saflaştırmadan sonra, başlangıç ​​materyali kaldığını yüzdesi bölünmemiş plazma AChE testi ile değerlendirilir.
2. İmmünoblot Analizi
   1. Proced gradyan fraksiyonları 1-12 Ayrı proteinler (100V x 1 saat sonra% 4-20 Tris-HCI prefabrik jel üzerinde SDS-PAGE ile ure 2.1.3). Üreticinin talimatlarına göre bir elektro-lekeleme aktarım hücresi kullanılarak bir nitroselüloz zara jelde proteinleri aktarın. Transferler 350V de 12-16 saat (O / N) için leke izin verin.
   2. Lekeleme aparatı membranı çıkarın ve 5 dakika boyunca Tris tamponlu tuz (TBS) içinde yıkayın. Oda sıcaklığında çalkalanarak 1 saat boyunca (% 0,1 Tween 20 ile TBS) TTBS içinde% 5 yağsız süt ile bloke edin.
   3. 12-16 saat (O / N), 4 ° C de çalkalanarak% 5 yağsız süt içinde eksozomlann (CD9, CD45, CD63) veya HIV-1 kapsid proteini (p24) için spesifik primer antikorlar ile membran inkübe edin. Imüno için birincil antikor seyreltileri olarak 1: 2000 -1: 5000.
   4. 1 ile enkübasyonu takiben, 20 dakika boyunca TTBS içinde blot yıkayın: yaban turpu peroksidazı (HRP) ve 2000 seyreltme, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 yağsız süt içinde, anti-IgG (sekonder antikor) ile konjüge edilmiş. Leke TTBS ile 3 kez, yıkama başına 10 dk yıkayınız.
   5. HRP etiketli proteinler CCD kamera ile bir elektronik görüntüleme sistemi kullanılarak kemilüminesan sinyal Algılama bir kimyasal olarak ışık veren bir sinyal üretmek için, üreticinin talimatlarına uygun olarak luminol alt-tabaka bir reaktif ile leke inkübe edin.
   6. Adobe Photoshop izlenebilir TIFF dosyaları olarak görüntüleri kaydedin. ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) kullanarak bantların dansitometri analizi yapın.
3. Sitokin Deneyi
   1. Sitokin deneyi öncesinde, asit ayrışma tarafından, insan plazmasının içinde mevcuttur, deterjan muamelesi ile eksozomlar lize immün kompleksleri bozabilir. Tahlil hem başlangıç ​​plazma örnekleri ve arıtılmış eksozom hazırlıkları.
      1. Insan plazması, 100 ul için 100 ul 0,33 N HCL ilave edin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Asit ile muamele edilmiş plazma nötralize etmek için 100 ul 0,33 N NaOH ekleyin. Bir fi, Triton X-100 nötralize plazma ve saflaştırılmış eksozom her iki numunenin ekleme% 1 nal konsantrasyonu eksozomlann lizizine neden olmak için.
   2. Bu deneyde (floresan bir boncuk esaslı prosedür) için, manyetik boncuk üretici tarafından antikorlar ile önceden kaplanmış kullanır. Anti-insan sitokin antikor kaplı boncuk özel tasarlanmış panelini kullanın; Tablo 1 'de listelenmiştir. 30 sn için sitokin deney kiti, antikor kaplı manyetik boncuklar Vortex ve deneyde kullanılmak üzere 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 ul boncuk ekleyin.
   3. 8 noktalı bir standart eğri oluşturmak için, sitokin deneyi kiti için kullanım kılavuzunda tarif edildiği gibi plazma, standart tampon (sitokin deneyi kitin içerdiği her ikisi) standartların bir seyreltme serisi hazırlanır.
   4. El kitabında açıklandığı gibi, her bir kuyucuğa (kit) 1X yıkama tamponu 150 ul eklenir ve manyetik boncuk yıkayıcı kullanılarak boncuk yıkayın. Her bir kuyunun (kit) 25 ul plazma tahlil tamponu ekleyin. Deneyde kullanılan tüm oyuklara standartlar ve numuneler 25 ul ekle. Plazma 25 ul eklenegatif kontrol oyuklarına örnek tamponu kaplandı. Kapatın ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 700 rpm'de sallamak plaka ve 4 ° C 'de O / N inkübe edin.
   5. Her bir oyuğa 1X yıkama tamponu 150 ul ilave edin ve (yukarıdaki aşama 3.3.4 gibi) plakayı yıkayın. Her bir oyuğa, conta içine tespit antikorlarının 25 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 700 rpm'de plaka sallayın. Yıkama işlemi tekrarlayın.
   6. Her bir oyuğa, conta içine (kit SAPE) streptavidin çözeltisi 50 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 700 rpm'de plaka sallayın. 3.3.4 gibi tekrarlayın plaka yıkar.
   7. Flüoresan sinyal geliştirmesine imkan vermek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 700 rpm'de bir masa laboratuar karıştırıcısı üzerinde her birine (kit) okuma tamponu 120 ul de ekleyin ve sallayın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir levha okuyucu üzerinde plaka okuyun.
   8. Izolasyon prosedürü sırasında kaybedilen eksozom miktarı için hesap şu denklemi kullanmak için: [(orijinal okuma / plazma hacmi) 66.6 = düzeltilmiş sitokin okuma x].

İmmünomodülatuar Potansiyeli 4. Testi

1. Eksozom-tükenmiş Fetal Sığır Serumu, kültür ortamının hazırlanması
   1. Santrifüj 4 ° C 'de 20 saat süre ile 100,000 x g'de fetal sığır serumu (FBS), 500 mi eksozomlar ve microvesicles kirletici: pelet. Dikkatle çıkarın ve eksozom tükenmiş FBS süpernatant kaydedin. Biohazard atık pelet atın.
   2. Roswell Park Memorial Institute 1640 500 ml (1640 RPMI) ortam ile eksozom tükenmiş FBS süpernatant% 20 birleştirin. 0.45 um'lik bir membran filtresinden orta filtre.
   3. Süzüldü ortama streptomisin (100 U / ml), penisilin (100 U / ml), L-glutamin (2 mM), HEPES-tamponlu tuzlu su çözeltisi (10 uM) ve IL-2 (20 U / ml) eklenir.
2. Hücre Kültürü ve Exosome Pozlama
   1. Sağlıklı gönüllülerden elde klinik donor periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için eksozomlar Açığa. PBMC'nin Askıyakültür ortamı hazırlanır ve (imalatçının standart bir yönteme göre) hücre / partikül sayacı kullanarak hücreleri sayın.
      Not: PBMC (1.2 adım a), yukarıda tarif edilen plazma hazırlanması sırasında elde edilir.
   2. Prosedür 4.1.3 den hazırlanan ortam maddesi kullanılarak, ko-kültür 3,0 x 10 ⁶ toplanan eksozom 1 ug / ml (hücre) üç (3), HIV-1 seropozitif ya da üç (3), HIV-1 seronegatif kişilerin bir toplam (kapak ile) 12-yuvalı kültür plakasının yuvaları içinde 1 ml hacmi. 37 ° C 'de 48 saat süre ile kültür inkübe edin.
   3. Konkanavalin A ile muamele edilmiş tedavi edilmemiş PBMC kültürleri ve kültürleri hazırlanması (Con A; 5 ug / ml) (4.2.2), yukarıda tarif edildiği gibi, sırasıyla, negatif ve pozitif kontrol hizmet vermektedir. 37 ° C 'de 48 saat boyunca, tüm PBMC kültürleri inkübe edin.
   4. Alexa Fluor 700-etiketli anti-CD3 (1: 400 seyreltme), allophycocy hemen önce hücrelerin hasat için aşağıdakileri florokrom-eşlenik monoklonal antikorlar dilüsyonları hazırlamak(1: 400), V450-etiketli anti-CD8, Biotin: klorofil protein kompleksi,-etiketli anti-CD4 (400 1) peridinin: anin (APC) / siyanin 7 (Cy7), anti-CD4 (400 1) -etiketli anti-CD45RA (1: 1000) etiketli, fikoeritrin (PE) / anti-CD62L (1: 1000), Cy7-etiketli, PE-Texas Kırmızı-, PE / siyanin 5 (Cy5), anti-CD38 (200 1) -etiketli etiketli anti-streptavidin (1: 2000) ve PE / Cy5 etiketli fare IgG1K izotip kontrol (1: 200).
   5. 48 saatlik bir bekletme süresinden sonra, PBMC hasat edilir. PBS yıkama PBMC bağımsız florokrom etiketli antikorlar ile 4 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edilerek hücreler eksozomlar çıkarın ve leke. ⁽²¹ tarif edildiği gibi) kemokin ifadesinin miktarını belirlemek için akış sitometrisi ile boyanmış PBMC analiz edin.

Sonuçlar

Eksozomlar verimli, HIV-1 pozitif insan plazmasından saflaştırılır. Asetilkolinesteraz (AChE) aktivitesi tarafından tanımlanan izole edilmiş eksozomlar, HIV-1 antijen, p24 tarafından tanımlanan virüs partiküllerinin, oysa iyodiksanol gradyanları üstündeki daha düşük yoğunluklu fraksiyonları 1-3 ayrılmış (alt kısmına yakın, 10-12), daha yüksek yoğunluklu fraksiyonlarda ayrılmış. Eksozom varlığı daha eksozom belirteçlerinin AChE, CD9, CD4...

Tartışmalar

Kronik immün aktivasyon (CIA) ve CD4 + T hücresi kaybı, HIV-1 enfeksiyonunun iki önemli özellikleridir. Onlar CIA iyi belirleyicisi olmak, patogenezi için belirleyicileri olarak kurulmuştur. Ancak, kronik sistemik immün aktivasyon ve CD4 + T hücre düşüş sürüş altında yatan mekanizmaları hala tam olarak ortaya konamamıştır. Bu ve diğer laboratuar HIV-1 ile enfekte hücrelerden salgılanan eksozomlar iki özelliklerinden önemli bir rol oynadığını sağlam kanıtlar geliştirdik.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)	Becton Dickinson	368589	pink top tubes
Lymphoprep Ficoll reagent	Cosmo Bio	AXS-1114545
Optiprep iodixanol reagent	Sigma	D1556
14ml ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	344060	ultraclear tubes
Gradient Former Model 485	BIO-RAD	165-4120
Acetylthiocholine iodide	Sigma	1480
Benzoic Acid	Sigma	D8130
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Acetyl Cholinesterase	Sigma	C3389
96-well clear microtiter plate	Medical Supply Partners	TR5003
SpectraMax 190 microplate reader	Molecular Devices	190	Fluorescent plate reader
Criterion Gel Electrophoresis Cell	BIO-RAD	165-6001
Transblot Gel	BIO-RAD	170-3910
Transfer Cell
Tris-HCl Criterion precast gels	BIO-RAD	567-1093
Anti-CD45 antibody	Abcam	Ab10558
CD63 Antibody (H-193)	Santa Cruz Biotech, Inc.	SC-15363
CD9 Antibody (H-110)	Santa Cruz Biotech, Inc.	SC-9148
Rabbit pAb p24 HIV-1	ImmunoDX, LLC	1303
Nitrocellulose membrane	BIO-RAD	G1472430
Tris Buffered Saline	BIO-RAD	170-6435
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Scientific	31460	Goat-Anti-Rabbit
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Scientific	31430	Goat-Anti-Mouse
Western Blotting Luminol Reagent	Santa Cruz Biotech, Inc.	SC-2048
GE LAS-4010 Imager	GE Healthcare	LAS-4010
Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit	Affymetrix	N/A	Custom immunoassay panel
Bio-Plex 200 Immunobead Reader	BIO-RAD	171-000201
Coulter Z2 Particle Counter	Beckman Coulter	383552	Cell counter
Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3	BD Bioscience (UCHT1)	300424
APC/Cy7-labeled anti-CD4	Biolegend (OKT4)	317418
PerCP-labeled anti-CD4	BD Bioscience (RPA-T8)	550631
V450-labeled anti-CD8	BD Bioscience (RPA-T8)	560347
Biotin-labeled anti-CD45RA	BD Bioscience (HI100)	555487
PE/Cy7-labeled anti-CD62L	Biolegend (DREG-56)	304822
PE/Cy5-labeled anti-CD38	Biolegend (HIT2)	303508
APC/Cy7-labeled anti-HLADR	Biolegend (L243)	307618
PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin	BD Bioscience	551487
PE/Cy5-labeled mouse IgG1K	Biolegend (MOPC-21)	400116
APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK	Biolegend (MOPC-173)	400229