从HIV-1阳性者的血浆分离外来体的

摘要

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

摘要

外来体是小囊泡从从它们的多种细胞类型的释放都组成型和刺激后30纳米至100纳米不等的大小。他们发现，在一些生物体液的和已知携带多​​种蛋白质，脂质和核酸分子。原本以为要多一点水库细胞碎片，外来体调节生物过程和疾病中的作用也越来越赞赏。

几种方法已经被描述用于分离从细胞培养基和生物流体的外来体。由于它们的小尺寸和低的密度，差分超速离心和/或超滤是最常用的技术为外来体隔离。然而，HIV-1感染的个体的血浆中含有两个外来体和HIV病毒颗粒，其在尺寸和密度相似。因此，从人血浆中的HIV病毒颗粒的外来体的有效的分离已一个挑战。

为了解决此限制，我们开发了从Cantin 等改性的过程。 人，2008为来自HIV颗粒在人血浆中的外来体的纯化。碘克沙醇的速度梯度被用于外来体来自HIV-1颗粒的HIV-1阳性个体的血浆中分离。病毒颗粒确定P24 ELISA。外来体被确定的外来体标记物的乙酰胆碱酯酶的基础（乙酰胆碱酯酶）和CD9，CD63和CD45抗原上。我们的渐变过程产生游离病毒颗粒的外来体的准备。从人血浆外来体的高效净化使我们能够检查血浆衍生的外来体的含量，并调查它们的免疫调节潜力和其他生物学功能。

引言

在HIV-1流行继续在世界各地都有一个显著的影响。截至2013年，全球约有3500万人感染艾滋病毒，而这些210万新感染的个体^1。预防战略和增加获得抗逆转录病毒疗法已在减少整体收购艾滋病毒有帮助。然而，个别人群仍面临上升收购HIV ^1。因此，有必要继续努力来解决这一流行病。

其中一个HIV疾病进展的最强预测的是慢性免疫激活^{（CIA）2-10。}持续高检测水平的细胞因子和T淋巴细胞的表面上表达升高的标记限定，CIA已被归因于:i）连续的树突状细胞产生I型IFN ¹¹的类型; （二）直接免疫激活HIV蛋白达，NEF和gp120的¹²驱动; （三）易位相关的肠道免疫细胞⁶细菌蛋白质。然而，确切的机制（S）潜在慢性，在HIV感染的全身免疫激活仍有待完全阐明。

我们的研究小组和其他人证明外来体的艾滋病发病^15-18的作用。我们小组已确定的Nef蛋白从感染的细胞中分泌的外来体^15，和外来体的Nef（exNef）存在的HIV感染的个体中的纳克水平¹⁸在血浆中。我们已经表明，旁观者的CD4 + T细胞暴露于exNef导致活化诱导的细胞死亡取决于CXCR4途径^19，20，另外，单核细胞/巨噬细胞难治exNef诱导的细胞凋亡，但表现出改变的细胞功能和细胞因子的表达。最近，我们集团已经显示出外来体从HIV感染者的血浆中分离出含有多种促炎细胞因子。福rther，诱导CD38表达对天真和中央记忆CD4 +和CD8 + T细胞的HIV感染患者暴露于血浆来源的外来天真的外周血单核细胞。这可能有助于全身性炎症，并通过旁观者细胞活化²¹病毒的繁殖，并表明外来体发挥在HIV发病机理中显著作用。

在调查外来体在HIV发病机理中的作用，一个挑战是发展技术以来自HIV颗粒，同时保持外体含量有效地分离外泌体，以及它们的功能免疫调节能力。几种方法已经被描述用于从细胞培养物和生物流体^22,23分离外泌体。因为它们的小尺寸和低的密度（外来体漂浮在1.15的密度- 1.19克/毫升），差分超速离心和/或超滤是最常用的技术为外来体隔离^23。但是，艾滋病毒感染细胞培养上清和病人的血浆同时包含外来体和HIV-1病毒颗粒。外来体和HIV-1的颗粒在尺寸和密度非常相似。另外，以独特的外体标记，如CD63，CD45，CD81和表达的优势，外来体一直在使用免疫亲和捕获方法²³隔离。这个过程可以从外来体分离病毒。然而，这种技术的缺点是紧密附接抗体与纯化的外来体，这可能干扰在培养外来体的免疫调节的潜能的评估。

为了解决这些局限性，我们开发了用于使用碘克沙醇的速度梯度来自HIV颗粒在人血浆中由Cantin改性和同事²²外来体的纯化过程。外来体被发现在低浓度偏析碘克沙醇梯度/上层级分，而病毒颗粒分离在高密度/较低的分数。病毒颗粒通过P24 ELISA检测和使用外来体标记的乙酰胆碱酯酶，CD9，CD63和CD45被确定外来体。收集上层低密度部分包含这是不含有HIV-1 P24污染外来体。艾滋病毒颗粒在人体血浆中外来体的高效纯化和分离方法可以从人血浆以及他们的免疫调节潜力的调查和外来体在HIV-1发病机制中的诊断和预后价值来源的外来内容的准确检查。

研究方案

外来体的分离和纯化过程的总体框图如图1中提供 。全血从健康志愿者的捐助者和未接受抗逆转录病毒theraoy参加埃默里大学的希望诊所和格雷迪健康系统的传染病计划HIV阳性者获得在佐治亚州亚特兰大。该研究获得埃默里大学医学院和莫尔豪斯学院的机构审查委员会。所有参与研究的人签署书面知情同意。

从血浆1.准备外来体的

1. 人体血液采集与处理
   1. 收集10毫升外周血通过静脉穿刺在EDTA血液收集管（含有18毫克的钾EDTA）中，并轻轻颠倒5次混合。
   2. 离心血液采集管在1000×g离心20分钟，在RT以沉淀血细胞。使用无菌吸管德的血浆部分（4-5毫升）转移到25毫升锥形管中。稀释血浆用10ml 1×PBS中。在对生物危险废物的适当标记的容器中丢弃血细胞（红细胞，白细胞，也被称为PBMC）。
      注意:在未感染的供体的血液样品的情况下，PBMC可保留用于进一步使用（见步骤IV.2，下文）。
   3. 储存血浆样品在^4℃下短期（2-3天），或在^-80℃下长期储存。
      注:将冰冻的血浆样本，以4 ^摄氏度之前进一步处理。
2. 从血浆中的外来体分数的制备
   1. 离心机等离子体以10,000×g离心30分钟，在4℃以除去细胞碎片。使用无菌血清吸管给清零血浆上清液转移到一个干净25毫升超速离心管。丢弃在生物危害容器中的沉淀物。
   2. 离心清等离子10万XG 2小时，在4℃，以除去大囊泡。小心地取出10万XG上清液吹打，并丢弃在生物危险废物。重悬在1ml的1X PBS的100000×g离心沉淀在一个干净的管中并在室温下孵育30分钟，轻轻地涡旋以移去和单独的颗粒。
   3. 加入25毫升的PBS洗暂停100000 XG外来体/病毒颗粒。轻轻颠倒试管5次混合，然后再次离心以100,000×g离心2小时，在4℃。丢弃在生物危险废物容器中的PBS液冲洗。
   4. 重悬100000×g离心沉淀在1ml 1×PBS中并在室温下孵育30分钟轻轻涡旋撞出和溶解沉淀。
      注意:如果这是不可能直接进行到碘克沙醇梯度步骤，存储所述粒料，含有外来体和病毒颗粒，在4℃下1-2天，直到碘克沙醇梯度步骤。

2.净化外来体的

1. 生成6％-18％veloc碘克沙醇的使用双室梯度前装置，两者均梯度。
   1. 制备碘克沙醇试剂的6％和18％的溶液，供给作为在水中的60％的溶液中，通过稀释于PBS中。吸取5.5中毫升18％溶液进入搅拌室的，和吸管5.5中毫升6％溶液进入储存室。开启搅拌器，打开活塞，并且允许每个梯度流入14 ml的超速离心管。
      注:要么立即使用或存放准备梯度O / N在4℃下才能使用。
   2. 仔细层1毫升外来体/病毒溶液到每11个ml的梯度的顶端。离心机梯度在250000×g离心2小时，在4℃下，用SW40Ti吊桶式转子。
   3. 标签12（12）1.5 ml微量离心管。从渐变的顶部除去1.0毫升并转移到管＃1中。转移顺序的其余1毫升馏分管2-12。
      注:因此，最上面的级分将是＃1，底部馏分，＃12。圣矿石在4℃的梯度级分。纯化的外来体，其应在馏分1-3在梯度的顶部，贮存于4℃时是稳定的3-4周。

3.外来体的表征

1. 乙酰胆碱酯酶活性测定
   1. 准备100毫米基板原料混合乙酰胆碱碘28.9毫克1毫升1X PBS中。商店基板股票在-20°C至1个月。
   2. 准备10毫米彩色指标股混合苯甲酸39.6mg和碳酸氢钠15毫克于10毫升的1X PBS中。存储颜色指示剂股票在4℃下长达两个星期。
   3. 2:在100的比例制备测定试剂通过混合1×PBS，基板，以及彩色指示器5（例如，将10毫升的1X PBS + 200微升底物+500μl的颜色指示）。
   4. 传送从各1.5 ml的梯度级分管（标记为1-12，从程序III.3）50微升到96孔microtite的孔- [R盘。准备两个孔的每个梯度样品。
   5. 首先使2000μU/ ml的乙酰胆碱酯酶的股票在PBS准备一套标准。使11（11），2倍这个股票的连续稀释，并添加50微升每种稀释液至微量滴定板的单个孔，使得标准＃1 = 2000μU/毫升，＃2 = 1000μU/毫升，＃3 = 500μU/ ml的，等等，直到＃12 = 0.98μU/毫升。因此，12的AchE标准将占用一个96孔测定板的单个行。
   6. 加入200μl测定试剂混合物的每个孔中，孵育20分钟（在黑暗中）在RT下，以使有色反应产物的发展。测量在450nm使用荧光酶标仪在波长AChE活性。
      注意:在起动外来体纯化后的剩余材料的百分比是由普通等离子体胆碱酯酶法检测。
2. 免疫印迹分析
   1. 在梯度分数1-12分离蛋白（从的程序，URE 2.1.3）通过SDS-PAGE在4-20％的Tris-HCl预制凝胶在100V×1小时。在凝胶转移蛋白根据生产商的说明使用电印迹转移细胞硝酸纤维素膜上。允许转移到印迹12-16小时（O / N）为350V。
   2. 从印迹装置取出膜和洗涤在Tris-缓冲盐水（TBS）中5分钟。用5％脱脂牛奶在TTBS（TBS含0.1％吐温20）1小时通过振荡在RT方框。
   3. 孵育在5％脱脂牛奶特异于外来体（CD9，CD45，CD63）或HIV-1衣壳蛋白（p24的）第一抗体的膜，在4℃振荡12-16小时（O / N）。对于原发性免疫印迹稀释抗体的范围是从1:2000 -1:5000。
   4. 用1洗印迹在TTBS 20分钟，然后孵育:2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）缀合的抗IgG抗体（二次抗体），在5％的脱脂牛奶1小时，在室温。洗净的印迹3次TTBS，每洗10分钟。
   5. 孵育印迹用鲁米诺底物试剂根据制造商的指示，以产生化学发光信号从HRP标记蛋白检测使用具有CCD照相机的电子成像系统的化学发光信号。
   6. 将图像保存为可以在Adobe Photoshop中查看TIFF文件。执行使用ImageJ软件（国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）乐队的密度分析。
3. 细胞因子分析
   1. 在此之前的细胞因子测定，破坏免疫复合物，通常是存在于人血浆中的酸解离并裂解外来体通过去污剂处理。分析这两个启动血浆样品纯化外来体的准备。
      1. 至100μl人血浆添加100微升0.33当量盐酸，在37℃进行1小时。加入100微升0.33 1N氢氧化钠中和酸处理的血浆。添加的Triton X-100，以两者中和的血浆和纯化外来体的样品，给音响的1％的最终浓度，以引起外来体的裂解。
   2. 对于该测定法（荧光基于珠子的程序），使用磁珠预先涂覆有抗体由生产。使用抗人细胞因子抗体包被的珠的定制设计的面板; 在表1中列出。涡流从所述细胞因子测定试剂盒的抗体-包被的磁珠，30秒，并添加50微升珠96孔平板的每个孔在测定中使用。
   3. 制备血浆标准缓冲液（均包含在细胞因​​子测定试剂盒）的稀释系列标准中的细胞因子测定试剂盒使用说明书中所述，以产生8点的标准曲线。
   4. 添加150微升1X洗涤缓冲液（由试剂盒）到每个孔，并且洗涤用磁珠垫圈珠，如手册中所述。添加25微升血浆测定缓冲液（从盒）至各孔中。添加25微升标准品和样品，以在该测定中使用的所有孔中。加入25微升血浆样品缓冲液阴性对照孔中。密封，并在室温摇动板以700rpm进行60分钟和孵育O / N在4℃下。
   5. 添加150微升1X洗涤缓冲液到每个孔，并且洗涤该板（如在步骤3.3.4，上文）。添加25μl的抗体检测到每个孔中，密封并在700rpm摇动板在室温30分钟。重复洗涤步骤。
   6. 加入50微升链霉溶液（SAPE，从盒）到每个孔中，密封并在700rpm摇动板在室温30分钟。重复洗涤板在3.3.4。
   7. 添加120微升读数缓冲液（从盒）到每个孔中，并摇动在实验室桌面摇床在700rpm进行5分钟，在室温以允许荧光信号来开发。读板放在读板器按制造商的说明。
   8. 为了解释分离过程期间丢失外来体的量，可使用下列公式:[（原件读取/血浆体积）×66.6 =调节细胞因子读数。

4.检测方法的免疫调节潜力

1. 培养基与外来体贫胎牛血清制备
   1. 离心机500毫升胎牛血清（FBS）中的10万xg离心20小时，在4℃以沉淀污染外来体和微泡。小心地取出并保存外来体耗尽FB​​S上清。丢弃在生物危险废物的颗粒。
   2. 结合外来体贫FBS的上清液用500ml罗斯韦尔园区纪念研究所1640（RPMI 1640）培养基的20％。过滤通过0.45μm膜过滤器的介质。
   3. 添加链霉素（100U /毫升），青霉素（100U /毫升），L-谷氨酰胺（2 mM计），HEPES缓冲的盐溶液（10μM），和IL-2（20U / ml）的经滤波的介质。
2. 细胞培养和外来体曝光
   1. 暴露外来体从健康诊所的志愿者得到的供体外周血单核细胞（PBMC）。在暂停PBMC制备培养基和计数使用细胞/颗粒计数器（根据制造商的标准方法）的细胞。
      注:将PBMC上述等离子体制备过程中得到的（步骤1.2）。
   2. 使用制备的介质从过程4.1.3，共培养^3.0×10 6（PBMC）用1微克/毫升汇集外来体三（3）的HIV-1血清阳性或从三（3）的HIV-1血清反应阴性个体的总体积为1ml在12孔培养板（盖）的孔中。在37℃下孵育培养物48小时。
   3. 准备与刀豆蛋白A处理未处理的外周血单个核细胞培养物和培养（ConA的; 5微克/毫升）以上（4.2.2），如作为阴性和阳性对照，分别。孵育所有PBMC培养48小时，在37℃。
   4. 之前立即收集细胞，准备以下荧光标记的单克隆抗体的稀释度:的Alexa Fluor 700标记的抗CD3（1:400稀释），allophycocyANIN（APC）/花青7（Cy7的）标记的抗CD4（1:400），多甲藻素叶绿素蛋白复合物标记的抗CD4（1:400），V450标记的抗CD8（1:400），生物素标记的抗CD45RA（1:1000），藻红蛋白（PE）/ Cy7的标记的抗CD62L（1:1000），PE /花青5（Cy5的）标记的抗CD38（1:200），PE-德克萨斯红 - 标记的抗生蛋白链菌素（1:2000），和PE / Cy5标记小鼠IgG1K同种型对照（1:200）。
   5. 在48小时的潜伏期后，收获PBMC。洗涤的PBMC在PBS中在4℃下温育除去外来体和细胞染色1小时与个别荧光染料标记的抗体。通过流式细胞仪分析染色的PBMC量化趋化因子的表达（如^21）。

结果

外泌体有效地从HIV-1阳性的人血浆纯化。分离的外来体，确定乙酰胆碱酯酶的活性，分隔在较低密度组分1-3在碘克沙醇梯度的顶部，而病毒颗粒，确定HIV-1抗原的p24 ，隔离在高密度级分（10-12，底部附近）。外来体的存在下通过的外来体标记物的AChE，CD9，CD45，CD63和，并用电子显微镜（图2）的免疫印迹鉴定进一步证实。

讨论

慢性免疫激活（CIA）和CD4 + T细胞耗竭是HIV-1感染的两个重要特征。他们已经被确立为预测的发病机制，与美国中央情报局是最好的预测。然而，驾驶慢性全身免疫激活和CD4 + T细胞衰退的作用机制还没有完全阐明。我们和其他的实验室已经开发出坚定的证据表明，外来体从HIV-1感染细胞分泌起到两个标志的作用。

在两种组合物和细胞外囊泡的功能继续关心导致了各种方法外来?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)	Becton Dickinson	368589	pink top tubes
Lymphoprep Ficoll reagent	Cosmo Bio	AXS-1114545
Optiprep iodixanol reagent	Sigma	D1556
14ml ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	344060	ultraclear tubes
Gradient Former Model 485	BIO-RAD	165-4120
Acetylthiocholine iodide	Sigma	1480
Benzoic Acid	Sigma	D8130
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Acetyl Cholinesterase	Sigma	C3389
96-well clear microtiter plate	Medical Supply Partners	TR5003
SpectraMax 190 microplate reader	Molecular Devices	190	Fluorescent plate reader
Criterion Gel Electrophoresis Cell	BIO-RAD	165-6001
Transblot Gel	BIO-RAD	170-3910
Transfer Cell
Tris-HCl Criterion precast gels	BIO-RAD	567-1093
Anti-CD45 antibody	Abcam	Ab10558
CD63 Antibody (H-193)	Santa Cruz Biotech, Inc.	SC-15363
CD9 Antibody (H-110)	Santa Cruz Biotech, Inc.	SC-9148
Rabbit pAb p24 HIV-1	ImmunoDX, LLC	1303
Nitrocellulose membrane	BIO-RAD	G1472430
Tris Buffered Saline	BIO-RAD	170-6435
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Scientific	31460	Goat-Anti-Rabbit
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Scientific	31430	Goat-Anti-Mouse
Western Blotting Luminol Reagent	Santa Cruz Biotech, Inc.	SC-2048
GE LAS-4010 Imager	GE Healthcare	LAS-4010
Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit	Affymetrix	N/A	Custom immunoassay panel
Bio-Plex 200 Immunobead Reader	BIO-RAD	171-000201
Coulter Z2 Particle Counter	Beckman Coulter	383552	Cell counter
Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3	BD Bioscience (UCHT1)	300424
APC/Cy7-labeled anti-CD4	Biolegend (OKT4)	317418
PerCP-labeled anti-CD4	BD Bioscience (RPA-T8)	550631
V450-labeled anti-CD8	BD Bioscience (RPA-T8)	560347
Biotin-labeled anti-CD45RA	BD Bioscience (HI100)	555487
PE/Cy7-labeled anti-CD62L	Biolegend (DREG-56)	304822
PE/Cy5-labeled anti-CD38	Biolegend (HIT2)	303508
APC/Cy7-labeled anti-HLADR	Biolegend (L243)	307618
PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin	BD Bioscience	551487
PE/Cy5-labeled mouse IgG1K	Biolegend (MOPC-21)	400116
APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK	Biolegend (MOPC-173)	400229