JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

העבודה המוצעת מעריכה את פוטנציאל האבחון של תהודה plasmon משטח ישירה ומוגברת מבחני (SPRi), במיוחד לצורך זיהוי של הורמון גדילה האנושי רקומביננטי בסרום אנושי ממוסמר, על ידי השוואת תוצאות SPRi ישירות עם assay immunosorbent צמוד אנזים זמין מסחרי (ELISA) קִיט.

Abstract

שיטות רגישות וסלקטיבית לצורך זיהוי של הורמון גדילה האנושי (HGH) על פני טווח רחב של ריכוזים (רמות גבוהות של 50-100 ng מיליליטר - 1 ורמות מינימום של 0.03 מיליליטר ng - 1) במחזור הדם הוא חיוניים כמו רמות משתנים רשאי מצביע פיזיולוגיה שינתה. לדוגמא, ניתן לאבחן הפרעות צמיחה המתרחשות בילדות על ידי מדידת רמות של HGH בדם. כמו כן, השימוש לרעה של HGH רקומביננטי בספורט מהווה לא רק בעיה אתית זה גם מציג איומים בריאותיים חמורים למתעלל. אסטרטגיה פופולרית אחת למדידת שימוש לרעה HGH, מסתמכת על הגילוי של היחס של 22 kDa hGH לhGH הכוללת, כמו רמות אנדוגני אינם 22 kDa לרדת לאחר מתן אקסוגני רקומביננטי HGH (rhGH). הדמיה בתהודה plasmon פני השטח (SPRi) היא כלי אנליטי שמאפשר ניטור ישיר (ללא תווית) והדמיה של אינטראקציות biomolecular על ידי הקלטה של ​​שינויי ind השבירהלשעבר בסמוך למשטח החיישן בזמן אמת. לעומת זאת, בשיטת colorimetric הנפוצה ביותר בשימוש, assay צמוד האנזים immunosorbent (ELISA) משתמש נוגדני זיהוי אנזים שכותרתו למדוד ריכוז אנליטי בעקיפין לאחר התוספת של מצע שגורם לשינוי צבע. כדי להגדיל את רגישות זיהוי, SPRi המוגבר משתמש בפורמט assay כריך ונקודות קרובים אינפרא אדום קוונטים (QDs) כדי להגדיל את עוצמת אות. לאחר זיהוי SPRi הישיר של rhGH רקומביננטי בסרום אנושי ממוסמר, אות SPRi מוגברת על ידי ההזרקה רציפה של נוגדן זיהוי מצופה QDs הקרוב אינפרא אדום (ננו-SPRi). במחקר זה, את פוטנציאל האבחון של SPRi הישיר והמוגבר הוערך למדידת rhGH זינק בסרום אנושי והשוואה ישירות עם היכולות של ערכת ELISA זמינה מסחרי.

Introduction

הורמון גדילה אנושית (HGH) הוא פפטיד 191 חומצת אמינו (22 KDA) המיוצר על ידי בלוטת יותרת המוח וישירות משתחרר לתוך מחזור הדם. יחסי גומלין בין הורמוני ההיפותלמוס צמיחת פפטיד משחרר הורמון (GHRH) וסומטוטרופין לגרום הפרשות pulsatile של HGH. כתוצאה מכך, רמות של HGH להשתנות משיאים ב50-100 ng / ml לשפל בטווח 0.03 ng / ml 1. מחסור או עודף של HGH בגוף יכול לעורר מגוון רחב של תסמינים פיסיולוגיים נורמליים. לדוגמא, רמות עודפות של HGH יכולות להוביל לענקיות 2 וסוכרת 3. רמות המדולדלות של HGH לגרום סוכר בדם נמוך בתינוקות, וצפיפות עצם חלשה ודיכאון במבוגרים 4.

הממשל של טופס רקומביננטי של HGH (rhGH) משפר את מסת שריר רזה, תוך צמצום שומן בגוף. ככזה, חומר זה הפך תרופת בחירה לספורטאים מקצועיים וחובבים כזה משפר את הכוח פיזי שמעניק עו"דantage בספורט תחרותי. rhGH הוא מוחרם על ידי הסוכנות נגד השימוש בסמים העולמי (WADA) 5,6 ומאמץ רב על ידי חוקרים בינלאומיים כבר התמקדו בפיתוח בדיקות שיכולות לזהות את נוכחותה או השפעה אנבוליים.

assay immunosorbent צמוד אנזים (ELISA) היה השיטה המועדפת לקביעה של HGH בכל דם 7. אמנם, ELISA הוא טכניקה אמינה המציעה רגישות טובה וסלקטיביות, זה יחסית זמן ועתיר עבודה. בנוסף, ELISA מסתמך על הגילוי העקיף של HGH על ידי העסקת תגים האנזימטית. לעומת זאת, תהודת plasmon פני השטח (SPR) מאפשרת זיהוי של HGH ישירות ללא השימוש בתוויות בזמן אמת. עיקרון הגילוי מאחורי SPR כרוך משטח חישה בהיקף של פריזמה שמצופית בשכבה דקה מתכת (זהב או כסף); כאשר אור מקוטב מונוכרומטי אינטראקציה עם משטח המתכת, "plasmons המשטח" נוצרים. כריכה של אנליטילקולט משטח משותק על משטח המתכת מדאיג את תנאי התהודה וכתוצאה מכך לטבול תהודה עברה, אז מה שיכול להיות מתואם לריכוז אנליטי. חיישנים מבוססי SPR זמינים מסחרי המציעים בזמן אמת, טכניקה ללא תווית לעקוב אחר אירועים מחייבים biomolecular ותגובות ביוכימיות 8-10 עכשיו. לאחרונה, SPRi פותח בתגובה לצורך בריבוב (כלומר, ניטור אירועים מרובים מחייבים בו זמנית), שלא היו אפשרית בחיישני SPR קלאסיים. לפיכך, SPRi התפתח ככלי לניטור מספר אירועים מחייבים בו-זמנית. מערכות SPRi נוכחית מבוססות על הדמיה מיקרוסקופית של משטח שמתלהב עם אור בזווית ואורך גל 10 ספציפיות. התמונה לאחר מכן נתפסה על מכשיר מערך תשלום מצמידים (CCD).

נכון להיום, יש כבר כמה מבחני מבוססי SPR פותחו כדי לזהות hGH 11-14. אסטרטגיה מסוימת אחת, הידועה בשם שיטת איזופורם 15, מסתמך על הגילוי של היחס של 22 kDa hGH לhGH הכוללת, כמו רמות אנדוגני אינם 22-kDa לרדת לאחר מתן rhGH אקסוגני. לאחרונה, דה חואן-פרנקו ואח '. 11 דיווחו על הפיתוח של immunosensor מבוסס SPR לגילוי סלקטיבית של kDa 22 ו -20 isoforms kDa הורמון הגדילה בדגימות סרום אנושיים. נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים לכל איזופורם היו משותקים ישירות על חיישן הזהב מאפשר המדידה של שני isoforms בו זמנית בזריקה אחת עם הגבלה של זיהוי על 0.9 ng מיליליטר -1. לחלופין, SPR נעשה שימוש כדי להקרין נוגדנים עם סגוליות גבוהות עד 13 HGH. אם הריכוז של אנליטי היעד נופל מתחת לגבול של מערכת SPRi של זיהוי (<ננומטר), יש לפנות להגברת אות SPRi באמצעות הניצול של חלקיקים (ננו-SPRi). הגברה מבוססת SPR כגון תועדה היטב בספרות 16-19 לנסוגי arious של אנליטי ומשטחים.

בעבודה זו, הפוטנציאל אנליטי של חיישנים מבוססים ננו-SPRi וSPRi נבדק, במיוחד לצורך זיהוי של rhGH בסרום אנושי ממוסמר, והשוואה של יכולת זיהוי שלה ישירות לELISA. הפרמטרים הבאים ייבדקו ונחשבו: זמן גילוי, רגישות, פרופיל הקינטית, שחזור וספציפיות.

Protocol

1. הכנה של פתרונות ודגימות חלבון לSPRi

  1. הכן של פתרון פוספט נמוך מלח שנאגרו מלוח (PBS) המכיל 10 מ"מ פוספט, 150 נתרן כלורי מ"מ, ו- pH 7.4 100 מיליליטר.
  2. הכן 50 מיליליטר של תמיסת PBS גבוה מלח המכילה 10 מ"מ פוספט, 750 נתרן כלורי מ"מ, ו- pH 7.4.
  3. הכן 5 מיליליטר של נתרן אצטט 10 מ"מ.
  4. הכן מלאי של 5 מ"ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA) בדילול מלא בתמיסת PBS נמוך מלח.
  5. הכן פתרון מניות של הורמון גדילה האנושי רקומביננטי (rhGH) בריכוז של 1 מיקרוגרם / מיליליטר בפתרון PBS נמוך מלח.
  6. הכין מלאי של פתרונות אנטי-rhGH ונוגדני שליטה שליליים בריכוז של 100 מיקרוגרם / מיליליטר.

2. הכן צ'יפ SPRi למערך נוגדן

  1. נקה את השבב על ידי sonication ב -120 מיליליטר של תמיסה התייצבה פיראניה (3: 1 חומצה גופרתית מרוכזת 30% מי חמצן) במשך 90 דקות ב -50 מעלות צלזיוס ומעקב על ידי שטיפהוsonication עם מים למשך 5 דקות. לאחר מכן, לשטוף שבב עם אתנול יבש עם זרם חנקן.
  2. מניחים את שבב הזהב בתא UV / אוזון למשך 30 דקות כדי להסיר כל מזהמים.
  3. להוסיף 150 מ"ג של חומצת 11-mercaptoundecanoic 20 מיליליטר אתנול במבחנה המכילה בר מערבבים וכובע צינור.
  4. הנח שבב בצינור מבחנה ומיקרוגל / השבב ב -50 W ו- 50 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. יש לשטוף את השבב עם אתנול ולטבול באתנול במשך 5 דקות.
  6. עקוב על ידי שטיפה במים ומשרים במים למשך 5 דקות.
  7. להוסיף 150 מ"ג של 1-אתיל-3 carbodiimide (3-dimethylaminopropyl) 20 מיליליטר מים במבחנה המכילה בר מערבבים וכובע צינור. שבב מיקרוגל כמו בשלב 2.4.
  8. יש לשטוף את השבב עם מים ומשרים במים למשך 5 דקות.
  9. להוסיף 150 מ"ג של N-hydroxysuccinimide ב 20 מיליליטר מים במבחנה המכילה בר מערבבים וכובע צינור. שבב מיקרוגל כמו בשלב 2.4.
  10. יש לשטוף את השבב עם מים ומשרים במים למשך 5 דקות.
  11. Prepaמחדש 250 מיקרומטר פוליאתילן גליקול (PEG, 800 Da) ב 20 מיליליטר מים במבחנה המכילה בר מערבבים וכובע צינור. שבב מיקרוגל כמו בשלב 2.4.
    הערה: במיקרוגל PEG800 על פני השטח של החיישן מבוצעת כצעד חסימה כדי למנוע שאינו ספציפי מחייב של חלבונים בסרום ומתחמי נקודה קוונטית מאוחר יותר השתמש בניסוי. זו מושגת על ידי PEG800 מגיב עם אתרי זהב חשופים שאינם כבושים על השבב.
  12. יש לשטוף את השבב עם מים ומשרים במים למשך 5 דקות.
  13. הכן 15 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי-rhGH פתרון נוגדנים ופתרון בקרה השלילי של אנטי-Immunoglobulin G (אנטי-IgG) ולהוסיף 10 μl של כל פתרון נוגדן לטוב בצלחת גם 384.
  14. לעצב את דפוס תצפית בmicroarrayer (4 x 7 רביעים עבור כל דגימה) ושבב נקודה עם נוגדנים באמצעות טפלון 500 מיקרומטר הטה סיכה.
  15. דגירה שבב מנוקד לשעה 2 ב RT ותחת אווירה לחה של 75% או יותר.
  16. יש לשטוף ולהשרות במים לשבב5 דקות. לאחר מכן, שבב יבש עם זרם חנקן.

3. הגדרת ניסוי SPRi וחסימה

  1. לאתחל את המכשיר וספרייה בחר. בחר מצלמה בזמן אמת ולהתחיל במשך 10 מיליליטר של מים degassed משאבת מזרק 1 מיליליטר / דקה. הכנס שבב למכשיר ולשמור על הזרקת מים עד שכל הבועות יוסרו.
  2. לאחר שטיפת שבב עם 10 מיליליטר של מים, להתחיל רכישת תמונה, ובצע על ידי מעבר למאגר לנמוך מלח PBS ולאפשר לו לרוץ ב1 מיליליטר / דקה ל5 מיליליטר וקצב זרימה איטי אז עד 20 μl / דקה במשך 20 דקות .
  3. בחר את התמונה בניגוד ביותר, אשר מציגה את הנוגדנים המשותקים הבחינו על השבב.
  4. בחר ולהגדיר את 400 מיקרומטר הכתמים עגולים הבודדים המתאימים לנוגדנים המשותקים.
  5. אחרי המכשיר עוקב עקומות plasmon, לבחור זווית עובדת שיש לו את המדרון הגבוה ביותר בעקומות רפלקטיביות.
  6. לזרום חיץ פועל ב 20 μl / דקה של ים נמוךAlt PBS באמצעות המערכת עד האות מכל הכתמים נבחרו מייצבת.
  7. טען את BSA (100 מיקרוגרם / מיליליטר) בהפעלת מאגר ללולאת המדגם (150 μl) עם שסתום ההזרקה בעמדת הטעינה. לאחר מכן לעבור את השסתום למצב הזריקה להזריק הפתרון לתא הזרימה.
    הערה: BSA מוזרק לקשור קוולנטית אל פני השטח תגובתי האמינים, BSA מאוגד הנותר לשטוף את פני השטח באמצעות שטיפת מאגר.
  8. להזריק 150 μl של פתרון של נתרן אצטט 10 מ"מ מעל פני השטח ומעקב על ידי הזרקת 150 μl של מלח גבוה PBS.
  9. להזריק 150 μl של ethanolamine (1 מ"מ) כדי לבטל את משטח התגובה האמין.
  10. להזריק 150 μl של נתרן אצטט 10 מ"מ לשטוף את המשטח.
  11. לאחר מכן, לעבור חיץ פועל לPBS עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר BSA בקצב זרימה של 250 μl / דקה עבור הסכום כולל של 5 מיליליטר.
    הערה: 50 מיקרוגרם / מיליליטר BSA מתווספים למאגר פועל לחסימה נוספת של surפנים על ידי אי-קוולנטית כובשת האתרים שאינם ספציפיים וזה נעשה כדי לצמצם עוד יותר שאינו ספציפי מחייב של חלבונים בסרום אל פני השטח.
  12. קצב זרימת שינוי עד 5 μl / דקה ולאפשר לו לייצב במשך 20 דקות.

4. SPRi איתור של אדם הורמון גדילה

  1. הכן פתרון של ריכוז סט של rhGH (30,000 pg / ml; 250 pg / ml; 25 pg / mL; 2.5 pg / ml ו0.25 pg / ml) בסרום של 10% ובדילול מלא בPBS המכיל 1 מ"ג / מיליליטר BSA.
  2. הכן 2: פתרון 1 על ידי הוספת 1 μl של ביוטין נוגדני שכותרתו אנטי-rhGH זיהוי (6 מיקרומטר) 3 μl של streptavidin המצופה ליד נקודות אינפרא אדום קוונטים (1 מיקרומטר) בצינור 0.5 מיליליטר microcentrifuge ו דגירה של 30 דקות לצימוד יעיל .
  3. להזריק 150 μl של hGH ממוסמר פתרון סרום אנושי בהזרקת הלולאה. התוצאה היא עלייה חזקה באות ואחריו ירידה איטית מהסרום קשור שאינו ספציפי שטיפה את פני השטח.
  4. ברגע שהסימןאל יתייצב, לשטוף את המשטח עם פתרון של 450 נתרן כלורי מ"מ הוסיף למאגר הריצה.
  5. לדלל את הפתרון של נוגדני זיהוי אנטי rhGH ונקודות קוונטיות לריכוז של 10 ננומטר (2: 1) עם הפעלת מאגר (PBS עם 50 מיקרוגרם BSA / מיליליטר) ולהזריק לתוך תא הזרימה.

5. ניתוח נתונים SPRi

הערה: בעקבות ההזרקה של rhGH ממוסמר סרום אנושי ומשפרים נקודה קוונטית, עלייה בשינוי ההחזרה מתרחשת עקב השינוי המוגבר של עקומות plasmon. התוצאה היא תמונה מראה הבדל תמונה בקנה מידה אפורה correlating לאות של על השבב.

  1. לייבא את הנתונים לתכנית ניתוח נתונים. העלילה אות SPRi (החזריות%) לעומת זמן (ים) ולקבוע את ההבדל בין אנטי-rhGH והכתמים שליליים נוגדן שליטה לאחר שטיפת מלח הגבוהה.

6. ELISA פרוטוקול (יום 1)

  1. אחסן את כל הרכיבים כלולים assay אני n ערכת ELISA rhGH ב 2-8 מעלות צלזיוס. זה כולל את הנוגדן אנטי rhGH צלחות מצופים היטב, סטנדרטים (0-5) בסרום כבשים, הפקדים (1 & 2) בסרום אנושי, חיץ המצומד, (200x) חיץ לשטוף, אַב צֶבַע TMB (Tetramethylbenzidine) ולהפסיק מגיב.
  2. התקנת ריאגנטים ובצעו את השיטות כפי שתוארו בפרוטוקול ערכת ELISA המסחרי.
  3. ראשית, לאפשר לנוגדן אנטי-rhGH מצופה 96-בארות כדי לחמם לRT לפני פתיחת חבילת נייר הכסף.
  4. ואז להסיר את המספר הרצוי של רצועות 8-גם עבור assay ולאטום את חבילת נייר הכסף המכילה את הבארות וחנות שנותרו ב 2-8 מעלות צלזיוס.
  5. הכן סטנדרטים על ידי הכינון מחדש ב 2 מיליליטר של מים מזוקקים לסטנדרטי 0 #, ב 1 מיליליטר של מים מזוקקים לסטנדרטים (1-5), וב 1 מיליליטר של מים מזוקקים לבקרה (1 & 2). להלן טבלה של הריכוזים המקבילים של התקנים ובקרה (טבלה 1):
תקנים ריכוז (ng / ml)
0 0
1 0.17
2 0.94
3 2.63
4 10.4
5 26.9
שליטת # 1 1.22 ± 0.33 ng / ml
שליטה # 2 4.97 ± 1.25 ng / ml
עם-next.within עמודים = "תמיד">

טבלת 1. ריכוזים של הסטנדרטים ופקדים כלולים בערכת ELISA המסחרית.

  1. הכן את הדגימות אשר מורכבת של הורמון rhGH בסרום 10% אדם בריכוזים הבאים (טבלה 2):
לדוגמא ריכוז (ng / ml)
1 0.025
2 0.2
3 0.5
4 2.5
5 10
6 30

טבלה 2. ריכוזים של דגימות rhGH מוכנות בסרום 10%.

  1. הוסף 50 μl של כל תקן, שליטה ומדגם זה טוב (בtriplicates). חותם את הבארות ודגירה עם סטנדרטים, בקרות, ודגימות rhGH O / N ב 4 ° C תחת רעד עדין.

7. ELISA פרוטוקול (יום 2)

  1. הסר את הצלחת מייקרה ולאפשר לו להתחמם לRT (15-20 דקות) לפני שתמשיך עם assay.
  2. הסר את אנטי-rhGH-HRP, חיץ המצומד, לשטוף חיץ (200x), אַב צֶבַע TMB (tetramethylbenzidine),מגיב תחנת ד מהמקרר ולאפשר להתחממות RT.
  3. הכנת מגיב: (על פי מפרט יצרן)
    1. לדלל את אנטי-rhGH-HRP 40X עם חיץ המצומד. הכן את החיץ לשטוף על ידי דילול 200x עם מים מזוקקים.
  4. הוסף 50 μl של המצומד אנטי-rhGH-HRP לכל טוב, לאטום את הבארות ולדגור על RT למשך 30 דקות תוך רעד בעדינות.
  5. למזוג את הפתרון מהבארות ולהפוך את הצלחת והקש יבש על רקמה סופגת. ואז להוסיף 200 μl של חיץ לשטוף היטב לתוך כל אחד.
  6. למזוג את הפתרון לשטוף ולייבש ברז על רקמה סופגת. חזור על פעולה זו 3 פעמים.
  7. להוסיף לאַב צֶבַע 100 μl לכל גם בתוך 15 דקות הבאות על השלב לשטוף. דגירה של 30 דקות ב RT בחושך תוך רעד בעדינות. הפתרונות להפוך מצבע לכחול.
  8. להוסיף של מגיב התחנה 100 μl לכל אחד. הפתרונות להפוך מכחול לצהוב. מייד, לקרוא הספיגת דואר של כל אחד גם ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplate.
  9. עלילה העקומה סטנדרטית לתקנים הניתנים (0-5). אז עלילה הצפיפות האופטית של rhGH בדגימות סרום 10% לעומת הריכוז של כל דגימה.

תוצאות

הביצועים של SPRi וננו-SPRi (SPRi העסקת NanoEnhancers) הושוו עם ELISA לזיהוי של rhGH בסביבה מורכבת. ההבדלים בהגדרה של שיטות אלה מתוארים כאן בקצרה. לSPRi (זיהוי ישיר, איור 1), הנוגדן ללכוד הוא משותק על פני השטח ולאחר מכן המדגם מוזרק ומחייב של אנליטי למשטח החיישן נמדד ישירות בזמן אמת ובאופן נטול תווית. עם זאת, עם ננו-SPRi (איור 1), לאחר אנליטי נקשר למשטח החיישן, הזרקה ברציפות ואחריו עם נקודות קוונטיות מצופות בנוגדנים לזיהוי כדי להגביר את אות SPRi.

figure-results-683
איור 1. ייצוג סכמטי השוואה ישיר מצב (SPRi) ומוגבר במצב (ננו-SPRi) זיהוי של rhGH בג דגימות גסות. ligands (rhGH או IgG נוגדנים ספציפיים) היו משותקות בפורמט מערך על biochip SPRi. חלבון המטרה (rhGh) זינק בסרום האדם הציג למשטח החיישן מזוהים ישירות (SPRi) ורצף מודגש עם NanoEnhancers (ננו-SPRi). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

באשר לELISA, צלחות multiwell תגענה כבר מראש פונקציונליות עם נוגדן ללכוד ולאחר מכן מדגם הוא הציג, אנליטי עניין יחייב. נוגדן זיהוי הוא הציג ואחריו תוספת מצע. הצפיפות האופטית נמדדה אז ב 450 ננומטר. במחקר זה, ערכת ELISA מסחרית (איור 2) שימשה למדידת rhGH זינק ב -10% בסרום אנושי.

8 / 53508fig2.jpg "/>
איור 2. ייצוג סכמטי של הליך assay ELISA. חלבון rhGH (אליפסות כחולות) הוא הציג לבארות שכבר מראש פונקציונליות עם נוגדנים חד-שבטיים (צהוב) ספציפיים לrhGH. אינטראקציות שאינן ספציפיות בוטלו על ידי שטיפת הבארות עם חיץ לשטוף אחרי כניסתה של נוגדן זיהוי prefunctionalized עם peroxidase חזרת (HRP, סגול). הפתרון ישתנה בצבע לאחר הוספת tetramethylbenzidine המצע (TMB, זהב). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 מייצג את עקומת טיטרציה של rhGH זינקה ב -10% בסרום אנושי וזממה נגד OD הושג ב 450 ננומטר. תגובה ליניארי טובה נצפתה והמגבלה של זיהוי הייתה נחושה להיות ng 1 / מיליליטר. המקדם של variation (CV) היה 6.5% המצביעים על שחזור טוב.

figure-results-2706
איור 3. ניתוח נתונים ELISA. ריכוז של rhGH זינק בסרום זממו נגד OD הושג ב 450 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בשלב הבא, זיהוי של rhGH זינק בסרום אנושי הוערך עם SPRi. זיהוי ישיר של rhGH הביא עם עקומת מפל ריכוזים המקבילה (איור 4), כל נקודה מייצגת את הערך הממוצע של הבדל רפלקטיביות מחושב משלוש עקומות הקינטית SPRi עבור כל ריכוז. המגבלה של זיהוי (לוד) הייתה נחושה להיות 3.61 ng / ml. Assay זיהוי ישיר SPRi היה מאוד לשחזור כמו קורות החיים של assayהיה רק ​​4.1%.

figure-results-3589
איור 4. זיהוי ישיר SPRi של HGH זינק ב -10% בסרום אנושי. עלילת התוצאה המנורמלת SPRi הקינטית לאחר ההזרקה של כמויות שונות של HGH זינקה בסרום אנושי ואחרי ההזרקה של חיץ מלח גבוה (קו אנכי מקווקו) כדי להסיר אי אינטראקציות -specific. עקומת מפל ריכוזים המייצגת את הכריכה של כמויות שונות של HGH זינקה בסרום אנושי על פני השטח החיישן שכבר prefunctionalized עם HGH-ספציפי-נוגדן biotinylated. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כדי להגדיל את הרגישות של biosensor SPRi, NanoEnhancers (QDs מראש-פונקציונליות עם נוגדני זיהוי) נמצא ברצף בtroduced אל פני השטח החיישן על מנת להדגיש את נוכחותו של rhGH זינק בסרום אנושי. לאחר חיסור רקע, NanoEnhancers הצליחו להגביר את תגובת biosensor עד 7.9%, עם זאת, עם שינוי אות מינימאלי (Immunoglobulin G (IgG) נוגדני -specific, שינוי של 0.38% ברפלקטיביות; איור 5 על אזורים בשליטה של עניין הדמיה של. משטח החיישן גילה כי אזורים של עניין היחידים שיש לי נוגדני rhGH ספציפיים משותקים ניסיון שינוי הניגוד הגדול אימות ישירות עם תגובת sensorgram קינטית.

figure-results-4967
איור 5. איתור של rhGH באמצעות assay כריך זינק ב -10% בסרום אנושי. SPRi עלילה הקינטית לאחר ההזרקה של rhGH (30 ng / ml) במאגר (10 מ"מ PBS, 150 נתרן כלורי מ"מ, pH = 7.4) על גבי מראש שבב -functionalized עם חומצת 11-mercaptoundecanoic / rhGH-נוגדן ספציפי ולשלוט IgG נוגדנים אז חסם עם BSA אחריו התוספת של נקודות קוונטיות מצופי נוגדן זיהוי (NanoEnhancers). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כדי להדגים את המעשיות של biosensor ננו-SPRi, טווח המדידה של rhGH בדגימות גולמיים הוערך. טווח עבודה ממושך מ30,000 pg / ml 0.25 pg / ml הביא כתגובה לתוספת של NanoEnhancers (איור 6). ראוי לציין שכל נקודה בעקומת טיטרציה היא בממוצע משלושה ניסויים בלתי תלויים. כתוצאה מכך, הגבול התחתון של זיהוי היה מחושב להיות 9.20 pg / ml ומקדמים שונים היה 20%.

figure-results-6110
איור 6.זיהוי ננו-SPRi של HGH זינק בסרום אדם. ייצוג מנורמל SPRi הקינטית עלילה של אות hGH_specific_Anti-מוגברת QDs לדגימות סרום אנושיים זינק בריכוזים שונים של HGH. קו אנכי מקווקו (אפור) מייצג את נקודת חיץ ריצת ההזרקה. (ב) עקומת מפל ריכוזים המייצגת את הכריכה של NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QDs) לאחר ההזרקה של כמויות שונות של HGH זינקה בסרום אנושי על פני השטח החיישן שכבר prefunctionalized עם חומצת 11-mercaptoundecanoic / hGH ספציפית נוגדן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בשלב הבא, את השינוי שמתרחש בעקומת רפלקטיביות SPR כפונקציה של הריכוז הושווה בין הישיר ושיטת המבדק NanoEnhancer (איור 7). לדה הישירה טכניקת tection בין 25 ל 0.25 pg / ml, האות התחילה רמה וזה לא מפתיע שריכוזים אלה יפחתו לוד של 3 מיליליטר ng / (איור 7). באופן דומה, לטכניקה מוגברת, ריכוזים מתחת ללוד של אות / מיליליטר 9.2 PG התחילו רמה והראו כמעט שום וריאציה.

figure-results-7385
איור 7. ניתוח השוואתי של SPRi עם ננו-SPRi. גרף עמודות מתארות את אחוז השינוי ברפלקטיביות (R%) לאחר כניסתה של rhGH זינק בסרום אדם (זיהוי ישיר) ואחרי ההזרקה של NanoEnhancers (גילוי מוגבר) ל30,000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml, 2.5 pg / ml ו0.25 pg / ml. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

-page = "1"> כמו כן, את הספציפיות של biosensor ננו-SPRi הוערכה. דמוי אינסולין גורם צמיחה-1 (IGF-1) זינק בסרום אנושי שהוזרק כביקורת מאז hGH מגרה את הפרשת IGF-1 דרך קולטן הורמון גדילה על קרום hepatocyte. לאחר ההזרקה של IGF-1 בסרום, NanoEnhancers הוזרק ברצף ותגובת אות SPR לא הראתה שום ספציפית מחייב (איור 8). עם זאת, כאשר rhGH זינק במדגם סרום הוזרק לאותו המקום פונקציונליות עם נוגדן rhGH, שיפור אות נצפה. לסיכום, פלטפורמת ננו-SPRi הוכיחה סגוליות מצוינות וסלקטיביות לrhGH.

figure-results-8557
איור 8. הערכה של הסלקטיביות ננו-SPRi כלפי rhGH. תגובת biosensor ננו-SPRi לאחר ההזרקה של rhGH (שחור) וIGF-1 (אדום) ביםסרום piked. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניתוח מתאם בוצע באמצעות מקדם מתאם פירסון כדי לקבוע את הקשר בין עוצמת אות SPRi וערכי ELISA צפיפות אופטית (איור 9). P-value <0.01 נחשב משמעותי. כפי שמודגם בגרף זה, קיים מתאם טוב בין רמות rhGH בסרום אנושי ממוסמר שנמדדו על ידי SPRi וELISA. R-הערך היה .9263 ל9 מדגמים שונים.

figure-results-9408
איור 9. ניתוח מתאם פירסון בין ELISA וננו-SPRi. העלילה קושרת עוצמת אות ננו-SPRi (ציר y) עם צפיפות ELISA אופטית (ציר x) ערכים. (אגסיםעל מקדם מתאם n = 9, r = .9263, p = .00000183). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שיווי המשקל קבוע דיסוציאציה (K D) נקבע באמצעות תוכנת GraphPad לELISA. ערך K D המחושב היה כ 79 ננומטר (לוח 3). השיעורים על (K) ואת (ד K) לא יכולים להיקבע על ידי ELISA. עם זאת, שימוש בתוכנת ניתוח נתונים, שיטת זיהוי הישירה הביאה עם ערך D K של 23 PM באמצעות המסה המולקולרית של 22 kDa שמתאימה לאחד מולקולת rhGH. לסירוגין שיעורים חושבו להיות x10 6.1 7 M -1 s -1 ו1.33 x 10 -3 שניות -1, בהתאמה. זה מתרגם מטבע ש0.13% מריקבון rhGH ומתחמי נוגדן לשנייה. באשר לניסוי SPRi mplified, אינטראקציה כוללת חזקה נצפתה בין NanoEnhancers וrhGH כזיקה מחייבת מחושבת היה נחוש להיות 16:03. בנוסף, שיעור עמותה חזק נצפה לNanoEnhancers וrhGH מ נוגדן ללכוד / rhGH, אולם שיעור הניתוק עולה כי 0.26% מריקבון נוגדן NanoEnhancer / rhGH / לכידה לשנייה.

שִׁיטָה K D (זיקה) K (שיעור על-) ד K (מחוץ לשיעור) לוד
ELISA 79.45 x 10 -9 M NA NA ng 1 / מיליליטר
SPRi 23.2 x 10 -12 M 6.1 x 10 7 M -1 שניות -1 1.33 x10 -3 שניות -1 3.61 ng / ml
ננו-SPRi 4.33 x 10 -12 M 7.54 x10 8 M -1 שניות -1 2.62 x10 -3 שניות -1 .0092 Ng / ml

טבלת 3. ניתוח נתונים הקינטית מלא. הערכה של הזיקה, על-שיעור ומחוץ לשיעור של תגובות נוגדן באמצעות GraphPad (ELISA) וניתוח נתונים תוכנה (SPRi וננו-SPRi). קביעת הלהיטות באמצעות המסה המולקולרית של 22 kDa שמתאימה לאחד מולקולת rhGH נבחרה. גבולות האיתור נקבעו לכל שלושת מחקרים באמצעות Excel.

Discussion

רמות חריגות של HGH, הורמון טבעי, נמצאו קשורות להפרעות רפואיות רבות המשפיעות על צמיחה והתפתחות אנושיות. יתר על כן, ממשל אקסוגני של rhGH משמש בדרך כלל על ידי ספורטאים, למרות שזה אסור, כסוכן סמים כדי לשפר את הביצועים שלהם. אתגרים באיתור תוצאת שימוש לרעה rhGH מהקושי בהבחנה hGH אקסוגניים מטופס אנדוגני. ככזה, הטכניקה אושרה הנוכחית לאיתור hGH אקסוגניים מסתמכת על מדידת היחס של איזופורם kDa hGH 22 ביחס ל -20 איזופורם kDa. מאז דרישות מבחן איזופורם למדידה של HGH מרובה isoforms בו זמנית בתוך פרק זמן קצר במגוון רחב של ריכוזים, ולכן, אנו נחשבים פלטפורמת SPRi כהתאמה מושלמת. בנוסף, רמת ה- HGH אנדוגני להשתנות לרמה נמוכה מאוד (0.03 ng / ml) בזרם הדם ולכן מערכת האיתור חייבת להיות מסוגל למדוד טווח זה בנוחות עם גבוה specificity. כתוצאה מכך, אנחנו גם נחקרו במחקר זה את הפוטנציאל של ננו-SPRi ככלי אבחון לHGH והשווינו אותו ישירות עם SPRi וimmunoassay הקלאסי ELISA.

בהתבסס על תוצאות שהתקבלו ממחקר זה, היתרון העיקרי של שיטת SPRi וננו-SPRi הוא שריכוזי rhGH ניתן למדוד באופן מהיר יותר בהשוואה לשיטה המקובלת יותר ELISA. משך סטנדרטי למדידת רמות rhGH במדגם אחד עם שיטת זיהוי הישירה היה שעה 1 ואילו ננו-SPRi נדרש 2 שעות בשל צעדים נוספים בתהליך. בסך הכל, עם ניסויי SPRi וננו-SPRi, לפני ההזרקה של מדגם, צעד כיול מומלץ מאוד. בנוסף, ההזרקה של מדגם גולמי כמו תוצאות סרום אדם בכמה אינטראקציות שאינן ספציפיות כתוצאה זה הכרחי כדי להזריק חיץ לשטוף מלח גבוה לחשוף רק אינטראקציות ספציפיות. זה גם ראוי לציין כי שלב לשטוף הוא הכרחילאחר כניסתה של חסימת מולקולות על פני השטח החיישן, כדי להסיר מולקולות מאוגד. באשר לדרישות זמן ELISA הם הרבה יותר (~ שעות 16-18) לניתוח מדגם אחד. יש צורך בזמן דגירה ארוך יותר כמו הרגישות של assay מוגבר במיוחד למחקר זה, כמוקד היה להשוות את הגבול התחתון של זיהוי.

הבחירה של כימיה של פני השטח תשתנה מיישום אחד להמשנה וזה יכול להתממש כאחד מההגבלה של טכניקת SPRi. במחקר זה, מגוון ושילוב של linkers הכימי ומולקולות חסימה רחבים הוערכו על מנת להשיג את השילוב הנכון כדי לצפות יעילות מחייבת אופטימלית של rhGH אל פני השטח החיישן. לדוגמא, במחקר זה, שילוב של BSA וPEG שימש גם במזעור אינטראקציות שאינן ספציפיות. עם זאת, במחקר קודם 17, שבו ליגנד הלכידה היה aptamers, PEG שימש לבד כמולקולת החסימה הטובה ביותר. המשתניםשהיעילות להשפיע מחייבת של אנליטי ליגנד תלויה גם ברמת חומציות, חיץ וטמפרטורה. לכן, עם כל יישום, משתנה אלה צריכים להיות מותאמים. בנוסף, זה קריטי כדי לקבוע את ריכוז תצפית האופטימלי של יגנד אל פני השטח השבב. ניסוי טיטרציה עם מגוון רחב של ריכוזים של ligands המשותק מתבצע לפני ביצוע המחקר. באשר לELISA, שלב מכריע בהליך היה למזוג חיץ לשטוף מבארות על ידי הקשה על microplate כמו זה הבטיח לא נוזלי שיורית הוא שאריות. הסרת לשטוף החיץ עם פיפטה לא הייתה מספיק כמו כל נוזל שיורית הפריע לקריאת האות של מדגם היעד.

בהתייחסות לרגישות, ELISA (/ מיליליטר ng 1) דומה לSPRi (3.61 ng / ml) אבל ננו-SPRi (9.20 pg / ml) משפר את הרגישות על ידי שלושה סדרי גודל, ובכך מאפשר מדידות ברמות הביולוגיות נמוכות יותר של rhGH 0.03 ng / ml. כפי שדיווחנו בעבר 16,17, שיפור האות הנחילה ידי NanoEnhancers מיוחס להשפעה טעינה המונית והצימוד החזק שקיים בין fluorophores ניר וplasmons משטח הפצת עבור ננו סרט זהב. למרות ש, ננו-SPRi מוסיף צעד נוסף להליך, זה ברמה של רגישות יכולה להרחיב את היישומים של טכנולוגית SPRi בשקעים שונים.

SPRi מספק למדענים פרופיל הקינטית מלא (K D, K ו- D K) של נוגדן / אינטראקציה rhGH אילו ELISA יכול לדווח ערכי זיקה בלבד. מקדם שונה (CV) היה מתחת ל -10% לSPRi (4.1%) וELISA (6.5%), המצביע על שחזור טוב. ערכי זיקת ELISA וSPRi שונים בגלל נוגדני הלכידה משותקים על שבב החיישן שונים מנוגדנים המשותקים בצלחת 96-היטב ELISA. באשר לננו-SPRi ערך גבוה יותר קורות חיים (20%) נצפה. ישנם מספר פרמטרים שיכולים לתרום כמקור ErroRS לקביעת קורות חיים. לדוגמא, עם ניסוי ננו-SPRi ריכוז נמוך בהרבה של אנליטי שנמדד, התוספת של NanoEnhancers מוסיפה שלב נוסף בהליך והניסוי בוצע באופן ידני. מתאם טוב מאוד בין ננו-SPRi וELISA הושג לצורך זיהוי של rhGh בסרום אנושי ממוסמר. לבסוף, ELISA יכול להיות טכניקה אמינה עם זאת השיטה עצמה היא לצרוך זמן שהופך אותו קשה לשימוש במצבים הדורשים ניטור בזמן אמת וריבוב, כפי שהוא במקרה של HGH. בנוסף, תכונה אטרקטיבית יותר שלא נחקרה באופן ישיר במחקר זה שSPRi מציע מעל ELISA, היא היכולת למדוד מאות אינטראקציות בו זמנית בזמן אמת. לכן בעתיד, שיטת ננו-SPRi תוערך כדי לזהות סמנים ביולוגיים מרובים בו זמנית בזמן אמת (ריבוב) נוכחים בסרום בריכוזים שונים על מנת לבחון את הפוטנציאל שלה ככלי לאבחון קליני ובת קיימא.

Disclosures

M.G. Sandros is a consultant for Horiba Scientific. She has received honoraria for participation in oral presentations from: Horiba Scientific and Syngenta. The authors have no other relevant affiliations or financial involvement with any organization or entity with a financial interest in or financial conflict with the subject matter or materials discussed in the manuscript apart from those disclosed. No writing assistance was utilized in the production of this manuscript

Acknowledgements

NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody Acris AntibodiesDM1015
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP671-10
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody Acris AntibodiesAM09304BT-N
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide TCI AmericaD1601
EthanolamineAcros Organics 141-43-5
EthanolFisher Chemicals  BP2818-4
Human HGH ELISA Kit invitrogen KAQ1081
Human Serum Sigma Aldrich H4522  
Rabbit IgG Antibody Sigma Aldrich I5006
11-mercaptoundecanoic acid Sigma Aldrich 450561
Nanostrip Cyantek 
N-hydroxysuccinimide Sigma Aldrich 130672
Phosphate Buffer SalineInvitrogen 00-3002
Polyethylene glycol (800 Da) Sigma Aldrich 729108
Recombinant Human Growth Hormone Calbiochem869008
Sodium AcetateSigma Aldrich 127-09-3
Sodium Chloride Fisher Chemicals  7647-14-5
Streptavidin coated near infrared quantum dots Life Technologies Q10171MP
UV/Ozone ProcleanerBioforce Nanosciences 
Microwave reactor  CEM CorporationDiscover system 
SPRi-Arrayer  LabNext Xactll Microarray System 
SPR biochipHORIBA 
SPRi-Lab+HORIBA
Synergy Mx Multimode Microplate reader BioTek 
ScrubberGenHORIBAData Analysis software 

References

  1. Popii, V., Baumann, G. Laboratory measurement of growth hormone. Clinica Chimica Acta. 350 (1-2), 1-16 (2004).
  2. Higham, C. E., Trainer, P. J. Growth hormone excess and the development of growth hormone receptor antagonists. Exp Physiol. 93 (11), 1157-1169 (2008).
  3. Sönksen, P., Salomon, F., Cuneo, R. Metabolic effects of hypopituitarism and acromegaly. Horm Res. 36, 27-31 (1991).
  4. Molitch, M., et al. Evaluation and Treatment of Adult Growth Hormone Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 91 (5), 1621-1634 (2006).
  5. . . The World Anti-Doping Code: The 2015 Prohibited List International Standard. , (2015).
  6. . . The 2014 prohibited list world anti-doping code. , (2014).
  7. Langkamp, M., Weber, K., Ranke, M. B. Human growth hormone measurement by means of a sensitive ELISA of whole blood spots on filter paper. Growth Horm IGF Res. 18 (6), 526-532 (2008).
  8. Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
  9. Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
  10. Hoa, X. D., Kirk, A. G., Tabrizian, M. Toward Integrated Surface Plasmon Resonance Biosensors: A Review of Recent Progress. Biosens Bioelectron. 23 (2), 151-160 (2007).
  11. de Juan-Franco, E., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Implementation of a SPR immunosensor for the simultaneous detection of the 22K and 20K hGH isoforms in human serum samples. Talanta. 114, 268-275 (2013).
  12. de Juan-Franco, E., Caruz, A., Pedrajas, J. R., Lechuga, L. M. Site-directed antibody immobilization using a protein A-gold binding domain fusion protein for enhanced SPR immunosensing. Analyst. 138 (7), 2023-2031 (2013).
  13. Du, H., et al. Immunological screening and characterization of highly specific monoclonal antibodies against 20 kDa hGH. Bioanalysis. 4 (17), 2161-2168 (2012).
  14. Treviño, J., Calle, A., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Surface plasmon resonance immunoassay analysis of pituitary hormones in urine and serum samples. Clin Chim Acta. 403 (1-2), 56-62 (2009).
  15. Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R., Strasburger, C. J. Detection of doping with human growth hormone. Lancet. 353 (9156), 895 (1999).
  16. Malic, L., Sandros, M. G., Tabrizian, M. Designed biointerface using near-infrared quantum dots for ultrasensitive surface plasmon resonance imaging biosensors. Anal. Chem. 83 (13), 5222-5229 (2011).
  17. Vance, S. A., Sandros, M. G. Zeptomole Detection of C-Reactive Protein in Serum by a Nanoparticle Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Aptasensor. Sci. Rep. 4 (5129), 1-7 (2014).
  18. Uludag, Y., Tothill, I. E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification. Anal. Chem. 84 (14), 5898-5904 (2012).
  19. Špringer, T., Homola, J. Biofunctionalized gold nanoparticles for SPR-biosensor-based detection of CEA in blood plasma. Anal Bioanal Chem. 404 (10), 2869-2875 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

107immunoassay

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved