בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Arianna R. Lark; Toshihiro Kitamoto; Jean-René Martin

doi:10.3791/53705

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

כאן אנו מציגים רומן Ca ^{2 +} גישת -imaging באמצעות כתב bioluminescent. גישה זו משתמשת בGFP-aequorin מבנה התמזגה אשר נקשר Ca ^{2 +} ופולט אור, ומבטל את הצורך בעירור אור. באופן משמעותי בשיטה זו מאפשרת הדמיה ארוכה רציפה, גישה למבני מוח עמוקים ורזולוציה גבוהה זמנית.

Abstract

פונקציונלי in vivo ההדמיה הפכה לגישה רבת עוצמה כדי לחקור את הפונקציה ופיזיולוגיה של תאי מוח ומבנים של עניין. לאחרונה שיטה חדשה של Ca ^{2 +} -imaging באמצעות GFP-aequorin כתב bioluminescent (GA) פותחה. טכניקה חדשה זו מסתמכת על השילוב של גני GFP וaequorin, ייצור מסוגל מחייב סידן ומולקולה - בתוספת coelenterazine cofactor - פולטות אור בהיר שיכול להיות במעקב באמצעות אספן פוטון. קווים מהונדסים נושאים את גן GFP-aequorin כבר נוצרו עבור שני עכברים ודרוזופילה. בדרוזופילה, גן GFP-aequorin הושם תחת השליטה של מערכת הביטוי בינארי GAL4 / כטב"מ המאפשרת ביטוי ממוקד והדמיה בתוך המוח. שיטה זו לאחר מכן הוצגה להיות מסוגלת לזהות שני פנימה Ca ^{2 +} -transients וCa ^{2 +} -released מחנויות פנימיות. והכי חשוב זה מאפשר לזמן רב יותר בהקלטה רציפה, הדמיה בעומקים גדולים יותר במוח, והקלטה ברזולוציות גבוהות זמניות (עד 8.3 אלפיות שני). כאן אנו מציגים שיטה הבסיסית לשימוש בהדמית bioluminescent להקליט ולנתח Ca ^{2 +} -activity בתוך גופי פטריות, מבנה מרכזי ללמידה וזיכרון במוח הזבוב.

Introduction

הדפוסים והתפקוד של פעילות במוח והמבנים הדיסקרטיים הבסיסיים כבר זמן רב על שטח של מחקר אינטנסיבי בתחום מדעי המוח. אולי חלק מהגישות המוצלחות המוקדמות נהגו לטפל בבעיה זו היו מדידה פיזיולוגית ישירה של השינוי בפעילות חשמלית - שיטות חלופיות עם זאת, המאפשרות הדמיה חיה של שינויים בריכוזי מתח, pH או סידן (כמו פרוקסי לפעילות) הביאה יכולות נוספות ל המחקר של פעילות עצבית ^1. טכניקות הדמיה לבצע מגוון רחב של יתרונות כגון הפולשנות מופחתת ואת היכולת לעקוב אחר פעילות בתוך מבני מוח כולו. יתר על כן בבעלי חיים עם גנטיקה צייתנית כוללים זבוב הפירות דרוזופילה, פיתוח של אינדיקטורים סידן מקודדים גנטיים, כגון Cameleon, GCaMPs ואחרים ¹ איפשר לחוקרים לעקוב אחר תאי עצב בודדים, אוכלוסיות נוירונים וכל מוחמבנים. בעוד שיטות ניאון מסורתיות יותר סידן הדמיה באמצעות GCaMPs (GFP התמזג calmodulin) או סריג (CFP ו YFP התמזג calmodulin) הוכיח להיות טכניקות שימושיות מתן החלטת מרחב ובזמן טוב, התהליך הבסיסי של עירור אור מוליד כמה מגבלות עליה ניסיוני יישומים. בשל האופי של עירור אור, autofluorescence, צילום הלבנת, וphototoxicity מיוצרים באופן בלתי נמנע, שכתוצאה מכך מגביל את העומק של המבנים שניתן הדמיה, משך ההקלטות כמו גם המשכיות בזמן אמת של הקלטה. במילים אחרות, הקלטות חייבות לעתים קרובות נעשות לסירוגין, כדי למנוע תופעות לוואי בלתי רצויים אלה.

בגלל אתגרים אלה, שיטות חלופיות נוספות של הדמיה סידן פותחו. אחת השיטות המבטיחות ביותר הוא הדמיה bioluminescent, אשר מסתמכת על אור מופק באמצעות תגובה האנזימטית לאחר סידן מחייב. Bioluminescenהדמיה לא אינה דורשת עירור אור וכתוצאה מכך אינו חווה אותם הקשיים כמו סידן הדמיה קונבנציונלית. כתב bioluminescent Aequorin - מבודד מויקטוריה Aequorea, אותו המדוזות שממנו GFP גם isolated- נקשר סידן באמצעות שלושה מבני יד EF ועובר שינוי קונפורמציה, מוביל לחמצון של coelenterazine cofactor ואת שחרורו של אור הכחול (λ = 469 ננומטר) ^2,3. יש Aequorin זיקה נמוכה מאוד ל( _ד K = 10 מיקרומטר) סידן שהופך אותו אידיאלי עבור ניטור ארעיים סידן משום שהיא מייצרת רעש רקע מעט מאוד ולא מפריעה למערכת אגירת סידן תוך תאי ^4. למרות aequorin כבר השתמש בעבר כדי לפקח על התהליך של אינדוקציה עצבית בביצה הצפרדעים ⁵ האור המיוצר הוא עמום מדי לשימוש עבור הדמיה בזמן אמת של פעילות עצבית. במאמץ להתמודד עם אתגר זה, פיליפ Br ו# 251; בואו ועמיתיו במכון פסטר נוצרו מבנה גנטי פיוזינג GFP וaequorin גנים, מחקה את המדינה האם של המדוזה בתוך ^4. מוצר גן היתוך זה נקשר סידן שוב באמצעות שלושת מבני EF היד של aequorin, שעובר שינוי קונפורמציה המוביל לחמצון של coelenterazine, המעביר אנרגיה שאינה radiatively לGFP. תוצאות זה העברת אנרגיה בשחרורו של אור ירוק (λ = 509 ננומטר) מGFP, במקום אור הכחול מaequorin. ההיתוך של ה- GFP וaequorin גם מקנה יציבות חלבון גדולה יותר עוזרת אור תוצרת חלבון היתוך 19-65 פעמים בהירות יותר aequorin לבד ^4. שימוש בגישה bioluminescent בתוך המוח מרחיבה את היישום הניסיוני הנוכחי של סידן הדמיה הן מבחינת משך ההקלטה רציפה ומספר המבנים במוח שיכול להיות מוקלט. באופן כללי בהקשר של עבודה קודמת זה אומר ששניהם גלובלי וגדול יותרמגוון של "פעילות" regionalized של המוח יכול להיות במעקב (באמצעות פרוקסי של ארעיים סידן). יותר מכך פעילות יכולה להיות במעקב למשך זמן ארוכה יותר, בזמן אמת ובסיס מתמשך, אשר משאיל את עצמו בקלות למרדף של הבנה מלאה של תפקוד בסיסי במוח.

בשנים האחרונות, המעבדה ואחרים שלנו פיתחו זבובים מהונדסים המבטאים את ה- GFP-aequorin תחת השליטה של מערכת הביטוי בינארי (GAL4 / כטב"מ-GFP-aequorin) ^5,6. השתמשנו פליטת אור GFP-aequorin לפעילות שיא המיוצרת על ידי גירויים טבעיים כגון ריח ^7,8, כמו גם המרכיבים התאיים למדו ויסות -activity Ca ^{2 +} בגופי הפטרייה בעקבות גירוי קולטן האצטילכולין ידי יישום ניקוטינית ישיר ^9. בנוסף, יש לנו גם משמש GFP-aequorin להתייחס מספר השאלות ניסיוניות שלא היו מסוגל לטפל בעבר, כמו לטווח ארוךהדמיה של ארעיים סידן ספונטני והדמיה של מבני מוח עמוקים יותר ^10. לאחרונה, השתמשנו במערכת / כטב"מ GAL4 להביע קולט ATP היונקים P2X ₂ ¹¹ ערוץ קטיון, בנוירונים ההקרנה (PNS) והשתמשתי במערכת LexA להביע GFP-aequorin בגופי הפטריות (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (באדיבות ב פייפר, Janelia Farm, ארה"ב). זה אפשר לנו להפעיל את PNS על ידי יישום של ה- ATP, אשר בתורו מפעיל את גוף הפטרייה (יעד במורד הזרם של PNS), מחקה יותר תנאים טבעיים, כגון התגובה לגירוי ריח. בסך הכל טכניקה זו משלבת P2X ₂ וה- GFP-aequorin מרחיבה את האפשרויות הניסיוניות. באופן כללי היא מציעה את ההזדמנות כדי להבין טוב יותר את דפוסי הפעילות במוח, ייזום מחקרים חדשים על איך גירויים והפרעות שונים יכולים לשנות את הדפוסים הבסיסיים של פעילות.

Protocol

1. הכנת דוגמאות

הכנה של פתרונות ולהגדיר
1. לשמור את כל קווי תסיסנית melanogaster ב 24 מעלות צלזיוס במדיום מזון סטנדרטי. אחורי ולשמור אותם בצפיפות נמוכה בבקבוקון כדי ליצור גודל סטנדרטי ומשקל של זבובים.
  1. הוסף 10 נקבות הבתולה עם 10 גברים בבקבוקון, לתת להם להזדווג ולהעביר אותם כל 2 ימים לבקבוקון טרי. אז 10 ימים לאחר מכן, כאשר הזבובים מתחילים eclose, לקצור את הזבובים בכל יום. שמור תיעוד מדויק של גיל הזבובים ולשמור אותם במצב טוב.
  2. ביום 3, להפריד את הזכרים מהנקבות ולשמור על הנקבות 20 זבובים בכל בקבוקון. רשום את הזבובים בשעה 4 או 5 ימים-ישן.
2. הכן את הפתרון של רינגר עם הריכוזים הבאים: 130 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ MgCl _2, 2 סוכרוז מ"מ CaCl _2, 5 מ"מ HEPES, ו -36 מ"מ ולהתאים את ה- pH של התמיסה לבדיוק 7.3. הכן את פתרונות זלוף של 25 μ; ניקוטין M ו- 100 מ"מ KCl בפתרון של רינגר.
3. הכן 1,000 קצה פיפטה μl: באמצעות קצה צורת סכין גילוח לשיפוע (כ -35 מעלות מקצה של קצה) ולהסיר בסיס עודף מעבר ½ 1 סנטימטר מקצה.
4. תיבה לאחסון (23 סנטימטרים X 17 סנטימטרים X 8.5 סנטימטרים) של מדגם להכין במהלך דגירה. מניחים שני ספוגים (12 סנטימטרים X 8 סנטימטרים X 3 סנטימטרים) רוויים במים בתחתית [כדי למנוע התייבשות מדגם] להלן מנגנון מדף קטן למקום דגימות כהכנה שלהם הושלמה.
5. הכן דגימות זבובים כך שהם מכילים לפחות עותק 1 של כטב"מ-GFP-aequorin ועותק אחד של קו Gal4 לנהוג ביטוי של ה- GFP-aequorin. קו OK107 Gal4 (ביטוי קו נהיגה בעיקר בגופי הפטריות) הוא חצה עם כטב"מ-GFP-aequorin בהכנה זו.
  הערה: בתוך הקופסה חייב להיות עמיד למים ומחוץ חייב לחסום אור מתיבת הכניסה כדי למנוע השפלה של coelenterazine במהלך דגירה.
Preparation של דגימות
1. קרח להרדים תסיסנית על ידי העברתו לבקבוקון זכוכית ולשמור על קרח למשך 2 דקות לפני שעברתי לצלחת פטרי הצונן למיצוב בקצה פיפטה. הכן טיפים פיפטה על נייר סינון לח מעט ב100 מיליליטר צלחת פטרי על קרח תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
2. בעדינות עם מקום מלקחיים לטוס בתוך קצה פיפטה.
3. בעזרת מברשת בעדינות לדחוף וליישר לטוס כך שהראש הוא לגמרי מעבר לקצה של קצה ואזור הגב חשוף בחלקו על ידי הסעיף הוסר במהלך עיצוב קצה (איור 2).
4. לשלב מנות קטנות (כ 3-4 μl) של שני רכיבים של דבק השיניים. החל הדבק בזהירות סביב הקדמי ואחורי ראש וצוואר ומטה ולמסביב לקצה קצה pipet - הימנעות הכתר של הראש. בואו דבק יבש למשך 2 דקות.
5. טיפ פיפטה מקום עם זבוב מודבק דרך חור בתא הקלטה (איור 2 ד) ודורtly לחץ כדי לאבטח במקום.
6. לשלב את שני רכיבים של דבק סיליקון (כ 3-4 μl). החל דבק בצד השטוח של תא לאורך הקצה שבו התא ונפגש קצה פיפטה כדי למנוע דליפה של הפתרון של רינגר. בואו דבק יבש למשך 2 דקות.
נתיחה
1. להדביק סרט על ערוץ זלוף, קצה קצר והארכת לחלק האחורי של החדר.
2. הנח קאמרי עם זבוב על בלוק נתיחה תחת מיקרוסקופ תור במנורת פלורסנט. מיליליטר pipet 1 של הפתרון של רינגר לתא.
3. השתמש בסכין כירורגית עדין להסרת ציפורן. ודא חתכים מקבילים מהחלק האחורי של הראש לאזור מחושים. ואז לחתוך לאורך הקצה של העין אז לעשות חתך בניצב מעל אנטנת חיבור החתכים הקודמים. הפוך מקביל חתך סופי שבחלק האחורי של הראש. השתמש במלקחיים החדים בסדר להסיר ציפורן (איור 2 ג).
4. שימוש במלקחיים חדים בסדר לתפוס בעדינותד שם ברור נחשף רקמת נשימה עד המוח וגוף פטרייה [fluorescing] בבירור דמיינו.
5. שימוש במלקחי אולטרה חד לתפוס בזהירות ולצבוט רקמת neuroepithelial מכסה מוח כדי לאפשר חלחול של coelenterazine.
  הערה: לחלופין פפאין יכול לשמש כדי permeabilize neuroepithelia ^9.
6. באמצעות pipet, לשטוף את פעמיים עם הפתרון של רינגר כדי להסיר את כל פסולת מן הנתיחה ומדגם מקום בתיבה הכהה.
7. מיליליטר pipet 1 של הפתרון של רינגר המכיל 5 מיקרומטר נזיל-coelenterazine לתוך התא. סגור את התיבה ולאפשר דגירה עם coelenterazine ב RT עבור מינימום של 2 שעות.

2. הדמיה

להכין
1. התחל מערכת הקלטה: להפעיל מערכת ניקוז מיקרוסקופ, מחשב, מצלמה וחדר קבע בקרות סביבתיות עד 25 מעלות צלזיוס.
2. מדידה פתוחה ותכנית האוטומציה Explorer במחשב. לחץ על “ מכשירים וממשקים ", לאחר מכן לחץ פעמיים על" מכשירי תנועת NI "ולבסוף לחץ לחיצה ימנית על" PCI-7334 "ובחר" לאתחל את המכשיר ".
3. פתח פוטון Imager. צור תיקייה חדשה וקובץ הקלטה הראשון שם. מצלמה חייבת להגיע -80 ° C לפני שהמערכת תתפקד.
4. מערכת זלוף להגדיר - להוסיף KCl, ניקוטין, והפתרון של רינגר למאגרים ולהתאים כך כל פריקות פתרון של 2 מיליליטר / דקה. לשטוף עם הפתרון של רינגר לפני תחילת ניסוי.
הכן מדגם
1. הדמיה מקום הר צלחת בלוק על הר תחת מיקרוסקופ בהגדלה 5X ולהכניס צינור טפטוף לתוך ערוץ דרך נקב.
2. מיקרוסקופ המוגדר למצב ניאון אז מרכז ולהביא את הגוף פטרייה (MBS) אל מוקד. התאם ל20X ומחדש מרכז ומיקוד.
3. מנגנון ניקוז עמדה מעל בריכת ניקוז, להתאים את הגובה של מחלף הניקוז כך הקצה הוא רק abovבריכה האלקטרוני, ולהפעיל הפתרון של רינגר למשך 30 שניות כדי להבטיח ניקוז הולם.
4. ניתץ מגן לאטום את המנגנון מהאור. שימוש במערכת האוטומטית בתרמי פוטון לבצע התאמות עדינות למוקד ולקחת תמונת ניאון התייחסות של MBS.
הַקלָטָה
1. התאם את מהירות פוטון למהירות הקלטה רצויה (בין 50 אלפיות השניים עד 1 שניות או יותר). מצב בחר פוטון ותריס פתוח. שיא גנוטיפ, מין, גיל, ומספר מדגם בערכי יומן. התאם תיבות ROI עמדה על גביע וגופי תא (CCB) ואונות המדיאלי על ידי לחיצה על תיבות החזר על ההשקעה וגרירה תוך החזקת שליטה.
2. שיא בסיס לכ -5 עד 10 דקות (כרצוי).
3. החל ניקוטין דקות 1. הערה להתחיל / לעצור ביומן. לשטוף עם הפתרון של רינגר במשך 5 דקות.
4. חכה 5 דקות להתאוששות ולהכין KCl רישום ביומן וטיימר.
5. החל KCl דקות 1. הערה להתחיל / לעצור ביומן. לשטוף עם הפתרון של רינגר דקות 1.
6. מֶתֶגלמצב ניאון, לקחת תמונת ניאון סופית, ולכבות את הפתרון של רינגר.
7. לחץ על "עצור". תיבת הדו-שיח תבקש לכבות את המערכת. בחר "לא" כדי להמשיך את הקלטה.
8. מגן פתוח, מערכת ניקוז מהלך, מטרת עדשת מתג ל5X, להסיר צינור זלוף. הסר מדגם / צלחת הקלטה מבמה, לנקות את עדשת 20X על ידי שטיפה וניגוב העדשה פעמיים עם מים.
9. לחץ על לחצן הפעלה הלבן בחלק העליון של חלון התכנית ליזום ההקלטה הבאה.

3. ניתוח ויצירת וידאו

לחלץ ערכי פוטון
1. פתח את תכנית ניתוח הפוטון (למשל, הפוטון Viewer) ומדגם הראשון קובץ גיליון אלקטרוני פתוח.
2. בחר בכרטיסייה בקרת תצוגה. בחר את ההחזר על ההשקעה על ידי לחיצה על האזור תוך החזקת שליטה. להתאים את הגודל, כיוון וצורה של אזורים של עניין להקיף CCB המואר GFP ואונות המדיאלי.
3. להוסיף בנוסףאל ROI על ידי לחיצה על "הגדר החזר על השקעה" ולחיצה וגרירה על מסך כדי ליצור את ההחזר על ההשקעה החדשה.
4. בחר בכרטיסייה "הסרט" לשחק וידאו פוטון. התאם "רוחב שניות" ו- "צעדי שניות" כרצוי. כוון מיקום ROI צורך.
5. בחר תמונות מסך נציג של הקרינה GFP, תגובת ניקוטין ותגובת KCl. צילומי מסך יבול ותמונה להדביק לתוך שקופיות מצגת לניתוח והשוואה מאוחר יותר.
6. התאם שני "רוחב שניות" ו- "צעד שניות" למהירות ההקלטה בשניות. בחר אורך של ניתוח על ידי הזזת סמנים אפורים על פנל העליון לאזור הסוגר לפני תחילת גירוי ורק לאחר סיום תגובה.
7. בחר "להשעות צפיות בעת ששחקה" עיתונות "<< REW" ו" PLAY> "עיתונות. בחר בכרטיסייה "רוזן תרשים דרג" ולהתאים את היחידות כרצויות וצבעי קו כדי להתאים צבע החזר על השקעה.
8. כאשר הניתוח נגמר, לחץ על "יצוא רוזן קצב נתונים". צילומי מסך בחירה של CCB הקלטות משולבים ואזור אונה המדיאלי של עניין מכל צד. צילומי מסך יבול ותמונה להדביק לתוך שקופיות עם תמונות תגובה. שקופית זו תהיה מאוחר יותר השתמשה בניתוח סופי.
דוגמא ניתוח: שיטה אחת לניתוח של נתונים פוטון שחולצו מפורטים
1. פתח את קבצי הגיליון האלקטרוני בתיקייה "רוזן יצוא דרג".
2. לאתחל מחדש את התאים זמן העמודה שכותרתה הראשון כדי להציג את הזמן בשעה ודקות.
3. התייחסות לשקופית המתאימה למדגם. הסר את כל הערכים מלבד הטורים בפעם והנציג ROIs שני.
4. לקבוע שעת התחלת גירוי ניקוטין - זמין בקובץ רישום ביומן בעיקרי folder- להסיר נתונים נוספים לפני תחילה או ערך גולת כותרת.
5. מצא את הערך הגבוה ביותר / שיא עבור שני CCB ואונה המדיאלי וסימן / גולת כותרת.
6. לקבוע התחלת תגובה וזמן סיום עבור שניCCB ואונה המדיאלי על ידי יצירת הערכה באמצעות נקודת זמן ממקביל בגרף תגובה בשקופית ובחרו ערך בפועל על ידי שינוי בערכים בסמוך לנקודות אלה. הדגש את האזור שבין הנקודות הללו בשני CCB ואונות המדיאלי. לחלופין, להשתמש במאקרו ^9.
7. מערבבים את כל הדגימות של קבוצה אחת ניסיונית בגיליון אלקטרוני חדש.
8. יישר בשיא על ידי קביעת ערך השורה הוא עבור כל ערך שיא CCB. הפחת את הערכים נמוכים יותר מהערך הגבוה ביותר בשורה לקביעת שווי שורה המשוערת שבו שנתוני המדגם חייבים להיות recopied ל. ודא שכל ערכי השיא מיושרים.
9. העתק את גיליון פעמיים ולמחוק או עמודות אונה המדיאלי או עמודות CCB יצירת דפים של CCB בלבד או ערכי אונה המדיאלי.
10. הסר נתונים לאחר כל תגובות CCB הסתיימו. ליצור ארבע שורות כותרת סה"כ פוטונים, אורך תגובה (משך), שיא משרעת, ותגובת חביון. להעתיק ולהדביק שוב זה מתחת למקור.
11. השתמש בפונקצית SUM כדי לקבוע פוטונים כולל במהלך תגובה. השתמש בפונקצית COUNT כדי לקבוע אורך של תגובה. העתק ולקשר תא הערך הגבוה ביותר לקביעת שווי משרעת שיא. השתמש בפונקצית COUNT - בחר מההתחלה של טפטוף של ניקוטין לתחילת התגובה - כדי לקבוע תגובת חביון.
12. ערכי העתקה על ידי שימוש בפונקציה המקשרת ולהכפיל (כולם מלבד משרעת שיא) על ידי הקלטת מהירות בשניות.
13. גרפים בר / תיבה עשויים להיווצר לפרמטרים מחושבים כגון סה"כ פוטונים, שיא משרעת, ואורך תגובה, אם כך רצויים (לשעבר .: איור 5, C, D).
14. בעמודה לאחר תגובת פוטון נתונים הגולמית, בממוצע נקודות נתונים הגולמיים לכל נקודת זמן באמצעות פונקציה ממוצעת. אם מעקב רצוי עם טור קביעת שגיאת התקן של הממוצע (SEM), עבור כל אחד מערכי הפוטון בממוצע בנקודת זמן.
15. השתמש בעמודה הממוצעת לבניית Profil תגובה ממוצעתדואר [גרף] לקבוצת מדגם CCB. כדי לעשות זאת בחר בעמודה המפרטת את הזמן כערכי ציר X והטור של ערכי פוטון הממוצע כציר y ולבסוף בחר בכלי יצירת גרף scatterplot.
16. חזור על תהליך ניתוח זה עם נתונים מהאונות המדיאלי.
יצירת תמונות לוידאו
1. הצופה פוטון פתוח.
2. כרטיסיית בקרת תצוגה בחר. לחץ על החזר על השקעה תוך החזקת שליטה כדי לבחור, להסיר ו / או למזער אותו.
3. לשנות "רוחב שניות" (זמן הצטברות) כרצוי כדי לקבוע את התוכן של כל מסגרת.
4. לשנות "צעד שניות" כדי להגדיר את החפיפה של כל מסגרת.
5. בחר "נופי יצוא בעת ששחק" העיתונות "<< REW" ואז "PLAY>". התמונות לווידאו ניתן לייצא לתיקייה "יצוא מבט" כסדרה של קבצי .png.
באמצעות דאב וירטואלי לעשות וידאו: שיטה אחת לוידאו גreation מפורט
1. צור תיקייה חדשה בשם "resultats" הבמכילה תמונות תיקיית יצוא נוף.
2. להביא תסריט (renommer.VBS) לתוך התיקייה של תמונות.
3. לחץ לחיצה כפולה על renommer.VBS לרוץ.
4. תמונות באופן אוטומטי לשנות את שמם מבחינה מספרית והעתיקו לתיקייה "resultats".
5. VirtualDub.exe הפתוח.
6. בחר קובץ וידאו פתוח - בחר תמונה ראשונה (תמונות שלאחר מכן באופן אוטומטי לטעון).
7. וידאו בחר - במסגרת שיעור בחר להתאים כרצונכם.
8. וידאו בחר - דחיסה בחר לבחור Cinepak Codec ידי רדיוס.
9. בקובץ בחר שמירה כAVI הווידאו ייווצר באופן אוטומטי.

תוצאות

ההיתוך של ה- GFP לaequorin מאפשר לנו לדמיין האזור של עניין לפני ההדמיה bioluminescent דרך עירור של ה- GFP במצב ניאון על המיקרוסקופ (איור 3 א, 4 א, א 6, 6-ה). אחת הדרכים הפשוטות ביותר כדי לעורר את גוף הפטרייה הוא באמצעות הפעלה של קולטני אצטילכולין ניקוטינית ionotropic. למרות אצטילכ?...

Discussion

גישת GFP-aequorin פותחה לאחרונה מבוסס bioluminescent מוצגת כאן מאפשרת הקלטה פונקציונלית vivo של -activity Ca ^{2 +} בתאי עצב שונים, כמו גם אם ארצה בכך, בסוג של תאים כמו תאי stellate כליות אחרים כפי שדווחה באל Cabrero et. 2013 ^5.

ש?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
CaCl₂	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
KCl	prolabo	26 764.298	normapur
MgCl₂	prolabo	25 108.295	normapur
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/
dental glue	3M ESPE™	46954	Protemp IV
silicon glue	3M ESPE™	36958	Express 2 Regular Body Quick
tape	3M Scotch	122s	3M Scotch Magic Tape
pipette tips	Corning Incorporated	4868	100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage)			hand made
incubation box			hand made
forceps (No. 5)	Fine Science Tools	11252-00	Micro-dissecting forceps
curved forceps	Sigma-Aldrich	F4142	Micro-dissecting forceps
glue applicator			hand made
knife	Fine Science Tools	10316-14	5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (cooled to -80 °C)
Microscope	Nikon		Eclipse-E800
immersion objective lens	Nikon		20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence	Leica MZ Fl III		leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box	Science Wares		Custom built by Science Wares
peristaltic pump	Gilson		Minipuls 2
tubing	Fisher Scientific	depends on thickness	Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system	Warner	64-0135 (VC-66CS)	Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators	Leventon	201108	Dosi-flow 3
measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
virtual dub	open access	N/A	software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2	Martin et al., 2007, Ref. 1	N/A	No stocks {currently} publicly available
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP	B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.	(STOCK #1117340)	pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X₂	Lima and Misenboeck, Ref. 11	N/A	No stocks {currently} publicly available
OK107	Bloomington stock center	854	http://flystocks.bio.indiana.edu/

References

Martin, J. -. R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -. R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience 107 Ca 2 imaging bioluminescent GFP Aequorin P2X 2

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: