In Vivo cérébrale fonctionnelle approche d'imagerie à base de calcium Bioluminescent Indicateur GFP-aequorine

Résumé

Nous présentons ici un roman Ca ²⁺ -Imagerie approche utilisant un journaliste bioluminescente. Cette approche utilise une construction GFP-aequorine condensé qui se lie au ^Ca 2+ et émet de la lumière, éliminant le besoin d'une lumière d'excitation. Significativement cette méthode permet à long imagerie continue, l'accès à des structures profondes du cerveau et une haute résolution temporelle.

Résumé

Fonctionnelle imagerie in vivo est devenu une approche puissante pour étudier la fonction et la physiologie des cellules et des structures d'intérêt cerveau. Récemment, une nouvelle méthode de Ca ²⁺ -Imagerie utilisant le journaliste bioluminescente GFP-aequorine (GA) a été développé. Cette nouvelle technique repose sur la fusion des gènes GFP et l'équorine, produisant une molécule capable de lier le calcium et - avec l'ajout de son coelentérazine cofacteur - émettant une lumière vive qui peut être contrôlé par un collecteur de photons. Les lignées transgéniques portant le gène de la GFP-aequorine ont été générés pour les souris et la drosophile. Chez la drosophile, le gène GFP-aequorine a été placé sous le contrôle du système d'expression binaire GAL4 / UAS permet une expression ciblée et de l'imagerie à l'intérieur du cerveau. Cette méthode a été démontré par la suite pour être capable de détecter à la fois vers l'intérieur ^de Ca2 + et ^Ca2 + -transients -released dans les magasins internes. Et surtout, il permet une plus grande durée de l'enregistrement en continu, l'imagerie à plus grande profondeur dans le cerveau, et l'enregistrement à des résolutions temporelles élevées (jusqu'à 8,3 msec). Ici, nous présentons la méthode de base pour l'utilisation de l'imagerie bioluminescente pour enregistrer et analyser Ca ²⁺ -Activité dans les corps pédonculés, une structure centrale à l'apprentissage et la mémoire dans le cerveau de la mouche.

Introduction

La structuration et la fonction de l'activité dans le cerveau et ses structures discrètes fondamentale ont longtemps été un domaine d'étude intense dans le domaine des neurosciences. Peut-être que certaines des premières approches utilisées avec succès pour traiter cette question étaient mesure physiologique directe de la modification de l'activité électrique - méthodes cependant alternatives qui permettent l'imagerie en direct des changements dans les concentrations tension, pH ou de calcium (comme proxy pour l'activité) ont apporté des capacités supplémentaires à l'étude de l'activité neuronale ^1. Les techniques d'imagerie comportent une large gamme d'avantages tels que l'invasivité et réduit la capacité de surveiller l'activité à l'intérieur de structures cérébrales entières. En outre, dans les animaux avec la génétique dociles dont la mouche drosophile, le développement d'indicateurs de calcium codés génétiquement, tels que Cameleon GCaMPs ^et autres 1 ont permis aux chercheurs de surveiller les neurones simples, populations neuronales et le cerveau entierstructures. Bien que plusieurs méthodes d'imagerie de calcium fluorescentes traditionnelles utilisant GCaMPs (GFP fusionnée à la calmoduline) ou FRET (CFP et YFP fusionnée à la calmoduline) se sont révélés être des techniques utiles offrant une bonne résolution spatiale et temporelle, le processus sous-jacent de la lumière d'excitation engendre quelques limitations sur sa expérimentale applications. En raison de la nature de la lumière d'excitation, autofluorescence, photo-blanchiment, la phototoxicité et sont inévitablement produite, ce qui limite en conséquence la profondeur des structures qui peuvent être imagés, la durée des enregistrements ainsi que la continuité de temps réel de l'enregistrement. En d'autres termes, les enregistrements doivent souvent être effectuées de façon intermittente pour éviter ces effets secondaires indésirables.

En raison de ces défis, nouvelles méthodes de rechange imagerie calcique ont été développés. Une des méthodes les plus prometteuses est l'imagerie bioluminescente, qui repose sur la lumière produite par une réaction enzymatique après liaison calcium. Bioluminescent imagerie ne nécessite pas de lumière d'excitation et par conséquent ne pas éprouver les mêmes difficultés que l'imagerie calcique conventionnelle. Le journaliste bioluminescente Aequorin - isolé de Aequorea victoria, même Jellyfish à partir de laquelle la GFP a été isolated- aussi se lie au calcium par l'intermédiaire de ses trois structures de main EF et subit un changement de conformation, conduisant à l'oxydation de sa coelentérazine cofacteur et la libération de la lumière bleue (λ = 469 nm) ^2,3. Aequorine a une très faible affinité pour le calcium (K _{d =} 10 uM) ce qui le rend idéal pour la surveillance transitoires calciques parce qu'il produit très peu de bruit de fond et ne pas interférer avec le système tampon de calcium intracellulaire ^4. Bien que l'aequorine a déjà été utilisé pour surveiller le processus d'induction neurale dans l'œuf Xenopus ⁵ de la lumière produite est trop faible à utiliser pour l'imagerie en temps réel de l'activité neuronale. Dans un effort pour relever ce défi, Philippe Br &# 251; laisser et ses collègues de l'Institut Pasteur créé une construction génétique fusion GFP et l'équorine gènes, imitant l'état natif dans le méduses ^4. Ce produit de gène de fusion se lie au calcium de nouveau par l'intermédiaire des trois structures de la main EF de l'aequorine, qui subit un changement de conformation qui conduit à l'oxydation de la coelentérazine, qui transfère l'énergie non radiatif à la GFP. Ce transfert d'énergie entraîne la libération de la lumière verte (λ = 509 nm) de la GFP, la place de la lumière bleue de l'aequorine. La fusion de la GFP et l'équorine confère également une plus grande stabilité de la protéine aider le produisent de la lumière de la protéine de fusion de 19 à 65 fois plus brillante que l'équorine seule ^4. En utilisant une approche bioluminescent dans le cerveau augmente l'application expérimentale courant de l'imagerie de calcium en termes de la durée d'enregistrement continu et le nombre de structures dans le cerveau qui peuvent être enregistrées. Large dans le contexte des travaux antérieurs, cela signifie que la fois globale et une plus grandevariété de «activité» régionalisée du cerveau peut être surveillé (par le proxy des transitoires de calcium). Plus important encore l'activité peut être surveillée pendant plus longtemps, dans un temps réel et de manière continue, ce qui se prête facilement à la poursuite d'une compréhension complète de la fonction basale dans le cerveau.

Au cours des dernières années, notre laboratoire et d'autres ont développé des mouches transgéniques exprimant la GFP-aequorine sous le contrôle du système d'expression binaire (GAL4 / UAS-GFP-aequorine) ^5,6. Nous avons utilisé la GFP-aequorine bioluminescence à l'activité d'enregistrement produite par des stimuli naturels tels que le parfum ^7,8, ainsi que les composants cellulaires étudiés modulation Ca ²⁺ -Activité dans les corps pédonculés suivantes acétylcholine stimulation du récepteur nicotinique par l'application directe ^9. En outre, nous avons également utilisé GFP-aequorine pour répondre à un certain nombre de questions expérimentales qui ont pas pu être abordées précédemment, comme à long termeImagerie de transitoires calciques spontanées et la visualisation des structures plus profondes du cerveau ^10. Plus récemment, nous avons utilisé le système / UAS GAL4 pour exprimer le récepteur de mammifère ATP P2X ₂ ¹¹ un canal de cation, dans les neurones de projection (PNS) et utilisé le système LexA pour exprimer GFP-aequorine dans les corps pédonculés (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (une gracieuseté de B. Pfeiffer, Janelia Ferme, États-Unis). Cela nous a permis d'activer les unités de raccordement par l'application de l'ATP, qui active à son tour les corps pédonculés (une cible en aval de la SNP), imitant des conditions plus naturelles, comme la réponse à un stimulus d'odeur. Globalement, cette technique combinant P2X _{2 et} GFP-aequorine élargit les possibilités expérimentales. Globalement, il offre la possibilité de mieux comprendre les tendances de l'activité dans le cerveau, engager de nouvelles études sur la manière dont différents stimuli et des perturbations peuvent modifier la structuration de l'activité basale.

Protocole

1. Préparation des échantillons

1. Préparation des solutions et mettre en place
   1. Maintenir toutes les lignes de Drosophila melanogaster à 24 ° C sur un milieu alimentaire standard. Arrière et de les garder à faible densité dans le flacon pour générer la taille et le poids normalisé de mouches.
      1. Ajouter 10 femelles vierges avec 10 hommes dans un flacon, laissez-les accoupler et les transfèrent tous les 2 jours pour un nouveau flacon. Ensuite, 10 jours plus tard, quand les mouches commencent à Eclose, récolter vol tous les jours. Gardez une trace précise de l'âge de vol et de les garder en bon état.
      2. Au jour 3, séparer les mâles des femelles et de garder les femelles 20 mouches par flacon. Enregistrez les mouches à 4 ou 5 jours-vieux.
   2. Préparer la solution de Ringer avec les concentrations suivantes: NaCl 130 mM, KCl 5 mM, _MgCl2 2 mM, _CaCl2 2 mM, HEPES 5 mM, et 36 mM de saccharose et ajuster le pH de la solution à 7,3 avec précision. Préparer des solutions de perfusion de 25 μ; M nicotine et KCl 100 mM dans une solution de Ringer.
   3. Préparer 1.000 pointe de la pipette ul: en utilisant une pointe en forme de lame de rasoir pour une inclinaison d'environ 35 ° (à partir de la fin de la pointe) et enlever l'excès de base au-delà de 1 ½ centimètres de la pointe.
   4. Boîte pour le stockage (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) de l'échantillon Préparer pendant l'incubation. Placer deux éponges (12 cm x 8 cm x 3 cm) est saturé d'eau en bas [échantillon pour empêcher la dessiccation] ci-dessous un petit appareil de grille à placer sur des échantillons que leur préparation est terminée.
   5. Préparer les échantillons de mouches afin qu'ils contiennent au moins 1 copie de l'UAS-GFP-aequorine et une copie d'une ligne Gal4 pour conduire l'expression de la GFP-aequorine. Ligne OK107 Gal4 (une expression de la ligne de conduite principalement dans les corps pédonculés) est croisé avec UAS-GFP-aequorine dans cette préparation.
      NOTE: L'intérieur de la boîte doit être imperméable à l'eau et l'extérieur doit bloquer la lumière de la boîte d'entrer à prévenir la dégradation de coelentérazine pendant l'incubation.
2. Préparationaration d'échantillons
   1. Ice anesthésier la drosophile en le transférant à un flacon de verre et de garder sur la glace pendant 2 min avant d'être déplacé vers la boîte de Pétri réfrigérés pour le positionnement dans la pointe de la pipette. Préparer des embouts de pipette sur du papier filtre légèrement humide dans 100 ml boîte de Pétri sur de la glace sous le microscope de dissection.
   2. Délicatement avec une pince lieu voler à l'intérieur de la pointe de la pipette.
   3. Utiliser une brosse pousser doucement et aligner mouche sorte que la tête est complètement passé au bord de la pointe et de la région dorsale est partiellement exposé par la section enlevée pendant la pointe de mise en forme (figure 2B).
   4. Combinez une petite (environ 3-4 pi) des parties des deux composants de la colle dentaire. Appliquer la colle soigneusement autour de l'avant et à l'arrière tête et du cou vers le bas et autour du bord de la pointe de pipette - en évitant la couronne de la tête. Laisser sécher la colle pendant 2 min.
   5. Lieu pointe de la pipette à la mouche collée dans le trou de chambre d'enregistrement (figure 2D) et genappuyez sur tly pour sécuriser en place.
   6. Combiner les deux composants de la colle de silicium (environ 3-4 pi). Appliquez de la colle sur le côté plat de la chambre le long du bord où la chambre et embout de pipette se rencontrent pour empêcher la fuite de la solution de Ringer. Laisser sécher la colle pendant 2 min.
3. Dissection
   1. Apposez du ruban adhésif sur le canal de perfusion, bord court et se prolongeant à l'arrière de la chambre.
   2. Placez la chambre à la mouche sur le bloc de dissection sous microscope tour sur lampe fluorescente. Pipet 1 ml de la solution de Ringer dans la chambre.
   3. Utilisez bistouri fin pour enlever la cuticule. Faire des incisions parallèles à l'arrière de la tête à la région antennaire. Ensuite, couper le long du bord de l'œil puis faire une incision verticale au-dessus antenne reliant les incisions précédentes. Faire une incision finale parallèle à celle à l'arrière de la tête. Utilisez la pince pointe fine pour enlever la cuticule (figure 2C).
   4. Utilisez une pince pointe fine pour saisir délicatement uneD déblayer exposée tissu respiratoire jusqu'à ce que le cerveau et [fluorescent] corps de champignon est clairement visualisées.
   5. Utilisez une pince ultra-forte à saisir attentivement et pincer le tissu neuroépithéliale couvrant le cerveau pour permettre la perméation de l'coelentérazine.
      NOTE: Vous pouvez également papaïne peut être utilisé pour perméabiliser la neuroepithelia ^9.
   6. En utilisant une pipette, laver deux fois avec la solution de Ringer pour enlever tous les débris de la dissection et placer l'échantillon dans la boîte noire.
   7. Pipet 1 ml de la solution de Ringer contenant 5 uM benzyl-coelentérazine dans la chambre. Fermez la boîte et laisser incubation avec coelentérazine à température ambiante pendant un minimum de 2 heures.

2. Imaging

1. Installer
   1. Commencez système d'enregistrement: allumer microscope, ordinateur, caméra et système de drainage et mis en chambre contrôles environnementaux à 25 ° C.
   2. Ouvrir mesure et le programme Automation Explorer sur l'ordinateur. Cliquer sur “ Périphériques et interfaces ", puis double-cliquez sur" Périphériques mouvement Ni "et cliquez enfin à droite sur" PCI-7334 "et sélectionnez" dispositif initialiser ".
   3. Ouvrez Photon Imager. Créer un nouveau dossier et le nom premier fichier d'enregistrement. Caméra doit atteindre -80 ° C avant que le système fonctionnera.
   4. Mettre en place le système de perfusion - ajouter KCl, la nicotine, et la solution de Ringer à des réservoirs et d'ajuster ainsi les décharges chaque solution à 2 ml / min. Laver avec une solution de Ringer avant de commencer l'expérience.
2. Préparer l'échantillon
   1. Lieu imagerie montage plat de bloc sur le mont sous le microscope au grossissement 5X et insérer le tube de perfusion dans le canal à travers la ponction.
   2. Réglez microscope en mode fluorescent puis centre et apporter corps pédonculés (MBS) dans le foyer. Réglez à 20X et re-centre et de concentration.
   3. Drainage appareil de Position sur la piscine de drainage, réglez la hauteur de la dérivation de drainage pour que la pointe est juste Abovpiscine e, et exécuter la solution de Ringer pendant 30 secondes afin d'assurer un drainage adéquat.
   4. Déroulez bouclier pour sceller l'appareil de la lumière. En utilisant le système automatisé de photons imageur effectuer des réglages fins à la mise au point et de prendre une image fluorescente de référence de la MBS.
3. Enregistrement
   1. Régler la vitesse de photons à la vitesse d'enregistrement désirée (de 50 msec jusqu'à 1 seconde ou plus). Sélectionnez le mode de photons et de l'obturateur ouvert. Génotype d'enregistrement, le sexe, l'âge, et le nombre d'échantillons dans les entrées de journal. Ajustez la position des boîtes de ROI plus calice et les corps cellulaires (BCC) et des lobes médians en cliquant sur les boîtes de retour sur investissement et en faisant glisser tout en maintenant le contrôle.
   2. Base de registre pour environ 5 à 10 minutes (selon vos besoins).
   3. Appliquer la nicotine pendant 1 min. Remarque démarrer / arrêter dans le journal. Laver avec la solution de Ringer pendant 5 min.
   4. Attendez 5 min pour la récupération et préparer KCl entrée et de minuterie journal.
   5. Appliquer KCl pendant 1 min. Remarque démarrer / arrêter dans le journal. Laver avec la solution de Ringer pendant 1 min.
   6. Interrupteuren mode fluorescent, prendre dernière image fluorescente, et éteignez la solution de Ringer.
   7. Appuyez sur «Stop». La boîte de dialogue vous demandera d'éteindre le système. Sélectionnez «Non» pour continuer l'enregistrement.
   8. Ouvrir bouclier, système de drainage de déplacement, objectif de l'interrupteur à 5X, retirer le tube de perfusion. Retirer l'échantillon / boîte d'enregistrement de l'étape, nettoyer l'objectif 20X d'un rinçage et d'essuyer la lentille à deux reprises avec de l'eau.
   9. Appuyez sur le bouton blanc de jeu en haut de la fenêtre du programme pour lancer l'enregistrement suivant.

3. Analyse et Création vidéo

1. Extraire des valeurs de photons
   1. Ouvrez le programme d'analyse de photons (par exemple, Photon Viewer) et le fichier de tableur premier échantillon est ouvert.
   2. Sélectionnez l'onglet de commande d'affichage. Sélectionnez le ROI en cliquant sur la région tout en maintenant le contrôle. Ajuster la taille, l'orientation et la forme de régions d'intérêt pour englober GFP CCB illuminée et lobes médians.
   3. Ajouter un ajoutal ROI en cliquant sur "Définir ROI" et en cliquant et en faisant glisser sur l'écran pour créer la nouvelle ROI.
   4. Sélectionnez l'onglet «Movie» à jouer photons vidéo. Réglez "largeur de sec» et «étapes de SEC» comme vous le souhaitez. Réajuster le placement de ROI que nécessaire.
   5. Sélectionnez des captures d'écran représentatives de fluorescence de la GFP, la réponse à la nicotine et la réponse de KCl. Screenshots des cultures et l'image de la pâte dans une diapositive de présentation pour une analyse ultérieure et la comparaison.
   6. Ajuster à la fois la "largeur de sec» et «étape de s" à la vitesse d'enregistrement en secondes. Sélectionnez la longueur de l'analyse en déplaçant les marqueurs gris sur le panneau supérieur à la région de support avant de relance l'initiation et juste après la fin de la réponse.
   7. Sélectionnez «Suspendre vues tout en jouant" presse "<< REW" et appuyez sur "PLAY>". Sélectionnez l'onglet "Cadence de comptage Graphique" et ajuster les éléments souhaités et que les couleurs des lignes pour correspondre à la couleur de ROI.
   8. Lorsque l'analyse est terminée, Appuyez sur "Exporter comte Data Rate". Sélectionnez des captures d'écran de combiné enregistrements CCB et la région du lobe médial de l'intérêt de chaque côté. Screenshots de récoltes et image de coller dans un diaporama avec les images de réponse. Cette diapositive sera utilisé plus tard dans l'analyse finale.
2. Analyse Exemple: une méthode pour l'analyse des données de photons extraits détaillés
   1. Ouvrez les fichiers de tableur dans le dossier "Count exportations de taux".
   2. Reformater les cellules de la première colonne intitulée temps pour afficher l'heure en heures et minutes.
   3. Référence de la glissière correspondante pour l'échantillon. Retirer toutes les valeurs sauf les colonnes pour le temps et les deux représentant ROI.
   4. Déterminer la nicotine heure de début de la stimulation - disponible dans le fichier d'entrée de journal dans le principal dossier- supprimer des données supplémentaires avant de commencer ou de la valeur de surbrillance.
   5. Trouver plus haute valeur / pic à la fois pour la BCC et le lobe médial et marque / highlight.
   6. Déterminer début de réponse et de fin pour les deuxCCB et le lobe médial en créant une estimation en utilisant le point de temps de réponse correspondant graphiquement sur la diapositive et sélectionnez valeur réelle par le changement dans les valeurs à proximité de ces points. Mettez en surbrillance la région entre ces deux points dans la BCC et lobes médians. Vous pouvez également utiliser une macro ^9.
   7. Mélanger tous les échantillons d'un groupe expérimental sur une nouvelle feuille de calcul.
   8. Aligner sur la visière en déterminant la valeur de la ligne est pour chaque valeur de crête de la BCC. Soustraire les valeurs inférieures de la valeur de la ligne la plus élevée pour déterminer la valeur approximative de la ligne où les données que les échantillons doivent être recopiés à. Vérifiez que toutes les valeurs de crête sont alignés.
   9. Copiez la feuille à deux reprises et supprimer soit les colonnes du lobe médial ou les colonnes de la création de pages de CCB ne CCB ou des valeurs de bossage médian.
   10. Supprimer les données après les toutes les réponses CCB ont terminé. Créez quatre rangées étiquetés Nombre de photons, longueur de réponse (durée), Amplitude de crête, et la latence de réponse. Copiez et collez ce nouveau ci-dessous les originaux.
   11. Utilisez la fonction SOMME pour déterminer photons totales au cours de la réponse. Utilisez la fonction COUNT pour déterminer la longueur de la réponse. Copier et lier la cellule de valeur la plus élevée pour déterminer la valeur d'amplitude crête. Utilisez la fonction COUNT - sélectionnez depuis le début de la perfusion de nicotine pour le début de la réponse - pour déterminer la latence de réponse.
   12. Valeurs de copie à l'aide de la fonction de liaison et se multiplient (tous sauf amplitude crête) en enregistrant la vitesse en quelques secondes.
   13. Graphiques bar / boîte peuvent être créés pour les paramètres calculés tels que Total des photons, Amplitude de crête, et réponse de la longueur, si désiré (ex .: figure 5B, C, D).
   14. Dans la colonne après la réponse brute de photons de données, la moyenne des points de données brutes pour chaque point de temps en utilisant la fonction moyenne. Si désiré suivi d'une colonne à déterminer l'erreur standard de la moyenne (SEM), pour chacune des valeurs moyennes des photons à un point de temps.
   15. Utilisez la colonne de la moyenne de construire un profil de réponse moyene [Graphique] pour le groupe de l'échantillon de la BCC. Pour ce faire, sélectionnez la colonne spécifiant le temps que les valeurs de l'axe des x et la colonne des valeurs moyennes de photons que l'axe des ordonnées et enfin sélectionner l'outil de création graphique de nuage de points.
   16. Répéter ce procédé d'analyse avec les données provenant des lobes médians.
3. Création d'images pour la vidéo
   1. Ouvrir spectateur de photons.
   2. Sélectionnez l'onglet de commande d'affichage. Cliquez sur le ROI tout en maintenant le contrôle pour sélectionner, supprimer et / ou minimiser.
   3. Modifier "largeur de sec" (temps d'accumulation) comme vous le souhaitez afin de déterminer le contenu de chaque trame.
   4. Modifier "étape de sec» pour définir le chevauchement de chaque trame.
   5. Sélectionnez "vues d'exportation tout en jouant" presse "<< REW", puis sur "PLAY>". Les images de la vidéo seront exportés vers le dossier "vue des exportations" comme une série de fichiers .png.
4. Utilisation de Virtual Dub à faire de la vidéo: une méthode pour la vidéo création détaillée
   1. Créer un nouveau dossier nommé "resultats" dans le dossier vue des exportations contenant les images.
   2. Apportez Script (renommer.VBS) dans le dossier d'images.
   3. Double-cliquez sur renommer.VBS à exécuter.
   4. Images seront automatiquement renommés numériquement et copiés dans le dossier «resultats".
   5. Ouvrir VirtualDub.exe.
   6. Sélectionnez le fichier vidéo ouvert - Sélectionnez première image (images suivantes se chargeront automatiquement).
   7. Sélectionnez une vidéo - select frame rate ajuster comme vous le souhaitez.
   8. Sélectionnez une vidéo - sélectionner une compression sélectionner le codec Cinepak par le rayon.
   9. Dans le fichier sélectionnez Enregistrer sous AVI la vidéo sera automatiquement créé.

Résultats

La fusion de la GFP à l'aequorine permet de visualiser la région d'intérêt à l'imagerie bioluminescente préalable par excitation de la GFP en mode fluorescent sur ​​le microscope (Figure 3A, 4A, 6A, 6E). Une des façons les plus simples pour stimuler les corps pédonculés est par l'activation des récepteurs nicotiniques ionotropes de l'acétylcholine. Bien que l'acétylcholine est le ligand endogène de ce récepteur, nous avons trouvé que la nicotine produit des ré...

Discussion

L'approche de la GFP-aequorine basé bioluminescent-développé récemment présenté ici permet in vivo enregistrement fonctionnel de ^Ca2 * -Activité à différents neurones, ainsi que le cas échéant, dans d'autres types de cellules telles que des cellules de rein étoilées tel que rapporté dans Cabrero et al. 2013 ^5.

Modifications, tir ennuis, des composants supplémentaires, et les étapes critiques

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
CaCl2	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
KCl	prolabo	26 764.298	normapur
MgCl2	prolabo	25 108.295	normapur
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/
dental glue	3M ESPE™	46954	Protemp IV
silicon glue	3M ESPE™	36958	Express 2 Regular Body Quick
tape	3M Scotch	122s	3M Scotch Magic Tape
pipette tips	Corning Incorporated	4868	100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage)			hand made
incubation box			hand made
forceps (No. 5)	Fine Science Tools	11252-00	Micro-dissecting forceps
curved forceps	Sigma-Aldrich	F4142	Micro-dissecting forceps
glue applicator			hand made
knife	Fine Science Tools	10316-14	5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (cooled to -80 °C)
Microscope	Nikon		Eclipse-E800
immersion objective lens	Nikon		20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence	Leica MZ Fl III		leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box	Science Wares		Custom built by Science Wares
peristaltic pump	Gilson		Minipuls 2
tubing	Fisher Scientific	depends on thickness	Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system	Warner	64-0135  (VC-66CS)	Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators	Leventon	201108	Dosi-flow 3
measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
virtual dub	open access	N/A	software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2	Martin et al., 2007, Ref. 1	N/A	No stocks {currently} publicly available
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP	B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.	(STOCK #1117340)	pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2	Lima and Misenboeck, Ref. 11	N/A	No stocks {currently} publicly available
OK107	Bloomington stock center	854	http://flystocks.bio.indiana.edu/