JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем роман Ca 2+ -imaging подход с использованием биолюминесцентного репортера. Этот подход использует конденсированную конструкт GFP-экворин, который связывается с Са 2+ и излучает свет, устраняя необходимость в возбуждении светом. Значительно этот метод позволяет длительной непрерывной визуализации, доступ к глубинных структур головного мозга и высоким временным разрешением.

Аннотация

Функционал естественных изображений стала мощным подход к изучению функции и физиологию клеток головного мозга и структур, представляющих интерес. Недавно был разработан новый метод Ca 2+ -imaging помощью биолюминесценции репортер GFP-экворин (GA). Этот новый метод опирается на слияния GFP и экворин генов, производя молекулу, способную связываться кальций и - с добавлением его кофактора коэлентеразина - излучающих яркий свет, который можно наблюдать через фотонов коллектора. Трансгенные линии, несущие ген GFP в-экворин были получены для мышей и Drosophila. У Drosophila, ген GFP-экворин был помещен под контроль системы двоичной GAL4 / UAS позволяет направленной экспрессии и визуализации в головном мозге. Этот метод впоследствии было показано, чтобы быть способным обнаруживать и внутрь Ca 2+ -transients и Са 2+ -released от внутренних магазинов, Самое главное это позволяет в большей продолжительности в непрерывной записи изображений на больших глубинах в пределах мозга, и записи на высоких временным разрешением (до 8,3 мс). Здесь мы представляем основной метод для использования биолюминесцентного изображений для записи и анализа Ca 2+-активности в течение грибных тел, структуру центрального к обучению и памяти в летучей мозга.

Введение

Основная рисунка и функции деятельности в головном мозге и его отдельных структур уже давно является областью интенсивного изучения в области неврологии. Возможно, некоторые из самых ранних успешных подходов, используемых для решения этого вопроса были прямыми физиологическое измерение изменения в электрической активности - однако альтернативные методы, которые позволяют жить визуализации изменений напряжения, рН или кальция концентрации (как прокси-сервер для деятельности) привели дополнительные возможности для изучение нейронной активности 1. Методы визуализации выполнять широкий спектр преимуществ, таких как снижение инвазивности и способности контролировать деятельность в целом структур головного мозга. Кроме того, в животных с послушными генетики в том числе плодовой мушки дрозофилы, развитие генетически кодируемых показателей кальция, таких как Cameleon, GCaMPs и других 1 позволили исследователям следить одиночные нейроны, нейронные популяции и весь мозгструктуры. В то время как более традиционные люминесцентные методы визуализации кальция с помощью GCaMPs (GFP, слитый с кальмодулина) или беспокоиться (CFP и YFP, слитый с кальмодулина) оказались полезные методы, обеспечивающие хорошее пространственное и временное разрешение, основной процесс светового возбуждения порождает некоторые ограничения на его экспериментальное Приложения. Из-за природы света возбуждения, флуоресценции, фото-отбеливания, и фототоксичности неизбежно производимого, которые, следовательно, ограничивает глубину структур, которые могут быть отображаемого, продолжительность записи, а также непрерывность реального времени записи. Другими словами, записи, часто должна быть выполнена с перерывами, чтобы избежать этих нежелательных побочных эффектов.

Из-за этих проблем, были разработаны дополнительные альтернативные методы визуализации кальция. Одним из наиболее перспективных методов биолюминесцентного изображений, которая опирается на свете получаемой посредством ферментативной реакции после связывания кальция. Bioluminescenт изображения не требует света возбуждения и, следовательно, не испытывает те же трудности, как и обычные изображения кальция. Биолюминесцентного репортера акворина - изолирован от Aequorea Виктория, то же самое, из которого медузы GFP был также isolated- связывает кальций помощью трех ручных EF структур и проходит конформационное изменение, что приводит к окислению его кофактора коэлентеразином и выхода синего света (λ = 469 нм) 2,3. Акворина имеет очень низкое сродство к кальцию (K D = 10 мкм), что делает его идеальным для мониторинга переходных кальция, поскольку он производит очень мало шума и фонового не мешает системе буферизации внутриклеточного кальция 4. Хотя экворин ранее использовался для наблюдения за процессом индукции нервной в Xenopus яйца 5 свет производится слишком тусклый, чтобы использовать для реального времени визуализации нейронной активности. В целях решения этой проблемы, Филиппа Br &# 251; пусть и коллеги в Институте Пастера создали генетическую конструкцию слияния GFP и экворин гены, имитируя естественное состояние в 4 медуз. Этот ген слитого продукта связывает кальций снова с помощью трех ручных EF структур акворина, которые претерпевает конформационное изменение, ведущий к окислению коэлентеразином, который передает энергию без радиационно к GFP. Эта передача энергии приводит к высвобождению зеленого света (λ = 509 нм) с GFP, а не синим светом от акворина. Слияние GFP и акворина также придает большую стабильность белка помогает слитого белка производят свет от 19 до 65 раз ярче, чем в одиночку экворин 4. Использование биолюминесцентного подход в головном мозге расширяется текущее экспериментальное использование визуализации кальция как с точки зрения длительности непрерывной записи и количества структур в головном мозге, которые могут быть записаны. В широком смысле в контексте предыдущей работы это означает, что как глобальные и большееРазнообразие регионализации "деятельности" мозга могут контролироваться (через прокси-сервер переходных кальция). Что еще более важно деятельность может контролироваться дольше, в режиме реального времени и постоянной основе, которые легко поддается погоне за полного понимания базисной функции в головном мозге.

В последние несколько лет, наша лаборатория и другие разработали трансгенных мух, выражающие GFP-экворин под контролем двоичной системе экспрессии (GAL4 / UAS-GFP-экворин) 5,6. Мы использовали GFP-экворин биолюминесценции для записи активности при естественных раздражителей, таких как запах 7,8, а также изученных клеточных компонентов, модулирующих Ca 2+-активности в грибных тел следующих рецептора ацетилхолина стимуляции прямой никотиновой применения 9. Кроме того, мы также использовали GFP-экворин решить ряд экспериментальных вопросов, которые не смогли быть рассмотрены ранее, как долгосрочныеизображения спонтанных переходных кальция и визуализации глубоких структур головного мозга 10. Совсем недавно мы использовали систему / UAS GAL4 выразить млекопитающих рецептор АТФ Р2Х 2 11 катион канала, в проекционных нейронов (ПНС) и использовать систему Lexa, чтобы выразить GFP-экворин в грибных тел (MB247-Lexa, 13XLexAop2-ИВС-G5A-ВР) (любезность Б. Пфайффер, Janelia Farm, США). Это позволило нам активизировать ПН применением СПС, в свою очередь, активирует грибные тела (вниз по течению целевых ПНС), имитируя более естественные условия, такие как ответ на запах раздражитель. В целом этот метод объединения Р2Х 2 и GFP-экворин расширяет экспериментальные возможности. В широком смысле это дает возможность лучше понять закономерности деятельности мозга, инициируя новые исследования о том, как различные стимулы и возмущения могут изменять базальную паттерна активности.

протокол

1. Получение образцов

  1. Приготовление растворов и настроить
    1. Поддерживать все дрозофилы линии на 24 ° C по стандартной пищевой среде. Задняя и держать их при низкой плотности во флаконе для генерации стандартизированного размера и веса мух.
      1. Добавьте 10 девственных самок с 10 мужчин в пробирке, пусть спариваться и передавать их через каждые 2 дня на свежем флакон. Затем 10 дней спустя, когда мухи начинают eclose, урожай мух каждый день. Держите точный учет возраста мух и держать их в хорошем состоянии.
      2. В 3-й день, отделить самцов от самок и держать самок мух за 20 флакона. Запишите мух на 4 или 5 дней от роду.
    2. Готовят раствор Рингера с следующих концентрациях: 130 мм NaCl, 5 мМ КСl, 2 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ HEPES и 36 мМ сахарозы и регулировать рН раствора, чтобы точно 7,3. Подготовка перфузии решения 25 ц; М никотина и 100 мМ KCl в растворе Рингера.
    3. Подготовьте 1000 мкл пипетки: с помощью кончика лезвия форма для бритвы уклоном (примерно 35 ° от конца наконечника) и снимите излишки базу за 1 ½ см от кончика.
    4. Подготовьте коробку для хранения (23 см х 17 см х 8,5 см) образца во время инкубации. Поместите два губки (12 см х 8 см х 3 см) насыщенных водой в низ [для предотвращения высыхания образец] ниже небольшую стойку аппарата разместить образцы на их получение завершено.
    5. Подготовка образцов мух, так что они содержат, по меньшей мере 1 экземпляр УАС-GFP-акворина и один экземпляр строки Gal4 ездить выражение GFP-акворина. OK107 Gal4 линия (линия выражение вождения в первую очередь в грибных тел) пересекается с UAS-GFP-акворина в этой подготовке.
      Примечание: Внутри коробки должно быть водонепроницаемым и снаружи должны блокировать свет от входа окно для предотвращения деградации коэлентеразином во время инкубации.
  2. Приготовительныйтовка образцов
    1. Лед обезболить дрозофилы путем передачи его в стеклянном флаконе и держать на льду в течение 2 мин, после чего переехал в охлажденной чашке Петри для размещения на кончике пипетки. Подготовка наконечники на слегка смоченной фильтровальной бумаги в 100 мл чашке Петри на льду под микроскопом рассечение.
    2. Аккуратно пинцетом месте летать внутри пипетки.
    3. Используя щетку осторожно нажмите и выровнять муху, так что головка полностью за край наконечника и область дорсальной частично подвергается секцией удалены во наконечника формирования (Фигура 2В).
    4. Комбинат небольшие (примерно 3-4 мкл) части двух компонентов зубной клея. Нанесите клей тщательно вокруг передней и задней головы и шеи до и вокруг пипетки наконечник краю - избежать темя. Пусть клей сохнуть в течение 2 мин.
    5. Место пипетки с клееного лету через отверстия в записи камеры (рис 2D) и генTLY нажмите чтобы обеспечить на месте.
    6. Объедините две компоненты клея кремния (примерно 3-4 мкл). Нанесите клей на плоской стороне камеры вдоль края, где камера и пипетки встречаются, чтобы предотвратить утечку раствора Рингера. Пусть клей сохнуть в течение 2 мин.
  3. Рассечение
    1. Прикрепите ленты на перфузии канала, коротким краем и распространяется на задней части камеры.
    2. Поместите камеру с лету на рассечение блока под микроскопом свою очередь на люминесцентной лампе. Внесите 1 мл раствора Рингера в камеру.
    3. Используйте тонкую хирургическую нож, чтобы удалить кутикулу. Сделайте надрезы параллельно от задней части головы до усиков регионе. Затем разрезать вдоль края глаза затем сделать надрез перпендикулярно над антенной, соединяющей предыдущие разрезы. Сделать окончательный разрез параллельно, что в задней части головы. Используйте мелкие острые щипцы для удаления кутикулы (рис 2С).
    4. Используйте мелкие острые щипцы осторожно схватитьD убрать подвергается дыхания ткани, пока мозг и [флуоресцирующий] тела гриба не четко визуализируется.
    5. Используйте ультра-острые щипцы тщательно понять и щепотку нейроэпителиальных ткани, покрывающей мозг, чтобы позволить проникновение в коэлентеразина.
      Примечание: В качестве альтернативы папаин можно использовать для проницаемыми нейроэпителия 9.
    6. С помощью пипетки, вымыть два раза с раствором Рингера для удаления любого мусора от вскрытия и место образца в темный ящик.
    7. Внесите 1 мл раствора Рингера, содержащего 5 мкМ бензил-коэлентеразин в камеру. Закройте окно и позволить инкубации с коэлентеразином при комнатной температуре в течение как минимум 2 ч.

2. изображений

  1. Настроить
    1. Начните системы записи: включить микроскоп, компьютер, фотоаппарат и дренажной системы и установленного комнате экологического контроля до 25 ° C.
    2. Открыть Измерение и программа Automation Explorer на компьютере. Нажмите на “ Устройства и интерфейсы ", а затем дважды нажмите на" NI Motion Devices "и, наконец, щелкните правой кнопкой на" PCI-7334 "и выберите" инициализации устройства ".
    3. Откройте Photon Imager. Создать новую папку и имя первого файла записи. Камера должна достичь -80 ° С перед система будет функционировать.
    4. Настройка перфузии система - добавить KCl, никотин, и раствор Рингера для водоемов и регулировать таким образом, каждое решение разрядов в 2 мл / мин. Промыть раствором Рингера до начала эксперимента.
  2. Подготовка образца
    1. Место установки блока формирования изображения на блюдо горе под микроскопом на увеличении 5X и вставьте перфузии трубки в канал через прокол.
    2. Установите микроскоп флуоресцентный режим, то центр и принести грибные тела (MBS) в центре внимания. Отрегулируйте 20X и повторного-центра и фокуса.
    3. Позиция дренажное устройство дренажной над бассейном, отрегулируйте высоту дренажного шунта так, чтобы кончик просто Абове бассейн, и запустить раствор Рингера для 30 сек, чтобы обеспечить достаточный дренаж.
    4. Потяните вниз щит для герметизации аппарата от света. Использование автоматизированной системы в фотонной тепловизора точной регулировки фокуса и принять ссылка флуоресцентное изображение МБ.
  3. Запись
    1. Регулировка скорости фотонов на необходимую скорость записи (от 50 мс до 1 сек или более). Выберите режим фотонов и открытый затвор. Запись генотип, пол, возраст и номер образца в записи журнала. Отрегулируйте положение коробки ROI более чашечки и клеточных тел (CCB) и медиальной долей нажав на коробках ROI и перетащив удерживая контроль.
    2. Запись базовой около 5 до 10 мин (по желанию).
    3. Применить никотина в течение 1 мин. Примечание запустить / остановить в журнале. Промыть раствором Рингера в течение 5 мин.
    4. Подождите 5 минут для восстановления и подготовки KCl запись журнала и таймер.
    5. Применить KCl в течение 1 мин. Примечание запустить / остановить в журнале. Промыть раствором Рингера в течение 1 мин.
    6. Переключательфлуоресцентного режиме, принять окончательное флуоресцентное изображение и выключите раствор Рингера.
    7. Нажмите "Остановить". Диалоговое окно попросит выключить систему. Выберите "Нет", чтобы продолжить запись.
    8. Открыть щит, дренажная система шаг, переключатель линзовый объектив с 5-кратным, удалить перфузии трубку. Удалить образец / записи блюдо из стадии очистки от 20X объектив, промывки и протирки линз в два раза водой.
    9. Нажмите белую кнопку воспроизведения в верхней части окна программы, чтобы начать следующий запись.

3. Анализ и видео Создание

  1. Извлечение значения фотонов
    1. Откройте программу анализа фотонов (например, Фотон просмотра) и открыть файл электронной таблицы первый образец.
    2. Выберите вкладку управления дисплеем. Выберите ROI, нажав на области, удерживая контроль. Отрегулируйте размер, ориентацию и форму регионах, представляющих интерес, чтобы охватить GFP подсветкой CCB и медиальной долей.
    3. Добавить добавлениеаль ROI, нажав "Определить рентабельность инвестиций" и перетаскивая на экране, чтобы создать новую ROI.
    4. Выберите вкладку "Кино", чтобы играть фотонов видео. Отрегулируйте ширину "сек" и "шаги ТРЦ" по желанию. Отрегулируйте расположение ROI по мере необходимости.
    5. Выберите представительства скриншоты GFP флуоресценции, никотина и ответ KCl ответ. Земледелие скриншоты и паста изображения в презентации слайд для последующего анализа и сравнения.
    6. Отрегулируйте как "ширина сек" и "сек шаг" к скорости записи в секундах. Выберите длину анализа, перемещая серые маркеры на верхней панели, чтобы кронштейн регионе до начала стимула и сразу после окончания реакции.
    7. Выберите "Приостановить Просмотры играя" нажмите "<< REW" и нажмите "PLAY>". Выберите вкладку "Граф Оценить Chart" и отрегулируйте единиц по желанию и цвета линии в соответствии с цветом ROI.
    8. Когда анализ завершенНажмите "Экспорт граф скорость передачи данных". Выберите скриншоты комбинированного звукозаписей CCB и медиальной доли интересующей области от каждой стороны. Земледелие скриншоты и паста изображения в слайд с изображением реагирования. Этот слайд будет позже использоваться в конечном счете.
  2. Пример Анализ: один метод анализа извлеченных данных фотонов подробно
    1. Откройте файлы электронных таблиц в "скорость счета экспорт" папку.
    2. Переформатировать ячеек первого столбца помечены время, чтобы показать время в час и минут.
    3. Ссылки на соответствующий слайд для образца. Удалить все значения, кроме колонн на время и два представительства РИ.
    4. Определить никотина стимуляции время начала - доступны в файле журнала входа в главный папке- удалить дополнительные данные до начала или выделить значение.
    5. Найти высокий / пиковое значение для обоих CCB и медиальной доли и марки / подсветки.
    6. Определить начало отклика и время окончания иБКК и медиальная лопасть, создавая оценку, используя временную точку из соответствующих графике ответа на слайде и выберите фактическое значение по изменению значений в близости к этим пунктам. Выделите область между этими точками как в БКК и средних долях. В качестве альтернативы, используйте макрос 9.
    7. Смешайте все образцы одной экспериментальной группе на новую электронную таблицу.
    8. Выравнивание на пике путем определения значения строка для каждой пикового значения CCB. Вычтите более низкие значения от самого высокого значения строки, чтобы определить приблизительное значение строки, где что выборочные данные должны быть переписано в. Убедитесь, что все пиковые значения выравниваются.
    9. Скопируйте лист два раза и удалить либо медиальной колонки лепестков или CCB столбцы создание страницы только CCB или медиальных значений лепестков.
    10. Удалить данные после все ответы CCB закончились. Создать четыре строки помечены Всего Фотоны, длина ответа (длительность), максимальная амплитуда и реагирования Latency. Скопируйте и вставьте этот раз ниже оригинала.
    11. Используйте функцию СУММ для определения общих фотоны во ответ. Используйте функцию COUNT для определения длины ответа. Скопируйте и связать высокую стоимость ячейки для определения пикового значения амплитуды. Использование функции COUNT - выбрать из начала перфузии никотина до начала реакции - для определения реакции задержки.
    12. Копирование значения с помощью функции связывания и размножаться (все, кроме пиковой амплитуды) по скорости записи в секундах.
    13. Бар / коробка графики могут быть созданы для расчетных параметров, таких как фотоны, Всего пиковой амплитуды и длины реагирования, при желании (напр .: рис 5B, C, D).
    14. В столбце после сырого ответ фотонов данные, в среднем сырые баллы данных для каждого момента времени с использованием функции усреднения. При желании следовать с колонки, определяющего стандартную ошибку среднего (SEM), для каждого из усредненных значений фотонов в момент времени.
    15. Используйте среднюю колонку построить среднюю Profil ответе [График] для образца БКК группы. Для этого выберите столбец с указанием времени, как значения по оси Х и колонки средних значений фотонов как у оси и, наконец, выберите инструмент создания графа рассеивания.
    16. Повторите эту процедуру анализа с данными медиальных лепестков.
  3. Создание изображений для видео
    1. Открыть для просмотра фотонов.
    2. Выберите вкладку управления дисплеем. Нажмите на ROI, удерживая контроль, чтобы выбрать, удалить и / или минимизации его.
    3. Измените ширину ", ТРЦ" (время накопления), а требуется определить содержание каждого кадра.
    4. Изменить "сек шаг", чтобы определить перекрытие каждого кадра.
    5. Выберите "вид экспорта, играя" нажмите кнопку "<< REW", затем "PLAY>". Изображения для видео будет экспортироваться в папку "вид экспорта" в серии .png файлов.
  4. Использование Virtual Dub, чтобы видео: один метод для видео Создание подробная
    1. Создайте новую папку с именем "Обменяй свои PlayMoney" в папке, содержащей вид экспорта изображения.
    2. Принесите сценарий (renommer.VBS) в папке изображений.
    3. Двойной щелчок по renommer.VBS бежать.
    4. Изображения будут автоматически переименована численно и скопировать в папку "Обменяй свои PlayMoney".
    5. Открыть virtualdub.exe.
    6. Выберите открытый видео файл - выберите первое изображение (последующие изображения будут автоматически загружать).
    7. Выберите видео - выберите частоту кадров отрегулировать по желанию.
    8. Выберите видео - выберите сжатия выберите Cinepak Codec радиусом.
    9. В файле выберите Сохранить как AVI видео будет создана автоматически.

Результаты

Слияние GFP в акворина позволяет визуализировать нашу область интереса до биолюминесценции визуализации с помощью возбуждения GFP в люминесцентной режиме на микроскопе (3А, 4А, 6А, 6E). Один из самых простых способов, чтобы стимулировать грибовидные тела через активизацией ионотро...

Обсуждение

Недавно разработанный биолюминесцентного основе GFP-экворин Представленный здесь подход позволяет в естественных условиях функциональной записи Ca 2+-активности в различных нейронов, а также, при желании, в другой вид клеток, таких как почки звездчатых клеток, как сообщается ?...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
NaClSigma-AldrichS3014
CaCl2Merck1023911000
HEPESSigma-Aldrich7365-45-9
KClprolabo26 764.298normapur
MgCl2prolabo25 108.295normapur
sucroseSigma-AldrichS0389
NicotineSigma-AldrichN3876
ATPSigma-AldrichA2383Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazineProlume, nanolight Cat #301 Coelenterazine hhttp://www.prolume.com/
dental glue3M ESPE™46954Protemp IV
silicon glue3M ESPE™36958Express 2 Regular Body Quick
tape3M Scotch122s3M Scotch Magic Tape
pipette tipsCorning Incorporated4868100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage)hand made
incubation boxhand made
forceps (No. 5)Fine Science Tools11252-00Micro-dissecting forceps
curved forcepsSigma-AldrichF4142Micro-dissecting forceps
glue applicator hand made 
knifeFine Science Tools10316-145 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera AndorDU-897E-CS0-#BViXon (cooled to -80 °C)
MicroscopeNikonEclipse-E800
immersion objective lensNikon20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescenceLeica MZ Fl IIIleica dissection scope and florescent lamp
tight dark boxScience WaresCustom built by Science Wares
peristaltic pump GilsonMinipuls 2
tubingFisher Scientificdepends on thicknessTygon R3603, St-Gobain
perfusion systemWarner64-0135  (VC-66CS)Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulatorsLeventon201108Dosi-flow 3
measurement and automation explorerSciences Wares & National InstrumentsN/Asoftware http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager Science Wares & National InstrumentsN/Asoftware http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewerScience Wares & National InstumentsN/Asoftware http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
ExcelMicrosoftN/Asoftware https://www.microsoft.com
virtual dubopen access N/Asoftware http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2Martin et al., 2007, Ref. 1 N/ANo stocks {currently} publicly available 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP  B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. (STOCK #1117340)pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2Lima and Misenboeck, Ref. 11 N/ANo stocks {currently} publicly available 
OK107Bloomington stock center854http://flystocks.bio.indiana.edu/

Ссылки

  1. Martin, J. -. R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
  2. Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
  3. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
  4. Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
  5. Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
  6. Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
  7. Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
  8. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
  9. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -. R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
  10. Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
  11. Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
  12. Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
  13. Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
  14. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
  15. Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
  16. Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
  17. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1072 imagingGFP2 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены