מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

Summary

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Abstract

מנגנון translational, כלומר, polysome או polyribosome, הוא אחת הכונה ציטופלסמית הגדולות והמורכבות ביותר בתאים. Polysomes, שהוקם על ידי הריבוזומים, mRNAs, כמה חלבוני RNAs ללא קידוד, מייצג פלטפורמות משולבות שבו שולט translational להתקיים. עם זאת, בעוד הריבוזום נחקר באופן נרחב, ארגון polysomes עדיין חסר הבנה מקיפה. כך מאמץ רב נדרש כדי להבהיר ארגון polysome וכל מנגנון חדשני מלא translational שעשוי להיות מוטבע. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא סוג של מיקרוסקופיה בדיקת סריקה המאפשר רכישת תמונות 3D ברזולוציה של ננו. לעומת במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) טכניקות, אחד היתרונות העיקריים של AFM הוא שזה יכול לרכוש אלף תמונות הם אוויר בתמיסה, מה שמאפשר את המדגם כדי להישמר בתנאים פיסיולוגיים ליד ללא כל צורך מכתים ותיקון פרופרוצדורות. כאן, פרוטוקול מפורט לטיהור המדויקת של polysomes ממוח עכבר בתצהיר שלהם על מצעים יציצו מתואר. פרוטוקול זה מאפשר הדמית polysome באוויר ואת הנוזלים עם AFM והשחזור שלהם כמו אובייקטים תלת-ממדיים. משלימים במיקרוסקופ אלקטרונים cryo- (cryo-EM), השיטה המוצעת ניתן להשתמש בנוחות לניתוח polysomes ולומדים הארגון שלהם באופן שיטתי.

Introduction

הסינתזה של חלבון היא תהליך האנרגיה הרב ביותר בתאים ^1,2. לפיכך, אין זה מפתיע כי שכיחותם חלבון נשלטת בעיקר על translational ולא ^3,4,5 רמת התעתיק. Polysome הוא המרכיב macromolecular היסוד הממיר את המידע mRNA לתוך readouts חלבוניים פונקציונלי. Polysomes ובכך מוכרים ככל מתחמי macromolecular שבו מספר פקדים translational להתכנס ^6-13. למרות מאה מחקרים על מבנה הריבוזום ^{14- 16,} תובנה המולקולריות המפורטות לתוך הדינמיקה של תרגום ואת הטופולוגיה של polysomes נתקלו עניין מוגבל. כתוצאה מכך, הארגון של מתחם polysomal ribonucleoprotein יליד ההשפעה הפוטנציאלית שלה על תרגום עדיין די בעיות מעורפלות. Polysomes עשוי להסתיר עדיין ארגונים ידועים הורה ופונקציונלי, פוטנציאל שיקוף נוקלאוזום מה לניהול עבודות אפיגנטייםls ייצג לתחום שעתוק. ואכן, החקירה של שערת מסקרן זה דורשת מחקרים נוספים וגישות טכניות חדשות. בקו הזה, טכניקות מבניות במיקרוסקופ כוח אטומי יכולים לשתף פעולה פורה לפענח מנגנונים חדשים לבקרת ביטוי גנים, בדומה למה הושג עבור הנוקלאוזום ^17,18.

מאז גילויו של הריבוזום ^14-16, מבנו התאפיין בהרחבת פרוקריוטים ^19,20, שמרים ²¹ ולאחרונה ב ^-22 אנושיים, מתן התיאור המולקולרי של המנגנונים בבסיס סינתזת חלבון. Polysomes בתחילה הוכרו על הממברנה של reticulum endoplasmic, ויצר ארגונים גיאומטריים 2D טיפוסיים ^14. כפי שהוזכר קודם לכן, הרכבת polysome לא מושא ריבית קבועה כמו המבנה הריבוזום. בעבר, polysomes נחקר בעיקרו על ידי transmission EM מבוסס טכניקות. רק לאחרונה, טכניקות קריו-EM איפשר שחזור 3D של polysomes מטוהרים ממערכות תרגום במבחנה ^23-26, lysates הסלולר אדם ²⁷ או בתאים ^28. טכניקות אלו המוצעים מידע מעודן יותר על הארגון הריבוזום-הריבוזום ב polysomes ^{23, 26-28} ותיאור מולקולרי ראשוני של משטחי מגע של ריבוזומים סמוכים polysomes נבט חיטה ^24. לפיכך, טומוגרפיה קריו-EM מאפשרת הגילוי של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום עם מולקולרי, אבל הוא נטל על ידי ושחזור שלאחר עיבוד נרחב מנתח הדורשים משאבי חישוביים כבדים לצורך הטיפול במידע. יתר על כן, כדי לקבל את הפרטים המולקולריים של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום, מפה נפתרה ביותר של הריבוזום נדרשה, וגם זה סוג של הריבוזום עזר זמין רק לכמה מינים. חשוב לציין, טומוגרפיה קריו-EM היא לא מסוגלת לזהות RNA בחינם. Therefבצר, טכניקות חדשות נדרשים להבין את הארגון באופן מלא של מכונות תרגום.

לצד קריו-EM, AFM הועסק גם ככלי שימושי עבור הדמיה ישירה של polysomes אאוקריוטים התחתון ^29-33 ובני אדם ^27. לעומת EM, AFM לא דורש קיבוע מדגם או תיוג. בנוסף, מדידות יכולות להתבצע בתנאים פיסיולוגיים ליד ועם האפשרות הייחודית של זיהוי הוא ריבוזומים בבהירות גדילי RNA עירום ^27. הדמיה של polysomes היחיד יכולה להתבצע במהירות יחסית, קבלת אלף תמונות בבת ברזולוצית ננו עם מאמץ שלאחר עיבוד מעט לעומת העיבוד שלאחר נרחב וכבד ושחזור ניתוחי נדרש על ידי מיקרוסקופ קריו-EM. כתוצאה מכך, AFM טיפול נתונים וניתוח לא צריך תחנות עבודה יקרות וכוח מחשוב גבוה. ככזה, טכניקה זו אוספת מידע על צורות polysomal, מאפיינים מורפולוגיים (כגוןגובה, אורך ורוחב), צפיפויות הריבוזום, בנוכחות RNA חינם ומספר ריבוזומים לכל polysome ²⁷ עם תפוקה גבוהה יותר מאשר-EM קריו. באופן כזה, AFM מייצג גישה חזק משלים טכניקות EM להציג polysomes ^27.

כאן אנו מציגים צינור מלא מפני טיהור כדי ניתוח נתונים שבו AFM מוחל תמונה ולנתח polysomes במוח עכבר. הפרוטוקול המוצע מתמקד בנושאי טיהור ועל בתצהיר המדויק של polysomes על מצעים יציצו המשמשים הדמית AFM. בנוסף ניתוח חלקיקים קונבנציונלי שניתן לבצע בקלות עם תוכנה נפוצה בשימוש על ידי קהילת AFM, תוסף ³⁴ ImageJ, שנקרא RiboPick, מוצג עבור לספור את מספר ריבוזומים לכל polysome ^{27, 35.}

Protocol

הפרקטיקות על מנת לקבל את רקמות העכבר אושרו על ידי גוף להגנת בעלי חיים (OPBA) של אוניברסיטת טרנטו (איטליה), פרוטוקול לא. 04-2015, לפי art.31 צו המחוקק לא. 26/2014. כל העכברים היו מתוחזקים במתקן אורגניזם מודל של המרכז לביולוגיה אינטגרטיבית (CIBIO), אוניברסיטת טרנטו, איטליה.

זהירות: כדי למנוע את השפלה RNA של דגימות, להכין את כל מאגרי שימוש במים שטופלו DEPC למזעור זיהום RNase.

1. הכנת Polysomes ממוחו כל הפריטים

1. איסוף רקמות מוח (15 דקות)
   1. להרדים C57BL זן עכבר wild-type / 6 עם מחנק ₂ CO 5 דקות ^36. בזהירות לנתח את המוח החוצה מהגולגולת ^36, למקם את הרקמה לתוך צינור 1.5 מ"ל ו למקם אותו בחנקן נוזלי. חנות ב -80 ° C עד השימוש.
2. הכנת lysate (30 דקות)
   1. לכתוש את רקמת המוח כולו באמצעותובמכתש תחת חנקן נוזלי.
   2. העבר כ -25 מ"ג אבקה לצינור microcentrifuge קר ומייד (כדי למנוע את הפשרת הרקמה המרסקת) להוסיף 0.8 מיליליטר של הצפת תמוגה (ראה טבלה 1) ולשבש את התא על ידי pipetting למעלה ולמטה 25 פעמים מהר.
   3. צנטריפוגה הצינור ב XG 12,000 במשך 1 דקות ב 4 ° C עד גלולה פסולת הסלולר.
   4. מעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש ולשמור את הצינור על קרח במשך 15 דקות.
   5. צנטריפוגה הצינור ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת גרעינים ואת המיטוכונדריה.
   6. מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge חדש.
   7. אחסן את supernatant ב -80 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של 6 חודשים או להשתמש בו באופן מיידי.
3. הכנת שיפוע סוכרוז צנטריפוגה (2 שעה ו -30 דקות)
   1. ultracentrifuge לשטוף צינורות בהרחבה עם מי RNase ללא (מי מטופלי diethylpyrocarbonate (מי DEPC) או מסחריים)ד 3% H ₂ O ₂ / DEPC H ₂ O פתרון.
   2. מכניסים את הצינורות על הקרח ולהוסיף 5.5 מ"ל של תמיסת סוכרוז קר 50% בחלק התחתון של צינור אחד (ראה לוח 1 עבור פתרונות סוכרוז). בזהירות להוסיף את ירידת תמיסת סוכרוז 15% אחר טיפה, נשאר קרוב שלבי ביניים כדי לשמור על שלבי חדה, עד הצינור הוא מלא לחלוטין. כאשר הצינור הוא מלא לחלוטין, לסגור אותו עם פקק גומי, כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
   3. בחדר קר בעדינות להניח את הצינורות אופקיים ולשמור אותו בתנוחה זו למשך 2 שעות. לאחר פרק זמן זה, לאט ליישר את הצינורות בחזרה למצב אנכי ולשים אותם על הקרח. ההדרגתיים מוכנים כעת לשמש. לחלופין, להכין את שיפוע סוכרוז 15-50% באמצעות שיפוע קונבנציונאלי לשעבר.
   4. בחדר קר להסיר בזהירות 1.0 מ"ל מהחלק העליון של השיפוע ואת כיסוי הירידה סוכרוז אחר טיפה עם lysate cytosolic (כלומר, supernatant שהושגו STEp 1.2).
   5. הורד בזהירות את הצינורות לתוך הדליים של הרוטור דלי מתנדנד. צנטריפוגה ההדרגתי עבור 100 דקות ב 180,000 XG ב 4 ° C באמצעות ultracentrifuge.
   6. לאחר צנטריפוגה, לעזוב את הצינורות בדליים שלהם במשך 20 דקות ב 4 ° C לתת לייצב ההדרגתי.
4. חלוקת שיפוע סוכרוז (2 שעות)
   1. מוציאים בזהירות צינור ultracentrifuge אחד מן הרוטור ultracentrifuge ולעגן אותה במכשיר אספן של צפיפות מערכת חלוקה Gradient. אסוף 1 מיליליטר שברים ניטור את הספיגה ב 260 ננומטר עם גלאי UV / VIS (ראה איור 1 פנל עליון). שמור על השברים שנאספו על קרח.
   2. הכן aliquots של 30-40 μl של שברים של עניין, ולשמור אותם על הקרח לפני אחסונם ב -80 ° C עד השימוש. אין להשתמש aliquots או שברי סוכרוז כי עבר יותר משני מחזורי הקפאה-פשרה (ראה איור 1 פנל תחתון).

2. הכנת המדגם עבור מיקרוסקופית כוח אטומי (3 שעות)

1. באמצעות קלטת, לקלף את הגיליונות יציצו.
2. שטוף את הגיליונות יציצו 3-4 פעמים עם מי DEPC ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי קטנה. לאחר מכן לייבש את פני השטח באמצעות אוויר.
3. מכסים את מיקה עם 200 μl של 1 מ"מ Niso ₄ דגירה במשך 3 דקות ב RT.
4. הסר את הפתרון ניקל ולאחר מכן לייבש את פני השטח באמצעות אוויר. לבצע את המהלכים הבאים ב 4 ° C על ידי נחת צלחת פטרי עם תציץ על קרח.
5. להפשיר aliquot שהושגו 1.4.2 על קרח בעדינות להוסיף את כל טיפה מדגם אחר טיפה על מיקה. בעזרת קצה 100-200 μl, להפיץ את המדגם על פני השטח של מיקה. דגירה המדגם על קרח למשך 3 דקות.
6. מכסה את הירידה יציץ גיליון אחר טיפה עם 200 μl קר הצפה-AFM (ראה טבלה 1) ו דגירה במשך שעה 1 על קרח.
7. הדמיה בנוזל
   1. הסירו בזהירות את ההצפה-AFM ו לכבס את הסדינים יציצו 3-4 זמןים עם 200 μl קר הצפה-AFM להסיר סוכרוז עודף. לאחר מכן לשטוף את הסדינים נציץ 3 פעמים עם פתרון כביסה קר (ראה טבלה מס '1), בהשאירו את פני השטח נציץ סוקר בכמה מיקרוליטר של פתרון.
   2. לך להצביע 3 (תמונת רכישה).
8. הדמיה באוויר
   1. מוציאים בזהירות את מאגר-AFM ולשטוף את מיקה 3-4 פעמים עם 200 μl קר הצפת-AFM להסיר את סוכרוז עודף. לאחר מכן, לשטוף את מיקה 3 פעמים עם פתרון כביסה קר (ראה טבלה 1) ומסננים את המים העודפים באמצעות נייר.
   2. השאירו המדגם להתייבש מתחת למכסה המנוע כימי עם החלק העליון של צלחת פטרי פתוחה חלקית. לאחר 2 שעות, לסגור את צלחת פטרי ולאחסן ב RT. מדוד את המדגם לאחר 2-3 שעות כפי שהם יציבים במשך שנים.

3. Image Acquisition (15 דקות לכל תמונה לאחר ייצוב תרמי)

הערה: Polysomes משותקת על תציץ ניתן הדמיה באוויר או בנוזל, באמצעות מצב AC.

1. צרף את מיקה לבעל המדגם באמצעות קלטת דו צדדית.
2. הכנס את בעל מדגם בשלב AFM הבא להוראות היצרן. כאשר הדמיה בנוזל, במידת האפשר, מנסה לשמור על מדגם בטמפרטורה נמוכה מ -25 מעלות צלזיוס כדי להגביר את היציבות polysome בזמן.
3. בחר שלוחה מתאימה הדמית AC ולעגן אותה על בעל הקצה הבא להוראות היצרן. הנה, cantilevers לשימוש עם כוח קבוע בין 2-20 N / m הדמיה אוויר סביב 0.1 N / m הדמיה נוזלי.
4. התאם את מקום הליזר על השלוחה ואת אפס אותות הגלאים ברבע.
5. בחר תדירות נהיגה מתאימה ולנסוע השלוחה עם משרעת של 10-20 ננומטר.
6. מתקרב המדגם עד הקצה עוסקת פני השטח.
7. בחר אזור הסריקה של מיקרומטר 2x2, לרכוש לפחות תמונות פיקסל 512x512 (רוחב פיקסל <4 ננומטר), בחר מצב חיסור רקע חיה בסולם Z של 20-25 ננומטר.
8. בדוק tהוא דמות מחפש בנוכחות חפצה עגולים מאופיינים גובה בין 10 ו -15 ננומטר בעת הרכישה באוויר ו -25 ו -30 ננומטר כאשר בנוזל ואת הרוחב ננו בטווח 25-30. כוונו את הפרמטרים setpoint ומשוב עד חפצים חדים הם דמיינו. הרקע אמור להופיע שטוח יחסית בדגימות טובות, עם כמה חפצים בגובה 2-4 ננומטר (ראה איור 2 א 'וב').
9. אם התמונה נראית טובה (כמצוין בשלב 3.8), לרכוש כמה סריקות מיקרון 2x2 (לפחות עשר) בשעת אזורי מדגם שונים.
10. (אופציונאלי). במידת הצורך, לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של polysomes שנבחר (ראה איור 2 ג).
11. החל תיקוני תוכנה (חיסור מטוס ואלגוריתמי תיקון שורה אחר שורה) כדי לתקן את תמונות AFM הסרת הטיה שרירותית ונסחפו אפקטים.

4. ניתוח נתונים (30 דקות לכל תמונה)

1. ייצוא תמונות ב ImageJ (אופציונלי: להחיל גורם קנה מידה) preferentially באמצעות פורמט דחיסה ללא אובדן נתונים, למשל, בפורמט TIFF (ראה איור 3 א).
2. השתמש RiboPick.ijm הכלים מאקרו ImageJ (להעתקה בתיקיית הכלים מאקרו / ImageJ) לספור הריבוזומים polysomes (ראה איור 3B) ולחשב הסטטיסטיים של המדגם (ראה איור 3 ג).
   1. התחל טעינת תמונה באמצעות <תמונה קרא> כלי מאתחל את התוכנית.
   2. פיק המרכזים הריבוזום עם ImageJ <פוינט בחירה> כלי סטנדרטי (shift + שמאל לחץ מאפשר הריבוזומים רב מבחר). סמן את הריבוזומים הנבחרים עם הכלי <מארק ריבוזומים>. קואורדינטות ריבוזום תופענה חלון טקסט מותאם אישית.
   3. הוסף עוד ריבוזומים לאותו polysome לחזור על ההליך שצוין בנקודת 4.2.2.
   4. סור בטעות ריבוזומים מסומנים באמצעות <בטל האיסוף האחרון> הכלי (מתחיל הסרה מן הריבוזום הוסיף האחרון לראשון212; ב polysome הנוכחי בלבד).
   5. כאשר polysome הושלמה, השתמש <חדש polysome> כלי. ככל שמספר polysome מתווסף כשכבה אל התמונה בחלון הטקסט מתעדכן.
   6. השתמש <שמירת תוצאות וקרובות> לכתוב את הריבוזום לקובץ קואורדינטות (יחידות ברירת המחדל של התמונה משמשות) ואת תמונת PNG המסכם הריבוזומים שקוטף polysomes. התמונה המקורית סגורה ללא להינצל.

תוצאות

פרופיל polysomal שיפוע סוכרוז של מוח עכבר השלם

אפשר לטהר polysomes מתוך lysate הסלולר על ידי יצירת פרופיל polysomal, המפריד מקרומולקולות בהתאם למשקל וגודלם. עם פרופיל polysomal, lysates ציטופלסמית המתקבל תאי?...

Discussion

כמו מבנה ה- DNA הוכח להיות בעל חשיבות עליונה כדי לתאר את התהליך של שעתוק כארגון של הכרומטין קידם את ההבנה שלנו של שליטה תעתיק של ביטוי גנים, חשוב לנתח את הארגון והמבנה של polysomes לשפר הבנה אמת תרגום והרגולציה שלה.

עם הפרוטוקול המתואר, צ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cycloheximide	Sigma	01810	Prepararation of lysate
DNAseI	Thermo Scientific	89836	Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor	Life technologies	EO-0381	Prepararation of lysate
DEPC	Sigma	40718	Prepararation of lysate
Triton X100	Sigma	T8532	Prepararation of lysate
DTT	Sigma	43815	Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate	Sigma	D6750	Prepararation of lysate
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Prepararation of lysate
Sucrose	Sigma	S5016	Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima LE-80K	Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor	Beckman Coulter	SW 41 Ti	Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube	Beckman Coulter	331372	Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System	Teledyne Isco	67-9000-176	Sucrose gradient fractionation
AFM	Asylum Research	Cypher	Polysome visualization