Peering au cerveau polysomes avec Atomic Force Microscopy

Résumé

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Résumé

Le mécanisme de translation, à savoir le polysomes ou polyribosome, est l' un des plus grands et les plus complexes machineries cytoplasmiques dans les cellules. Polysomes, formés par les ribosomes, les ARNm, plusieurs protéines et les ARN non-codants, représentent les plates-formes où les contrôles ont lieu traductionnelles intégrés. Cependant, alors que le ribosome a été largement étudiée, l'organisation de polysomes fait encore défaut compréhension globale. beaucoup d'efforts sont donc nécessaires afin d'élucider l'organisation polysomes et tout nouveau mécanisme de contrôle de la traduction qui peut être intégré. La microscopie à force atomique (AFM) est un type de sonde à balayage microscopie qui permet l'acquisition d'images 3D à résolution nanométrique. Par rapport à la microscopie électronique (EM) techniques, l'un des principaux avantages de l'AFM est qu'il peut acquérir des milliers d'images à la fois dans l'air et en solution, ce qui permet de l'échantillon à être maintenu dans des conditions proches physiologiques sans qu'il soit nécessaire pour la coloration et la fixation procédures. Ici, un protocole détaillé pour la purification précise de polysomes de cerveau de souris et leur dépôt sur des substrats de mica est décrite. Ce protocole permet l'imagerie polysomes dans l'air et aux liquides avec l'AFM et leur reconstitution sous forme d'objets en trois dimensions. En complément de cryo-microscopie électronique (cryo-EM), la méthode proposée peut être commodément utilisé pour analyser systématiquement polysomes et l'étude de leur organisation.

Introduction

La synthèse des protéines est le processus consommant de l' énergie plus dans les cellules ^1,2. Par conséquent, il est pas surprenant que les abondances de protéines sont principalement contrôlées à la translation plutôt que la transcription ^3,4,5 niveau. Le polysomes est le composant macromoléculaire fondamental qui convertit les informations ARNm en lectures protéiniques fonctionnels. Polysomes sont jusqu'ici considérées comme des complexes macromoléculaires , où plusieurs commandes de translation convergeant ^13/06. Malgré des centaines d'études sur la structure du ribosome ^{14- 16,} les connaissances moléculaires détaillées sur la dynamique de la traduction et la topologie de polysomes a rencontré un intérêt limité. En conséquence, l'organisation du complexe polysomal ribonucléoprotéinique natif et son effet potentiel sur la traduction sont encore des questions plutôt obscures. Polysomes peuvent se cacher encore des organisations ordonnées et fonctionnelles inconnues, potentiellement en miroir ce que nucléosomes et contro épigénétiquels ont représenté pour le champ de transcription. En effet, l'enquête de cette hypothèse intrigante nécessite des études supplémentaires et de nouvelles approches techniques. Dans cette ligne, les techniques structurelles et microscopie à force atomique peuvent fructueusement collaborer pour percer de nouveaux mécanismes pour contrôler l' expression des gènes, de façon similaire à ce qui a été réalisé pour le nucléosome ^17,18.

Depuis la découverte du ribosome ^14-16, sa structure a été caractérisée en détail dans les procaryotes, les levures ^{19,20 21} et , plus récemment , chez l' homme ^22, fournissant la description des mécanismes moléculaires à la base de la synthèse protéique. Polysomes ont été comptabilisés initialement sur ​​la membrane du réticulum endoplasmique, formant des organisations géométriques 2D typiques ^14. Comme mentionné précédemment, polysomes ensemble n'a pas fait l'objet d'un intérêt constant que la structure du ribosome. Dans le passé, les polysomes ont été étudiés essentiellement en transmission EM-fondé des techniques. Seulement récemment, des techniques de cryo-EM ont permis à la reconstruction 3D de polysomes purifiés à partir de systèmes de traduction in vitro ^23-26, des lysats cellulaires humaines ²⁷ ou ²⁸ dans les cellules. Ces techniques offrent des informations plus fine sur l'organisation ribosome ribosomes dans les polysomes ^{23, 26-28} et la description moléculaire préalable des surfaces adjacentes de ribosomes dans les polysomes de germe de blé ²⁴ de contact. Ainsi, cryo-EM tomographie permet la divulgation des interactions ribosomes ribosome avec détail moléculaire, mais il est grevé par une vaste post-traitement et analyse la reconstruction qui nécessitent des ressources informatiques lourds pour le traitement des données. De plus, pour obtenir le détail moléculaire des interactions ribosome-ribosome, une carte à haute résolution du ribosome est nécessaire, et ce genre de ribosome de référence est disponible seulement pour quelques espèces. Surtout, cryo-EM tomographie ne parvient pas à détecter l'ARN libre. Therefminerai, de nouvelles techniques sont nécessaires pour comprendre l'organisation de la machinerie de traduction.

A côté de cryo-EM, l' AFM a également été utilisé comme un outil utile pour l' imagerie directe de polysomes dans les eucaryotes inférieurs ^29-33 et les humains ^27. Par rapport à EM, l'AFM ne nécessite aucun échantillon de fixation ou de l'étiquetage. En outre, les mesures peuvent être effectuées dans des conditions physiologiques proches et avec la possibilité unique d'identifier clairement les ribosomes et les brins d'ARN nus ^27. L'imagerie de polysomes simples peut être effectuée relativement rapidement, en obtenant des milliers d'images à nano-résolution avec peu d'effort post-traitement par rapport au post-traitement vaste et lourd et de reconstruction analyses requises par microscopie cryo-EM. Par conséquent, l'AFM de la manipulation et l'analyse des données n'a pas besoin de postes de travail coûteux et grande puissance de calcul. En tant que telle, cette technique recueille des informations sur la forme des polysomal, les caractéristiques morphologiques (par exemple,hauteur, longueur et largeur), les densités ribosome, la présence d'ARN libre et le nombre de ribosomes par polysomes ²⁷ avec un débit plus élevé que cryo-EM. De telle manière, AFM représente une approche puissante et complémentaire aux techniques EM pour représenter polysomes ^27.

Nous présentons ici un pipeline complet de la purification à l'analyse de données où AFM est appliqué à l'image et l'analyse polysomes du cerveau de souris. Le protocole proposé se concentre sur les problèmes de purification et le dépôt précis de polysomes sur des substrats de mica qui sont utilisés pour l'imagerie AFM. En plus de l' analyse des particules classiques qui peuvent être facilement réalisée avec un logiciel commun utilisé par la communauté de l' AFM, un plugin ImageJ ^34, appelé RiboPick, est présenté pour compter le nombre de ribosomes par polysomes ^{27, 35.}

Protocole

Les pratiques utilisées pour obtenir les tissus de la souris ont été approuvées par l'Organe pour la protection des animaux (LRRO) de l'Université de Trento (Italie), pas de protocole. 04-2015, décret selon art.31 législatif n. 26/2014. Toutes les souris ont été maintenues à l'installation Modèle Organism du Centre de biologie intégrative (CIBIO), Université de Trento, en Italie.

Attention: Pour éviter toute dégradation de l'ARN des échantillons, préparer tous les tampons à l'aide de l'eau traitée par DEPC pour minimiser la contamination RNase.

1. Préparation de polysomes de Brains entiers

1. La collecte de tissus cérébraux (15 min)
   1. Euthanasier type sauvage souche de souris C57BL / 6 avec CO ₂ asphyxie pendant 5 min ^36. Disséquer soigneusement le cerveau hors du crâne ^36, placer le tissu dans un tube de 1,5 ml et placer immédiatement dans de l' azote liquide. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
2. Préparation de lysat (30 minutes)
   1. Pulvériser l'ensemble du tissu cérébral en utilisantun mortier et un pilon sous azote liquide.
   2. Transfert environ 25 mg de poudre dans un tube à centrifuger froid et immédiatement (pour éviter la décongélation du tissu pulvérisé) ajouter 0,8 ml de tampon de lyse (voir le tableau 1) et de perturber la cellule par pipetage de haut en bas 25 fois rapidement.
   3. Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 1 min à 4 ° C pour sédimenter les débris cellulaires.
   4. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et maintenir le tube sur la glace pendant 15 min.
   5. Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour sédimenter les noyaux et les mitochondries.
   6. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
   7. Stocker le surnageant à -80 ° C pour un maximum de 6 mois ou l'utiliser immédiatement.
3. préparation du gradient de sucrose et de centrifugation (2 h et 30 min)
   1. ultracentrifugation tubes Laver abondamment de l'eau sans RNase (eau traitée de diéthyle (DEPC-eau) ou commerciale) und 3% de H ₂ O ₂ / H ₂ O DEPC solution.
   2. Placer les tubes dans la glace et ajoute 5,5 ml d' une solution froide de saccharose à 50% au fond de chaque tube (voir le tableau 1 pour les solutions de saccharose). ajouter délicatement le sucrose goutte de solution à 15% en baisse, en restant proche de l'interphase afin de préserver une interphase forte, jusqu'à ce que le tube est complètement rempli. Lorsque le tube est complètement rempli, fermer avec un bouchon en caoutchouc pour éviter la formation de bulles d'air.
   3. Dans une chambre froide doucement fixer les tubes horizontalement et le maintenir dans cette position pendant 2 heures. Après ce temps, redresser lentement les tubes dans la position verticale et les mettre sur la glace. Les gradients sont maintenant prêts à être utilisés. Alternativement, préparer le gradient de saccharose 15-50% en utilisant un gradient classique ancien.
   4. Dans une chambre froide retirer soigneusement 1,0 ml à partir du haut de la pente et de superposer la chute du saccharose à goutte avec le lysat cytosolique (ie, le surnageant obtenu à step 1.2).
   5. Abaisser avec précaution les tubes dans les seaux de balancement seau rotor. Centrifuger les gradients pour 100 min à 180.000 xg à 4 ° C en utilisant une ultracentrifugeuse.
   6. Après la centrifugation, laisser les tubes dans leurs seaux pendant 20 min à 4 ° C pour laisser les gradients se stabilisent.
4. gradient de sucrose de fractionnement (2 h)
   1. Retirez délicatement un tube d'ultracentrifugation du rotor d'ultracentrifugation et le monter sur le dispositif de collecteur d'un gradient de densité Système Fractionnement. Prélever 1 ml fractions de surveillance de l'absorbance à 260 nm avec un détecteur UV VIS / (Voir Figure 1 panneau supérieur). Gardez les fractions recueillies sur la glace.
   2. Préparer des aliquotes de 30-40 ul des fractions d'intérêt, gardez-les sur de la glace avant de les stocker à -80 ° C jusqu'à utilisation. Ne pas utiliser des aliquotes ou des fractions de saccharose qui ont subi plus de deux cycles de congélation-décongélation (voir Figure 1 panneau inférieur).

2. Préparation d'échantillons pour microscopie à force atomique (3 h)

1. Avec du ruban, retirez les feuilles de mica.
2. Laver les feuilles de mica 3-4 fois avec DEPC-eau et le placer dans une petite boîte de Pétri. Puis sécher la surface avec de l'air.
3. Couvrir le mica avec 200 ul de 1 mM de NiSO ₄ et incuber pendant 3 minutes à température ambiante.
4. Retirer la solution de nickel et ensuite sécher la surface avec de l'air. Effectuer toutes les étapes futures à 4 ° C en plaçant la boîte de Pétri avec le mica sur la glace.
5. Décongeler une aliquote obtenue dans de la glace et 1.4.2 ajouter doucement l'ensemble de la goutte d'échantillon à goutte sur le mica. En utilisant une pointe de pi 100-200, étaler l'échantillon sur toute la surface du mica. Incuber l'échantillon sur la glace pendant 3 min.
6. Couvrir la chute de la feuille de mica à goutte avec 200 pi de tampon froid-AFM (voir le tableau 1) et incuber pendant 1 heure sur la glace.
7. Imagerie en liquide
   1. Retirez soigneusement le tampon-AFM et laver les feuilles de mica 3-4 foiss avec 200 pi de tampon froid-AFM pour éliminer l'excès de saccharose. Ensuite , laver les feuilles de mica 3 fois avec la solution de lavage à froid (voir le tableau 1), en laissant la surface de mica recouvert par quelques microlitres de solution.
   2. Aller au point 3 (acquisition d'images).
8. Imagerie dans l'air
   1. Retirez délicatement le tampon-AFM et laver le mica 3-4 fois avec 200 pi de tampon froid-AFM pour éliminer l'excès de saccharose. Ensuite, laver le mica 3 fois avec la solution de lavage à froid (voir tableau 1) et drainer l'excès d' eau en utilisant du papier.
   2. Laisser l'échantillon à sécher sous la hotte chimique avec la partie supérieure de la boîte de Petri partiellement ouverte. Après 2 heures, fermez la boîte de Pétri et conserver à la température ambiante. Mesurer l'échantillon après 2-3 heures comme ils sont stables pendant des années.

3. Acquisition d'image (15 min par image après stabilisation thermique)

Note: polysomes immobilisés sur le mica peuvent être visualisés dans l'air ou dans un liquide, en utilisant le mode AC.

1. Fixer le mica sur le porte-échantillon à l'aide de ruban adhésif double face.
2. Insérez le porte-échantillon dans la phase de l'AFM en suivant les instructions du fabricant. Lorsque l'imagerie dans le liquide, si possible, essayer de maintenir l'échantillon à une température inférieure à 25 ° C pour augmenter polysomes stabilité dans le temps.
3. Sélectionnez un cantilever approprié pour l'imagerie AC et le monter sur le support de pointe en suivant les instructions du fabricant. Ici, l'utilisation cantilevers avec force constante entre 2-20 N / m pour l'imagerie de l'air et environ 0,1 N / m pour l'imagerie liquide.
4. Régler la tache laser sur le cantilever et zéro les signaux de détection de quadrant.
5. Sélectionnez une fréquence de conduite opportune et conduire le cantilever avec une amplitude de 10 à 20 nm.
6. Approchez l'échantillon jusqu'à ce que la pointe engage la surface.
7. Sélectionnez une zone de balayage de 2x2 um, acquérir au moins 512x512 images de pixels (largeur de pixel <4 nm), sélectionner un mode de soustraction de fond en direct et une échelle Z de 20-25 nm.
8. Inspecter til l'image à la recherche de la présence d'objets ronds, caractérisé par la hauteur comprise entre 10 et 15 nm lors de l'acquisition dans l'air et 25 et 30 nm lorsqu'elle est sous forme liquide et la largeur dans la plage de 25 à 30 nm. Réglez les paramètres de consigne et de retour jusqu'à ce que les objets tranchants sont visualisés. Le fond doit apparaître relativement plat dans les bons échantillons, avec quelques objets de hauteur 2-4 nm (voir figure 2A et B).
9. Si l'image semble bon (comme indiqué au point 3.8), acquérir plusieurs (au moins dix) scans 2x2 microns à des zones d'échantillonnage différentes.
10. (optionnel). Si nécessaire, acquérir des images à haute résolution de polysomes sélectionnés (voir figure 2C).
11. Appliquer des corrections de logiciels (plan de soustraction et des algorithmes ligne par ligne) correction pour corriger les images AFM suppression d'inclinaison arbitraire et les effets à la dérive.

4. Analyse des données (30 min par image)

1. Exporter des images dans ImageJ (en option: appliquer un facteur d'échelle) preferentially en utilisant un format de compression sans perte, par exemple, le format TIFF (voir la figure 3A).
2. Utilisez la macro RiboPick.ijm d'outils ImageJ (à copier dans le sous - répertoire macro / outils ImageJ) pour compter ribosomes en polysomes (voir la figure 3B) et calculer les propriétés statistiques de l'échantillon (voir la figure 3C).
   1. Lancer le chargement d'une image en utilisant le outil qui initialise le programme.
   2. Choisissez les centres de ribosomes avec le ImageJ norme outil (shift + clic gauche permet la multi-sélection de ribosomes). Marquez les ribosomes sélectionnés avec le outil. coordonnées ribosome apparaîtront dans une fenêtre de texte personnalisé.
   3. Ajouter plus ribosomes à la même polysomes répéter la procédure indiquée au point 4.2.2.
   4. Retirer ribosomes tort marqués à l'aide de la touche outil (commence la suppression de la dernière ribosome ajoutée à la première212; dans le courant polysomes seulement).
   5. Lorsque le polysomes est terminé, utilisez le outil. Comme le nombre de polysomes est ajouté sous forme d'une superposition sur l'image, la fenêtre de texte mis à jour.
   6. Utilisez le pour écrire le ribosome fichier de coordonnées (les unités de l'image par défaut sont utilisés) et une image PNG qui résume ribosomes et polysomes l'élite. L'image originale est fermé sans être enregistré.

Résultats

Gradient de saccharose polysomal profilage de l' ensemble du cerveau de la souris

Il est possible de purifier polysomes à partir d'un lysat cellulaire par profilage polysomal, qui sépare les macromolécules en fonction de leur poids et leur taille. Profilage polysomal, des lysats cytoplasmiques obtenus à partir de cellules ou de tis...

Discussion

Comme la structure de l'ADN a été prouvé être d'une importance capitale pour décrire le processus de transcription et que l'organisation de la chromatine a avancé notre compréhension du contrôle transcriptionnel de l'expression génique, il est essentiel d'analyser l'organisation et la structure des polysomes pour améliorer la compréhension véridique de la traduction et de son règlement.

Avec le protocole décrit, une densité optimale de polysomes douceme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cycloheximide	Sigma	01810	Prepararation of lysate
DNAseI	Thermo Scientific	89836	Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor	Life technologies	EO-0381	Prepararation of lysate
DEPC	Sigma	40718	Prepararation of lysate
Triton X100	Sigma	T8532	Prepararation of lysate
DTT	Sigma	43815	Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate	Sigma	D6750	Prepararation of lysate
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Prepararation of lysate
Sucrose	Sigma	S5016	Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima LE-80K	Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor	Beckman Coulter	SW 41 Ti	Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube	Beckman Coulter	331372	Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System	Teledyne Isco	67-9000-176	Sucrose gradient fractionation
AFM	Asylum Research	Cypher	Polysome visualization