Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

Riepilogo

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Abstract

Il meccanismo di traslazione, cioè il polysome o polyribosome, è uno dei più grandi e complessi macchinari citoplasmatici nelle cellule. Polisomi, formate dai ribosomi, mRNA, diverse proteine ​​e RNA non codificanti, rappresentano le piattaforme in cui i controlli di traslazione avvengono integrati. Tuttavia, mentre il ribosoma è stato ampiamente studiato, l'organizzazione di polisomi è ancora carente comprensione globale. Così molto sforzo è necessaria per chiarire organizzazione polysome e ogni nuovo meccanismo di controllo traduzionale che potrebbe essere incorporato. microscopia a forza atomica (AFM) è un tipo di scansione di sonda microscopio che permette l'acquisizione di immagini 3D con risoluzione nanometrica. Rispetto alle tecniche di microscopia elettronica (EM), uno dei principali vantaggi di AFM è che può acquisire migliaia di immagini sia in aria ed in soluzione, consentendo il campione da mantenere in condizioni fisiologiche vicino senza alcuna necessità di colorazione e fissaggio proprocedure. Qui, un protocollo dettagliato per la purificazione accurata polisomi da cervello di topo e la loro deposizione su substrati di mica è descritto. Questo protocollo permette l'imaging polysome in aria e liquidi con AFM e loro ricostruzione come oggetti tridimensionali. Complementare alla microscopia crioelettronica (crio-EM), il metodo proposto può essere comodamente utilizzato per analizzare sistematicamente polisomi e studiare la loro organizzazione.

Introduzione

La sintesi delle proteine ​​è la più processo consumo di energia nelle cellule ^1,2. Quindi, non è sorprendente che abbondanza di proteine ​​sono controllate principalmente al traslazionale piuttosto che ^3,4,5 livello trascrizionale. Il polysome è il componente macromolecolare fondamentale che converte le informazioni mRNA in letture proteici funzionali. Polisomi sono finora riconosciuti come complessi macromolecolari dove diversi controlli traslazionali convergono ^6-13. Nonostante centinaia di studi sulla struttura dei ribosomi ^{14- 16,} le intuizioni molecolari dettagliata delle dinamiche della traduzione e della topologia di polisomi è verificato un interesse limitato. Di conseguenza, l'organizzazione del complesso polisomale ribonucleoproteico nativo e il suo potenziale effetto sulla traduzione sono ancora problemi piuttosto oscuri. Polisomi possono nascondere ancora organizzazioni ordinate e funzionali sconosciuti, potenzialmente mirroring quali nucleosomi e Contro epigeneticols hanno rappresentato per il campo di trascrizione. In effetti, l'indagine di questa ipotesi intrigante richiede ulteriori studi e nuovi approcci tecnici. In questa linea, le tecniche strutturali e microscopia a forza atomica possono proficuamente collaborare per svelare nuovi meccanismi per il controllo dell'espressione genica, in modo simile a quanto realizzato per il nucleosoma ^17,18.

Dalla scoperta del ribosoma ^14-16, la sua struttura è stata ampiamente caratterizzata procarioti ^19,20, lievito ²¹ e più recentemente in umano ^22, fornendo la descrizione molecolare dei meccanismi alla base della sintesi proteica. Polisomi sono stati inizialmente rilevati sulla membrana del reticolo endoplasmatico, formando organizzazioni geometriche 2D tipici ^14. Come accennato prima, polysome assembly non è stato oggetto di interesse costante come la struttura ribosoma. In passato, polisomi sono stati studiati essenzialmente trtecniche asmissione EM-based. Solo di recente, le tecniche di crio-EM hanno consentito la ricostruzione 3D della polisomi purificati dai sistemi in vitro di traduzione ^23-26, lisati cellulari umani ²⁷ o ²⁸ nelle cellule. Queste tecniche offerto informazioni più raffinata sull'organizzazione ribosoma-ribosoma in polisomi ^{23, 26-28} e una descrizione molecolare preliminare delle superfici di contatto dei ribosomi adiacenti in polisomi germe di grano ^24. Così, Cryo-EM tomografia permette la divulgazione delle interazioni ribosoma-ribosoma con dettaglio molecolare, ma è gravata da un ampio post-elaborazione e analisi di ricostruzione che richiedono risorse di calcolo pesanti per la gestione dei dati. Inoltre, per ottenere dettaglio molecolare delle interazioni ribosoma-ribosoma, è necessaria una mappa altamente risolto del ribosoma, e questo tipo di ribosoma riferimento è disponibile solo per poche specie. È importante sottolineare che, Cryo-EM tomografia non è in grado di rilevare l'RNA libero. Therefminerale, nuove tecniche sono necessari per comprendere appieno l'organizzazione della macchina di traduzione.

Accanto a Cryo-EM, AFM è stato anche impiegato come uno strumento utile per l'imaging diretto di polisomi negli eucarioti inferiori ^29-33 e gli esseri umani ^27. Rispetto a EM, AFM non richiede la fissazione del campione o l'etichettatura. Inoltre, le misurazioni possono essere eseguite in condizioni fisiologiche vicino e con la possibilità unica di individuare chiaramente sia ribosomi e filamenti di RNA nudi ^27. Imaging singoli polisomi può essere eseguita in tempi relativamente brevi, ottenendo migliaia di immagini a nano risoluzione con poco sforzo di post-trattamento rispetto al vasto e pesante post-elaborazione e ricostruzione delle analisi previste dalla crioconservati microscopia-EM. Di conseguenza, AFM manipolazione e l'analisi dei dati non ha bisogno di posti di lavoro costosi e potenza di calcolo. Come tale, questa tecnica raccoglie informazioni su forme polisomale, caratteristiche morfologiche (ad esempioaltezza, lunghezza e larghezza), densità ribosoma, la presenza di RNA libero e il numero dei ribosomi per polysome ²⁷ con un volume maggiore di crio-EM. In tal modo, AFM rappresenta un approccio potente e complementare alle tecniche EM per ritrarre polisomi ^27.

Qui vi presentiamo una pipeline completa da purificazione per l'analisi dei dati in cui AFM viene applicata all'immagine e analizzare il mouse polisomi cerebrali. Il protocollo proposto concentra sui problemi di depurazione e sulla deposizione accurata di polisomi su substrati mica che vengono utilizzati per l'imaging AFM. Oltre all'analisi delle particelle convenzionale che può essere facilmente effettuata con il software comune usato dalla comunità AFM, un plugin ImageJ ^34, chiamato RiboPick, viene presentato per il conteggio del numero dei ribosomi per polysome ^{27, 35.}

Protocollo

Le pratiche utilizzate per ottenere i tessuti di topo sono stati approvati dal corpo per la protezione degli animali (OPBA) dell'Università degli Studi di Trento (Italia), il protocollo n. 04-2015, il decreto di cui al art.31 legislativo n. 26/2014. Tutti i topi sono stati mantenuti al Organismo modello Struttura del Centro per la Biologia Integrata (CIBIO), Università degli Studi di Trento, Italia.

Attenzione: Per evitare qualsiasi degradazione dell'RNA dei campioni, preparare tutti i buffer con acqua DEPC trattati per ridurre al minimo la contaminazione RNasi.

1. Preparazione di polisomi da Brains Interi

1. Raccolta di tessuti cerebrali (15 min)
   1. Euthanize wild-type ceppo di topi C57BL / 6 con CO ₂ asfissia per 5 min ^36. Sezionare accuratamente il cervello dal cranio ^36, posizionare il tessuto in una provetta da 1,5 ml e metterlo immediatamente in azoto liquido. Conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
2. Preparazione del lisato (30 min)
   1. Polverizzare l'intero tessuto cerebrale utilizzandoun mortaio e pestello sotto azoto liquido.
   2. Trasferire circa 25 mg di polvere in una provetta fredda e immediatamente (per evitare lo scongelamento del tessuto polverizzato) aggiungere 0,8 ml di tampone di lisi (vedi Tabella 1) e disturbare la cella pipettando su e giù 25 volte rapidamente.
   3. Centrifugare la provetta a 12,000 xg per 1 min a 4 ° C per sedimentare detriti cellulari.
   4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e mantenere il tubo in ghiaccio per 15 min.
   5. Centrifugare la provetta a 12,000 xg per 5 minuti a 4 ° C a pellet nuclei e mitocondri.
   6. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
   7. Conservare il supernatante a -80 ° C per un massimo di 6 mesi o utilizzare immediatamente.
3. Saccarosio preparazione gradiente e centrifugazione (2 ore e 30 min)
   1. tubi ultracentrifuga Lavare a lungo con RNase-free acqua (acqua trattata dietilpirocarbonato (DEPC-acqua) o commerciale) di und 3% H ₂ O / DEPC H soluzione ₂ O _2.
   2. Mettere i tubi in ghiaccio e aggiungere 5,5 ml di soluzione di saccarosio al 50% freddo nella parte inferiore di ciascun tubo (vedi Tabella 1 per soluzioni di saccarosio). Aggiungere con cautela la caduta di soluzione di saccarosio al 15% a goccia, rimanendo vicino al interfase per preservare un interfase tagliente, finché il tubo sia completamente riempito. Quando il tubo viene riempito completamente, chiuderla con un tappo di gomma per evitare la formazione di bolle d'aria.
   3. In una stanza fredda delicatamente fissare i tubi in orizzontale e tenerlo in questa posizione per 2 ore. Trascorso questo tempo, lentamente raddrizzare i tubi nella posizione verticale e metterli in ghiaccio. I gradienti sono ora pronti per essere utilizzati. In alternativa, preparare il gradiente di saccarosio 15-50% utilizzando un gradiente convenzionale ex.
   4. In una stanza fredda rimuovere attentamente 1,0 ml dalla sommità del gradiente e sovrapporre la goccia di saccarosio a goccia con il lisato citosolica (cioè, il supernatante ottenuto in step 1.2).
   5. Abbassare con cautela i tubi nei secchi di rotore oscillante. Centrifugare i gradienti per 100 min a 180.000 xg a 4 ° C usando un'ultracentrifuga.
   6. Dopo la centrifugazione, lasciare i tubi in loro secchi per 20 min a 4 ° C per consentire ai gradienti stabilizzano.
4. frazionamento gradiente di saccarosio (2 ore)
   1. Rimuovere con cautela un tubo ultracentrifuga dal rotore ultracentrifuge e montarlo sul dispositivo di raccolta di un gradiente di densità frazionamento del sistema. Raccogliere 1 ml frazioni di monitoraggio l'assorbanza a 260 nm con una VIS ​​rivelatore UV / (vedi figura 1 pannello superiore). Mantenere le frazioni raccolte sul ghiaccio.
   2. Preparare aliquote di 30-40 ml delle frazioni di interesse, tenerli in ghiaccio prima di riporli a -80 ° C fino all'uso. Non utilizzare aliquote o frazioni di saccarosio che hanno subito più di due cicli di gelo-disgelo (vedi Figura 1 inferiore del pannello).

2. Preparazione del campione per la microscopia a forza atomica (3 ore)

1. Con del nastro, staccare i fogli di mica.
2. Lavare i fogli di mica 3-4 volte con DEPC-acqua e metterlo in una piccola capsula di Petri. Quindi asciugare la superficie con l'aria.
3. Coprire la mica con 200 ml di 1 mM Niso ₄ e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la soluzione di nichel e poi asciugare la superficie con l'aria. Eseguire tutte le fasi future a 4 ° C mettendo la piastra di Petri con la mica su ghiaccio.
5. Scongelare una aliquota ottenuta in 1.4.2 su ghiaccio e delicatamente aggiungere tutti della goccia campione goccia sulla mica. Utilizzando una punta 100-200 microlitri, spalmare il campione su tutta la superficie della mica. Incubare il campione in ghiaccio per 3 min.
6. Coprire la goccia foglio di mica a goccia con 200 ml freddo Buffer-AFM (vedi Tabella 1) e incubare per 1 ora su ghiaccio.
7. Imaging a liquido
   1. Rimuovere con attenzione il Buffer-AFM e lavare i fogli di mica 3-4 tempos con 200 ml freddo Buffer-AFM per rimuovere l'eccesso di saccarosio. Poi lavare i fogli di mica 3 volte con tampone di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1), lasciando la superficie di mica ricoperta da alcuni microlitri di soluzione.
   2. Vai al punto 3 (acquisizione immagine).
8. Imaging in aria
   1. Rimuovere con cautela il Buffer-AFM e lavare la mica 3-4 volte con 200 pl freddo Buffer-AFM per rimuovere l'eccesso di saccarosio. Poi, lavare il mica 3 volte con soluzione di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1) e scaricare l'acqua in eccesso con carta.
   2. Lasciare asciugare il campione sotto il cofano chimica con la parte superiore della scatola di Petri parzialmente aperta. Dopo 2 ore, chiudere la piastra di Petri e conservare a temperatura ambiente. Misurare il campione dopo 2-3 ore come sono stabili per anni.

3. Acquisizione di immagini (15 min per immagine dopo la stabilizzazione termica)

Nota: polisomi immobilizzati su mica possono essere esposte in aria o in liquido, utilizzando la modalità AC.

1. Fissare la mica a supporto del campione con del nastro biadesivo.
2. Inserire il supporto del campione nella fase AFM seguendo le indicazioni del produttore. Quando l'imaging in liquido, se possibile, cercare di mantenere il campione ad una temperatura inferiore a 25 ° C per aumentare polysome stabilità nel tempo.
3. Selezionare un cantilever adatta per l'imaging CA e montarlo sul supporto punta seguendo le indicazioni del produttore. Qui, l'uso cantilever con forza costante tra 2-20 N / m per l'imaging e l'aria intorno a 0,1 N / m per l'imaging liquido.
4. Regolare il punto laser sulla mensola e azzerare i segnali rivelatori quadrante.
5. Selezionare una frequenza di pilotaggio opportune e guidare il cantilever con un'ampiezza di 10-20 nm.
6. Approccio il campione fino a quando la punta impegna la superficie.
7. Selezionare un'area di scansione di 2x2 micron, acquisire almeno 512x512 pixel immagini (larghezza in pixel <4 nm), selezionare una modalità di sottrazione dello sfondo dal vivo e una scala Z di 20-25 nm.
8. ispezionare tsi cerca di immagine per la presenza di oggetti rotondi caratterizzati dalla altezza tra 10 e 15 nm quando l'acquisizione in aria e 25 e 30 nm quando nel liquido e la larghezza nell'intervallo 25-30 nm. Regolare i parametri di setpoint e un giudizio fino ad oggetti appuntiti sono visualizzati. Lo sfondo deve apparire relativamente piatta in buoni campioni, con alcuni oggetti di altezza 2-4 nm (vedi Figura 2A e B).
9. Se l'immagine sembra buono (come indicato al punto 3.8), acquisire diversi (almeno dieci) scansioni 2x2 micron a diverse aree campione.
10. (opzionale). Se necessario, acquisire immagini ad alta risoluzione di polisomi selezionati (vedi Figura 2C).
11. Applicare correzioni software (piano sottrazione e line-by-line algoritmi di correzione) per correggere le immagini AFM rimozione inclinazione arbitraria e alla deriva effetti.

4. Analisi dei dati (30 min per immagine)

1. esportare immagini in ImageJ (opzionale: applicare un fattore di scala) Preferentbuona resa utilizzando un formato di compressione senza perdita di dati, ad esempio, il formato TIFF (vedi Figura 3A).
2. Utilizzare la macro set di strumenti RiboPick.ijm ImageJ (da copiare nella macro / set di strumenti sottodirectory ImageJ) per contare ribosomi in polisomi (vedi Figura 3B) e calcolare le proprietà statistiche del campione (vedi Figura 3C).
   1. Inizia il caricamento di un'immagine utilizzando il strumento che inizializza il programma.
   2. Scegli i centri ribosoma con il standard di ImageJ strumento (shift + click sinistro consente la selezione multipla dei ribosomi). Segnare i ribosomi selezionati con il strumento. coordinate Ribosoma verranno visualizzati in una finestra di testo personalizzato.
   3. Aggiungere più ribosomi allo stesso polysome ripetendo la procedura indicata al punto 4.2.2.
   4. Rimuovere ribosomi erroneamente contrassegnati con l' strumento (inizia la rimozione dall'ultimo ribosoma aggiunto al primo212; nel polysome corrente).
   5. Quando la polysome è completata, utilizzare il strumento. Come si aggiunge il numero polysome come una sovrapposizione all'immagine, viene aggiornata la finestra di testo.
   6. Utilizzare il di scrivere il ribosoma un'immagine PNG che riassume ribosomi e polisomi la raccolte di file (le unità predefinite dell'immagine vengono utilizzati) e coordina. L'immagine originale è chiuso senza essere salvato.

Risultati

Il saccarosio gradiente polisomale profiling dell'intero cervello di topo

È possibile purificare polisomi da un lisato cellulare mediante profilatura polisomale, che separa macromolecole conformemente al loro peso e dimensioni. Con profiling polisomale, lisati citoplasmatici ottenuti da cellule o tessuti coltivati, come in questo esempio, vengono caricati su un gradiente di saccarosio lineare e trattati d...

Discussione

Poiché la struttura del DNA è stato dimostrato di essere di fondamentale importanza per descrivere il processo di trascrizione e l'organizzazione della cromatina avanzata nostra comprensione di controllo trascrizionale dell'espressione genica, è essenziale analizzare l'organizzazione e la struttura dei polisomi per migliorare la comprensione veritiera della traduzione e la sua regolazione.

Con il protocollo descritto, una densità ottimale di polisomi delicatamente immobilizza...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cycloheximide	Sigma	01810	Prepararation of lysate
DNAseI	Thermo Scientific	89836	Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor	Life technologies	EO-0381	Prepararation of lysate
DEPC	Sigma	40718	Prepararation of lysate
Triton X100	Sigma	T8532	Prepararation of lysate
DTT	Sigma	43815	Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate	Sigma	D6750	Prepararation of lysate
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Prepararation of lysate
Sucrose	Sigma	S5016	Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima LE-80K	Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor	Beckman Coulter	SW 41 Ti	Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube	Beckman Coulter	331372	Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System	Teledyne Isco	67-9000-176	Sucrose gradient fractionation
AFM	Asylum Research	Cypher	Polysome visualization