מודל הפיברוזיס Dimethylnitrosamine מושרה בחולדה

Summary

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Abstract

ארבעה עד שישה בן שבוע, חולדות Wistar זכר שימשו להפקת במודלים של בעלי חיים של פיברוזיס בכבד. התהליך דורש ארבעה שבועות של הממשל של 10 מ"ג / ק"ג dimethylnitrosamine (DMN), נתון intraperitoneally במשך שלושה ימים רצופים בשבוע. זריקות Intraperitoneal בוצעו במנדף כמו DMN הוא hepatoxin ו מסרטן ידוע. יש מודל מספר יתרונות. ראשית, שינויים כבדים ניתן ללמוד ברצף או בשלבים מסוימים של עניין. שנית, בשלב של מחלה כבדה יכול להיות במעקב על ידי מדידה של aminotransferase אלאנין בסרום (ALT) ו aminotransferase aspartate (AST) אנזימים. שלישית, את חומרת הניזק כבד בשלבים שונים יכולה להיות מאושרת על ידי הקרבת חיות בנקודות זמן מיועד, ואחריו בדיקה היסטולוגית של הרקמות הכבדות המוכתמות היונק של מייסון. לאחר ארבעה שבועות של מינון DMN, תוצאת סיסטיק הטיפוסית היא 5 עד 6 בסולם אסחאק. המודל יכול להיות מועתק באופן עקבי כברבשימוש נרחב כדי להעריך את היעילות של תרופות אנטי-fibrotic פוטנציאליים.

Introduction

DMN הוא רעלן ספציפי בכבד חזק. חילוף החומרים, רקמות תפוצתו, והיכולת לגרום לפגיעה כבדה חולדות נמסרו על ידי מגי ^1, ואת המכניזם הקשור לניזק hepatocyte מוות של תאים על ידי אפופטוזיס תואר על ידי פריצ'רד ובאטלר ^2. ממשל לסירוגין של המתחם הזה נמסר לגרום פיברוזיס כבד כלבים וחולדות ^3,4.

המנגנונים ושינויים מורפולוגיים של הפיברוזיס נחקרו בהרחבה באמצעות מודל זה. במחקרים מוקדם באמצעות עכברוש, 3 שבועות טיפול עם DMN מיוצר נמק המורגי centrilobular ואחריו שחמת micronodular ללא steatosis ^5. זה היה הראה כי ב סיסטיק מוקדם, קולגן נוצר היה יותר לחצות מקושר עם הסוג III להיות בולט יותר מסוג I ^6. במשותף עם גורמים אחרים, שינויים fibrotic הנגרמת DMN היו קשורים עם עלייה תאים Kupffer; מקרופאגים כבדים הנמצאים in את sinusoids. תאים אלה morph לתוך myofibroblasts לייצר כמויות עודפות של תאי מטריקס המהווה את הבעיה העיקרית ב סיסטיק ^7.

מבחינת איתות הסלולר, נקמורה et al., הוכיחו כי TGF-β משחק תפקיד קריטי בהתקדמות של הכבד סיסטיק ^8. הם השתמשו אדנו לבטא קולטן TGF-β II סוג קטום, לעכב באופן ספציפי איתות TGF-β. פיברוזיס כבד חולדות אלה נבלם בצורה מרהיבה במהלך טיפול DMN בהשוואה לקבוצות ביקורת. מחקרים אחרים אשרו כי דיכוי TGF-β מוביל קל של פיתוח כבד סיסטיק ^9,10. המודל גם שימש במחקר פרופיל גנטי העולמי לזהות סמנים סיסטיק אחרים וחלבונים אשר יכול לשמש מטרה לתרופות לטיפול אנטי-fibrotic ^11.

חומרים כימיים אחרים המשמשים כדי לעודד פיברוזיס בכבד כוללים thioacetamide (TAA) ו- Cטטרא arbon (CCL _4). TAA שימש לראשונה אצל חולדות מאוחר יותר בעכברים ^12. היתרונות של מודל זה כוללים: קלות ההעברה כימית במי שתייה, השחזור של המודל עם שחמת micronodular מאפיין ושינויים ביוכימיים. החסרונות כוללים: תקופת הזמן של 3 חודשים עבור פיברוזיס כבד לפתח וחוסר ההבנה של המנגנון המולקולרי לזירוז של פיברוזיס בכבד. באשר CCl _4, השימוש בו ירד מהסיבות הבאות: זה לא לחקות מחל כבד אנושיות, יש השפעות מזיקות על שכבת האוזון, גורם לכאב ומצוקה לבעלי חיים, הוא מאוד רעיל לבני אדם ומחייב זהירות בטיפול שלה לרשות ^13,14.

חסימת דרכי המרה ממושך (על ידי התערבות כירורגית) כמודל ניסיוני עבור שחמת הכבד דווח לראשונה על ידי Kountouras et al. ^15. שיטה זו היא רעילה לבני אדם ובעלי חיים. However, הזמן הנדרש הפיברוזיס לפתח משתנה. סקירה של 30 דוחות על ידי Marques et al. ^16, נמצאה כי זה לקח מן שבעה ימים עד ארבעה שבועות לאחר ניתוח עבור פיברוזיס כבד לפתח. השינויים הפתולוגיים תארו לחקות את אלה של סיסטיק המר אדם כרוני המודל יהיה מתאים יותר עבור חוקרים המעוניינים בתחום זה.

לסיכום, הממשל לסירוגין מינון קבוע של DMN בחולדה מעל 4 שבועות מייצר הפיברוזיס מחקת המחלה האנושית. חולדות במינון להראות התפתחות הדרגתית של הפיברוזיס נזק parenchymal ^4,17. התקדמות וחומרת המחלה יכולה להיות פיקוח באמצעות דגימות דם או הקרבת בעלי חיים בנקודות ספציפיות זמן ההשפעה היא מאוד לשחזור ^18. לכן המודל כבר בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים של סיסטיק הכבד שחמת וכן להקרין לסוכני פוטנציאל אנטי fibrotic ^10,19,20.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ולשימוש חיה של בית הספר למדע שימושי, Temasek הפוליטכני.

1. הכנת DMN

1. פיפטה 200 μl של DMN (1 גר '/ מ"ל ​​פתרון המניות) ולהוסיף 19.8 מ"ל של PBS להכין פתרון DMN 10 מ"ג / מ"ל ​​עבור הזריקה.
   הערה: DMN הוא מסרטנים. השתמש במנדף להכין את DMN ולבצע זריקות חיה.

2. הזרקת Intraperitoneal של DMN

1. השתמש חולדות Wistar זכרו עם משקל ממוצע של 150 - 200 גרם. לאקלם חולדות במשך 4 - 7 ימים לפני תחילת הניסוי.
2. לשמור על חולדות בטמפרטורת חדר של 22 ± 1 ° C, עם 12 אור hr ו -12 שעות מחזורים כהים. ספק צ'או חולדה כרצונך מים.
3. מדוד צריכת מזון ומים מדי יום. מדוד שבועי משקל גוף.
4. לחשב את הסכום של DMN לכל חולדה מבוסס על מינון של 10 מ"ג / ק"ג משקל גוף. השתמש מזרק 1 מ"ל עם חולצת מחט 25 מדo לצייר את הנפח המחושב של פתרון DMN לתוך המזרק.
5. לרסן את העכברוש להזרקה intraperitoneal ^21.
6. עם מאופק העכברוש כראוי, להציג את המחט לתוך ברבע הימני התחתון של הבטן, לסגת על הבוכנה של המזרק (שום דבר לא צריך להיות aspirated) כדי לבדוק את המיקום המתאים של מחט בתוך המרחב בטן להזריק פתרון DMN לאט.
7. כאשר המינון של DMN כבר מנוהל, לאט למשוך את המחט ולהיפטר לפח החד.
8. בצעו את זריקות intraperitoneal של DMN במשך 3 ימים רצופים בשבוע במשך 4 שבועות. נהל את הזריקות באותו זמן בכל יום. Re-לחשב את המינון מבוסס על משקל גוף בתחילת כל שבוע של זריקות.
9. איסוף דם משבועון וריד הזנב למדוד פרמטרים ביוכימיים: aminotransferase אלאנין (ALT) ו aminotransferase aspartate (AST) ^22.
10. ALT ו- AST בסרום מדוד באמצעות Vet מסחרימנתח כימית מבחן.

בחינת גרוס 3. קציר של הכבד

1. להרדים את החולדות על ידי הזרקת intraperitoneal של pentobarbital במינון של 100 מ"ג / ק"ג משקל גוף. ודא למוות על ידי בדיקת העדר דופק.
2. היכונו פוסט מורטם ולהעריך את מצבו של החיה כפי שתואר על ידי פרקינסון et al. ²³ עכברושים מתים מקום ללוח לנתח שכיבה על הגב עם הבטן כלפי מעלה.
3. לחטא ו ללחלח את העור עם 70% אתנול.
4. בעזרת מספריים, לחתוך את העור אורכו של ventrum מפי הטבעת אל הסנטר, ומשקפים את העור. עם מספריים, לחתוך את דופן הבטן מפי הטבעת אל הסחוס xiphoid, לחשוף את הקרביים בטן.
5. בדוק את אברי הבטן באתרו כדי לבדוק את כל חריגות. הערה כל שינוי בצבע, בגודל, מיקום איברים ואת הנוכחות של נוזל בתוך חלל הצפק. לִבחוֹן העקביות של איברים לציין את נוכחותו של כל ריחות.
6. בעזרת מספריים מלקחיים, לנתח את בחינם הכבד כולו של הרצועות ונספחיו.
   1. תחילתו של מסלול hilus שבו היא מחוברת הסרעפת ולעבוד לשחרר את כל האונה של הכבד של קבצים מצורפים. בזהירות לחתוך את כל הרצועות וכלי דם.
7. מעבירים את הכבד על צלחת פטרי ולשקול את הכבד.
8. באמצעות אזמל, לחתוך 2 - חלקים עבים 5 מ"מ של אונה של הכבד. לקבלת עקביות, תמיד לקחת דגימות מאותו האונה הכבדה. קח טריז כ -5 מ"מ קוטר עובי, מהאונה לרוחב תקין ²⁴ כ -1 ס"מ מהקצה של המקום lobe.Immediately לתוך פורמלין 10% שנאגרו עבור קיבעון. ודא הרקמה נפח פורמלין היא 1:10 או יותר.
9. קציר ומיד להקפיא חלקים (באמצעות חנקן נוזלי) של אונה של הכבד בשלב זה אם נדרש מחקרים אחרים. באשר (3.8), מדגם מאותה האונה כבדה לעקביות.

ילדה = "jove_title"> 4. עיבוד, טבעת ואת החתך של הכבד

1. תקן דגימות כבד בפורמלין 10% שנאגרו למשך תקופה מינימלית של 24 שעות.
2. לאחר קיבוע, חתוך את הכבד, להציב לתוך קלטות ומעלה אותם לתוך הסל של מעבד רקמות האוטומטית.
3. מניחים את הסל עם קלטות לתוך התחנה הראשונה המכיל 10% שנאגרו פורמלין. ודאו הקלטות שקועות לגמרי. הם יכולים להישאר בחדר הזה עד 12 שעות עד המחזור מתחיל.
4. לתכנת את מעבד הרקמות כדי לסובב את הקלטות עבור שעת 1 כל אחד, באמצעות תחנות רצופות המכילות את הפתרונים הבאים: אתנול בריכוזים של 50%, 70%, 90%, 100% (2 תחנות), קסילן (2 תחנות) פרפין נוזלי ( 2 תחנות).
5. העברת הדגימות הכבדות לאמבטית השעווה של תחנת ההטבעה. ודא שמכשיר ההטבעה מופעל לפחות קודם לכן שעה אחת.
6. מלקחיים מחומם מראש באמצעות (65 מעלות צלזיוס), הסר כל קלטת מן wאמבטיה ומקום גרזן לצלחת החמה (65 מעלות צלזיוס) של מכונה ההטבעה. לוותר כמות מספקת של פרפין נוזלי לתוך תבנית בסיס נירוסטה (מחומם מראש ל 65 מעלות צלזיוס) עד חצי מלא. מעבירים את החלק של הכבד מתוך הקלטת לתוך התבנית. ודא הדגימה ממוקמת עם המשטח לחתוך (להיבדק מיקרוסקופי) שטוח על החלק התחתון של התבנית.
7. ממלאים את התבנית לחלוטין עם פרפין נוזלי, לעלות על קלטת ריקה על גבי ולמקם את התבנית על צלחת 4 ° C. של המכונה הטבעה להתקרר במשך 30 דקות לפחות.
8. בדוק כי השעווה מתקררת הקרושה, ולהסיר את בלוק פרפין מהתבנית. הבלוק צריך לקפוץ בקלות ולא להיצמד או סדק. אם זה יקר, להמס את הגוש וחזור על שלב זה. בלוק פרפין יכול להיות מחולק פעם זה מבצר. בלוקים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך שנים רבות.
9. מניחים את גוש פרפין לתוך microtome וסעיף 10 מיקרומטר עובי עד שהשכבה שעווהמוסר מספיק עבור רקמת הכבד מוטבעת להיות גלויה.
10. שנו את ההגדרה על microtome לחתוך בכל 5 מיקרומטר עובי. בעזרת מלקחיים, להרים את החלק לחתוך היטב על ידי מחזיק אותו בקצה ובזהירות לצוף בסעיף באמבט מים בטמפרטורה של C ° 40.
11. בעדינות במקום שקופית זכוכית נקיה תחת הסעיף צף והרם אותו על פני השטח של שקופיות הזכוכית. מניחים את השקף לשקופית חם ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

5. מאסון Trichrome מכתים

1. לפני החלת כתמים, לטפל השקופיות כדי להסיר את השעווה רעננותם הרקמות כדלקמן:
   1. לטבול את הסעיפים קסילן במשך 5 דקות. חזור 2x.
   2. לטבול את הסעיפים אתנול 100% במשך 3 דקות. חזור 1x.
   3. לטבול את סעיפים 1 דקות כל אחד הפתרונות הבאים של אתנול: 90%, 80% ו -70%.
2. יש לשטוף את השקופית תחת מי ברז כדי להסיר כל אתנול הקיים בשקופית.
3. לטבול שקופיות הברזל Hematoxylin במשך 10 דקות להכתים את הגרעין.
4. יש לשטוף את השקופיות במים כדי להסיר את הכתם עודף משקופית.
5. לטבול את השקופיות Biebrich סקרלט-חומצה Fuchsin למשך 2 דקות להכתים את הציטופלסמה.
6. יש לשטוף את השקופיות עם מים.
7. מניח את שקופיות Phosphotungstic / Phosphomolybdic חומצת פתרון במשך 10 דקות כדי לקדם את הספיגה של כחול אנילין. שנה את פתרון חומצת Phosphotungstic / Phosphomolybdic אחרי 2 סיבובי שימוש.
8. מניחים את השקופיות פתרון כחול אנילין במשך 10 דקות להכתים את סיבי הקולגן.
9. יש לשטוף את הכתם עם עודף מים ומניחים את שקופיות פתרון חומצה 1% אצטית עבור 1 דקות כדי לאפשר בידול להתקיים כדי להבהיר את הצבע של השקופית יותר עדין ושקוף.
10. יש לשטוף את השקופיות עם מים והמשך מייבש את סעיפי רקמות. צעדי ההתייבשות הם כדלקמן:
11. לטבול את השקופיות ברציפות במשך 10 שניות בכל פעם, ב conce הבאntrations של אתנול: 70%, 80%, 95% ו -100%.
12. לטבול את השקופיות עבור 30 שניות באתנול 100%. חזור 1x.
13. יש לשטוף את השקופיות באמצעות 3 תחנות של קסילן במשך 5 דקות כל אחד כדי להסיר אתנול.
14. הר להחליק כיסוי זכוכית על הדגימה עם תקשורת הרכבה (למשל, DPX mountant) ולאפשר לו להתייבש.
    הערה: DPX הוא שרף סינטטי שמתייבש מהר, שומר כתם ומגן על קטע הרקמה.

6. ניקוד פיברוזיס על סעיפים ויטראז יונקת של מהאסון של כבד

1. יש פתולוג וטרינרי להעריך את חומרת סיסטיק פי סיסטיק להבקיע ^25. זה יהיה אופטימלי אם ניקוד סיסטיק נעשה על ידי שניים או שלושה פתולוגים עצמאיים באופן עיוור. בתרחיש כזה, להשיג תוצאה סופית לאחר דיון וסקירת קבוצה למיין את כל הבדלים בשערו.

ציון	תיאור
0	אין סיסטיק
1	הרחבה סיבית של כמה תחומי פורטל, עם או בלי septa הסיבי קצר
2	הרחבה סיבית על רוב אזורי פורטל, עם או בלי septa הסיבי קצר
3	הרחבה סיב תחומי הפורטל ביותר, פורטל מזדמן פורטל (PP) גישור
4	הרחבה סיב תחומי פורטל עם גישור מסומן (פורטל פורטל (PP) וכן לפורטל (מחשב מרכזי)
5	מסומן גישור (PP ו / או PC) עם גושים מזדמנים (שחמת שלמה)
6	שחמת, סביר או מובהק

טבלת 1: פיברוזיס ניקוד המשמשת קריאת הסעיפים הכבדים ויטראז היונקת של מייסון ^25.

תוצאות

חולדות DMN מטופלים לרדת במשקל ולהיות פחות נמרץ עם מעייל שיער פרוע. יש אובדן משמעותי משקולות הגוף הממוצע של חולדות שטופלו DMN; הראשון לזיהוי לאחר 2 שבועות של טיפול DMN, וההבדל הזה נשאר דרך שבועות 3 ו -4 לאחר טיפול DMN (איור 1 א). כמו החולדות לקבל DMN בשבו?...

Discussion

תיארנו שיטה לעשות במודל חיה של פיברוזיס בכבד ועל מנת להעריך את חומרת הפיברוזיס. חשוב לספק את המינון הנכון של DMN ו לדבוק בלוח הזמנים של זריקות intraperitoneal שבועיות. ככל שהניסוי מתקדם, חשוב לשקול את החולדות מחדש לחשב את המינון בתחילת כל שבוע של זריקות DMN. זכור כי DMN הוא רעילים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethylnitrosamine	Wako	147-03781
Formalin	Sinopharm chemicals	F63257009
Ethanol	Sigma	64-17-5
Xylene	Fisher	1330-20-7
Masson trichome stains
Aniline Blue	Electron Microscopy Sciences	#42755
Acid Fuschin	Electron Microscopy Sciences	RT42685
Scarlet Red	Electron Microscopy Sciences	#26905
Phosphotungstic Acid Hydrate	ALFA AESAR	ALFA40116.4
Phosphomolybdic Acid Hydrate	Sigma SG	221856-25G
Weigert's Iron Hematoxilyn	Merck	1.15973.0002
DPX Mounting Medium	Merck	HX066873
Tissue processor	Leica	Leica TP 1020
Embedding machine	Sakura	Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System
Microtome	Leica	Leica RM 2235
Vet Test Analyzer	Idexx	Vet Test 8008