АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Аннотация

От четырех до шести недель, самцы крыс Вистар были использованы для производства животных моделях фиброза печени. Процесс требует четыре недели введения 10 мг / кг диметилнитрозамин (DMN), внутрибрюшинно в течение трех последовательных дней в неделю. Внутрибрюшинные инъекции были выполнены в вытяжном шкафу, как DMN является известным hepatoxin и канцерогеном. Модель имеет ряд преимуществ. Во-первых, изменения печени могут быть изучены последовательно или на отдельных этапах интерес. Во-вторых, стадия заболевания печени можно контролировать путем измерения сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартат аминотрансферазы (AST) ферментов. В-третьих, тяжесть поражения печени на разных стадиях может быть подтверждена жертву животных в обозначенных временных точках, с последующим гистологическим исследованием трихому окрашенных тканей печени Массона. После четырех недель DMN дозирования, типичный балл фиброзом составляет от 5 до 6 по шкале Исхак. Модель может быть воспроизведена последовательно и былошироко используется для оценки эффективности потенциальных анти-фиброзных агентов.

Введение

DMN является мощным печени специфический токсин. Его метаболизм, распределение в тканях, и способность причинить вред печени крыс , сообщает Маги 1, а механизм повреждения гепатоцитов и гибели клеток путем апоптоза был описан Притчард и Батлера 2. Прерывистое введение этого соединения было сообщено , чтобы вызвать фиброз печени у собак и крыс 3,4.

Механизмы и морфологические изменения фиброза печени широко исследованы с использованием этой модели. В ранних исследованиях с использованием крыса, 3-недельного курса лечения с DMN производства центродолевая некроз геморрагический с последующим micronodular цирроза без стеатоза 5. Было показано , что в начале фиброза, коллаген формируется более сшитый с типом III является более заметным , чем я типа 6. Наряду с другими причинами, DMN-индуцированных фиброзные изменения были связаны с увеличением числа клеток Купфера; печеночные макрофаги, обитающие Iп синусоиды. Эти клетки превращаются в миофибробласты и производят избыточное количество внеклеточной матрицы , которая является основной проблемой при фиброзе 7.

С точки зрения передачи клеточных сигналов, Накамура и др. Показали , что TGF-β играет критическую роль в прогрессировании фиброза печени 8. Они использовали аденовирус, экспрессирующий усеченный типа II рецептора TGF-бета, специфически ингибируют передачу сигналов TGF-бета. Фиброз печени у этих крыс было остановлено эффектно во время лечения DMN в сравнении с контрольными группами. Другие исследования подтвердили , что подавление TGF-бета приводит к облегчению развития 9,10 фиброзом печени. Эта модель была также использована в глобальном исследовании профилированию генов для выявления других маркеров фиброза и белки , которые могут быть использованы в качестве мишеней для лекарственных средств для борьбы с фиброзной терапии 11.

Другие химические вещества, используемые для индукции фиброза печени включают тиоацетамидом (ТАА) и сАрбона четыреххлористый (CCl 4). ТАА впервые был использован у крыс , а затем у мышей 12. Преимущества этой модели включают: легкость химической администрации в питьевой воде, воспроизводимости модели с характерным micronodular цирроза и биохимических изменений. К недостаткам можно отнести: длительный период времени 3 месяца для фиброза печени развивать и отсутствие понимания молекулярного механизма для индукции фиброза печени. Что касается CCl 4, его использование сократилось по следующим причинам: он не имитирует человеческую болезнь печени, оказывает вредное воздействие на озоновый слой, вызывает боль и страдания животных, очень токсичны для человека и требует дополнительных мер предосторожности в своем обращении и утилизация 13,14.

Продолжительные обструкции желчных протоков (путем хирургического вмешательства) в качестве экспериментальной модели для цирроза печени было впервые сообщено Kountouras и др. 15. Этот метод не является токсичным для человека и животных. ЧАСowever, время, необходимое для фиброза печени для разработки варьируется. Обзор 30 докладов Marques и др. 16, обнаружили , что потребовалось от семи дней до четырех недель после операции на фиброз печени развиваться. Патологические изменения, описанные сходны с человека хронического билиарного фиброза и модель будет больше подходит для исследователей, заинтересованных в этой области.

Таким образом, периодическое введение постоянной дозы DMN у крыс в течение 4-х недель производит фиброз печени, который имитирует заболевание человека. Дозированного крыс показывают прогрессивное развитие поражения печени и паренхимы фиброза 4,17. Прогрессирования и тяжесть заболевания можно контролировать с помощью образцов крови или жертву животных в определенные моменты времени и эффект высокой воспроизводимостью 18. Таким образом, модель широко используется для изучения механизмов фиброза печени и цирроза печени, а также для скрининга потенциальных анти-фиброзных агентов 10,19,20.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены уходу и использованию животных комитета школы прикладных наук, Temasek Polytechnic.

1. Получение DMN

  1. Пипетка 200 мкл DMN (1 г / мл стоковый раствор) и добавляют 19,8 мл PBS для приготовления 10 мг / мл раствора DMN для инъекций.
    Примечание: DMN является канцерогеном. Используйте вытяжку для подготовки DMN и выполнять инъекции животных.

2. внутрибрюшинного введения DMN

  1. Использование самцов крыс Wistar со средним весом 150 - 200 г. Акклиматизироваться крыс в течение 4 - 7 дней до начала эксперимента.
  2. Поддержание крыс при комнатной температуре 22 ± 1 ° С, с 12 ч света и 12 ч темноты циклов. Обеспечить корму для крыс и воду в неограниченном количестве .
  3. Мера еды и водозаборы ежедневно. Измерьте вес тела еженедельно.
  4. Рассчитать количество DMN для каждой крысы, основанной на дозе 10 мг / кг массы тела. С помощью 1 мл шприц с иглой 25 калибра тO нарисовать расчетный объем DMN раствора в шприц.
  5. Задержите крысу для внутрибрюшинного введения 21.
  6. С крыса правильно сдержанным, ввести иглу в нижнем правом квадранте живота, пятятся назад на поршень шприца (ничто не должно быть придыханием), чтобы проверить правильность размещения иглы в брюшной полости и медленно вводят DMN раствор.
  7. Когда доза DMN была введена, медленно извлеките иглу и утилизировать в Шарпс ведро.
  8. Выполните внутрибрюшинные инъекции DMN в течение 3-х дней подряд в неделю в течение 4-х недель. Администрирование инъекции в то же время каждый день. Пересчитывать дозу в расчете на массу тела в начале каждой недели инъекций.
  9. Собирают кровь из вены хвоста еженедельно для измерения биохимических параметров: аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартат аминотрансферазы (AST) 22.
  10. Мера сыворотки АЛТ и АСТ с использованием коммерческого VetТест химический анализатор.

3. Брутто Обследование и Жатва печени

  1. Эвтаназии крыс путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала в дозе 100 мг / кг массы тела. Убедитесь, что смерть путем проверки из-за отсутствия пульса.
  2. Подготовка к некропсический и последующей оценки состояния животного , как описано Parkinson и др. 23 -е место мертвых крыс на борту рассекает в спинных лежачее с живота вверх.
  3. Лечить и увлажнить кожу с 70% этанола.
  4. С помощью ножниц, надрезать кожу на всю длину ventrum от ануса до подбородка, и отражают кожу. С ножницами, надрезать брюшной стенки от заднего прохода к мечевидного хряща, чтобы разоблачить брюшной полости.
  5. Осмотрите органы брюшной полости на месте , чтобы проверить наличие каких - либо отклонений. Обратите внимание на любые изменения в цвет, размер, расположение органов и наличие жидкости в брюшной полости. исследоватьконсистенция органов и обратите внимание на наличие каких-либо запахов.
  6. Используя ножницы и пинцет, рассекают весь свободный печени его связок и вложений.
    1. Начало в воротах, где он прикреплен к мембране и работать, чтобы освободить всех долей печени вложений. Аккуратно вырежьте все связки и кровеносные сосуды.
  7. Перенести печень на чашку Петри и взвешивают печень.
  8. Используя скальпель, вырезать 2 - 5 мм толщиной секций долей печени. Для согласованности, всегда берут пробы из той же доли печени. Возьмем клин диаметром около 5 мм в толщину, от правой боковой лепесток 24 около 1 см от края месте lobe.Immediately в 10% забуференный формалин для фиксации. Убедитесь, что ткань объема формалина составляет 1:10 или более.
  9. Урожай и немедленно заморозить участки (с использованием жидкого азота) из долей печени в этой точке, если требуется для других исследований. Что же касается (3.8), образца из той же доли печени для консистенции.

4. Обработка, встраивание и Секционирование печени

  1. Закрепить образцы печени в 10% забуференном формалине в течение минимум 24 часов.
  2. После фиксации, обрежьте печень, поместить в кассеты и загрузить их в корзину автоматизированного процессора ткани.
  3. Поместите корзины с кассет в первой станции, которая содержит 10% буферный формалин. Убедитесь, что кассеты полностью погружен в воду. Они могут оставаться в этой камере до 12 часов до начала цикла.
  4. Программирование процессора ткани для вращения кассеты в течение 1 ч каждый, через последовательные станции, содержащие следующие растворы: этанол в концентрации 50%, 70%, 90%, 100% (2 станции), ксилол (2 станции) и жидкий парафин ( 2 станции).
  5. Передача образцов печени в восковую ванну вложения станции. Убедитесь в том, что вложение машина включена, по крайней мере на один час раньше.
  6. Используя предварительно нагретую щипцов (65 ° C), удалите каждую кассету из WТопор ванны и место на теплой плите (65 ° С) вложения машины. Распределить достаточное количество жидкого парафина в нержавеющей стали пресс-формы (предварительно нагретый до 65 ° С) до наполовину. Перенести раздел печени из кассеты в пресс-форму. Убедитесь, образец помещают с поверхности разреза (чтобы быть исследовали под микроскопом) плоско на дне формы.
  7. Заполните форму полностью жидким парафином, установите пустую кассету на верхней части и поместите форму на 4 ° C пластины вложения машины остыть в течение не менее 30 мин.
  8. Убедитесь, что воск остывает и затвердевает, и снимите блок парафина из пресс-формы. Блок должен выскочить легко и не прилипает и не трескается. Если это произойдет, растопить блок и повторите этот шаг. Парафиновый блок может быть секционного раз он застывает. Блоки могут храниться при комнатной температуре в течение многих лет.
  9. Поместите парафиновой блок в микротома и секции при толщине 10 мкм до восковой слойудаляется достаточно для встроенной ткани печени, чтобы быть видимыми.
  10. Измените настройку на микротомом сократить при толщине 5 мкм. Использование щипцов, поднимите хорошо вырезать секцию, держа его за края и аккуратно переправил сечение в водяной бане при температуре 40 ° C.
  11. Аккуратно чистое предметное стекло под плавающим секции и поднять его на поверхность предметного стекла. Поместите слайд на слайд теплее при 37 ° С в течение ночи.

5. Массона трехцветный Окрашивание

  1. Перед нанесением пятна, обработать слайды для удаления воска и увлажняет ткани следующим образом:
    1. Погружают секции в ксилоле в течение 5 мин. Повторите 2 раза.
    2. Погружают секции в 100% этаноле в течение 3 мин. Повторить 1 раз.
    3. Погружают секции в течение 1 мин по каждой из следующих растворов этанола: 90%, 80% и 70%.
  2. Промыть слайд под проточной водой, чтобы удалить любой существующий этанол на слайде.
  3. Погрузитесь слайдов в железном гематоксилином в течение 10 минут для окрашивания ядра.
  4. Промыть слайды с водой, чтобы удалить избыток пятно с горкой.
  5. Погрузите слайды в Бибрих Scarlet-фуксинсернистой кислотой в течение 2 мин для окрашивания цитоплазмы.
  6. Промыть слайды с водой.
  7. Поместите слайды в фосфорно-вольфрамовой / фосфорно-кислотном растворе в течение 10 мин, чтобы способствовать поглощению анилина синий. Изменение Кислый раствор фосфорно-вольфрамовой / фосфорно после 2-х раундов использования.
  8. Поместите слайды в анилин синий раствор в течение 10 мин, чтобы окрасить коллагеновых волокон.
  9. Промыть избыток пятно с водой и поместите слайды в 1% растворе уксусной кислоты в течение 1 мин, чтобы позволить дифференцирование иметь место для визуализации цвет слайд более тонким и прозрачным.
  10. Промыть слайды с водой и приступить к обезвоживанию срезах тканей. Стадии дегидратации заключаются в следующем:
  11. Погружают слайды последовательно в течение 10 секунд каждый раз, в следующем Concentrations этанола: 70%, 80%, 95% и 100%.
  12. Погрузите слайды в течение 30 секунд в 100% этаноле. Повторить 1 раз.
  13. Промыть слайды через 3 станции ксилола в течение 5 мин каждый, чтобы удалить этанол.
  14. Установите стеклянную крышку скольжения на образец с монтажными носителя (например, DPX mountant) и дайте высохнуть.
    Примечание: DPX представляет собой синтетический полимер, который быстро сохнет, сохраняет окраску и защищает срезы ткани.

6. Фиброз набранное на трихому окрашенных срезов Массона печени

  1. Наличие ветеринарного патологоанатома оценки тяжести фиброза в соответствии с фиброзе 25. Было бы оптимальным, если фиброзом скоринг осуществляется двумя или тремя патологи независимо друг от друга слепым методом. В таком случае, получить окончательный счет после обсуждения и группового обзора, чтобы разобраться в каких-либо различий в выигрыше.
Гол Описание
0 Нет фиброзом
1 Волокнистый расширение некоторых портальных областей, с или без коротких фиброзных септ
2 Волокнистый расширение большинства портальных областей, с или без коротких фиброзных септ
3 Волокнистый расширение большинства областей портала, случайный портал портала (PP) Шинная
4 Волокнистый расширение портала районов с отмеченной мостиковым (портал портал (ПП), а также портал центрального (ПК)
5 Отмеченный моста (PP и / или ПК) со случайными узелками (неполный цирроз)
6 Цирроз, вероятный или определенный

Таблица 1: Фиброз Score Используется для чтения разделов трихому Витраж печени Массона 25.

Результаты

DMN крысы, обработанные похудеть и стать менее энергичным с взъерошенными волосяного покрова. Существует значительная потеря среднего веса тела DMN крыс; первый обнаруживаемый после 2 недель лечения DMN, и эта разница остается после лечения с помощью DMN (рисунок 1a)

Обсуждение

Мы описали способ сделать животной модели фиброза печени и оценить выраженность фиброза печени. Важно обеспечить правильную дозу DMN и придерживаться графика еженедельных внутрибрюшинных инъекций. В ходе эксперимента, важно взвесить крыс и пересчитать дозу в начале каждой недели DMN ин...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

The authors acknowledge the funding support from the Ministry of Education, Singapore, grant number MOE2010-IF-1-025.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DimethylnitrosamineWako147-03781
FormalinSinopharm chemicalsF63257009
EthanolSigma64-17-5
XyleneFisher1330-20-7
Masson trichome stains
Aniline BlueElectron Microscopy Sciences#42755
Acid FuschinElectron Microscopy SciencesRT42685
Scarlet RedElectron Microscopy Sciences#26905
Phosphotungstic Acid HydrateALFA AESARALFA40116.4
Phosphomolybdic Acid HydrateSigma SG221856-25G
Weigert's Iron HematoxilynMerck1.15973.0002
DPX Mounting MediumMerckHX066873
Tissue processorLeicaLeica TP 1020
Embedding machineSakura Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System
MicrotomeLeicaLeica RM 2235
Vet Test AnalyzerIdexxVet Test 8008

Ссылки

  1. Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
  2. Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
  3. Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
  4. Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
  5. Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
  6. George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
  7. Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
  8. Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
  9. Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis?. Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
  10. Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
  11. Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
  12. Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
  13. Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), 166-186 (1985).
  14. Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
  15. Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
  16. Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
  17. Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
  18. George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
  19. Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
  20. Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
  21. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
  22. Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
  23. Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
  24. Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
  25. Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
  26. Sant'Anna, L. B., Sant'Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

112

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены