Die Dimethylnitrosamin Induced Liver Fibrosis Modell in der Ratte

Zusammenfassung

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Zusammenfassung

Vier bis sechs Wochen alte, männliche Wistar-Ratten wurden verwendet, Tiermodellen der Leberfibrose zu erzeugen. Das Verfahren erfordert vier Wochen nach der Verabreichung von 10 mg / kg Dimethylnitrosamin (DMN), intraperitoneal für drei aufeinanderfolgende Tage pro Woche. Die intraperitoneale Injektionen wurden im Abzug durchgeführt, wie DMN ein bekanntes hepatoxin und karzinogen ist. Das Modell hat mehrere Vorteile. Zum einen kann Leberveränderungen sequentiell oder in bestimmten Stadien von Interesse untersucht werden. Zweitens kann das Stadium der Lebererkrankung, die durch Messung von Serum-Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST) Enzyme überwacht werden. Drittens kann die Schwere von Leberschäden in verschiedenen Stadien durch Opferung von Tieren zu bestimmten Zeitpunkten, gefolgt von histologischen Untersuchung von Masson gefärbt Trichome Lebergewebe bestätigt. Nach vier Wochen DMN Dosierung ist die typische Fibrose-Score 5 bis 6 auf dem Ishak Maßstab. Das Modell kann konsequent reproduziert werden und hatweithin verwendet, um die Wirksamkeit von potentiellen anti-fibrotische Mittel zu bewerten.

Einleitung

DMN ist ein potenter leberspezifischen Toxin. Den Stoffwechsel, die Gewebeverteilung und die Fähigkeit , Verletzungen der Leber von Ratten zu verursachen wurde von Magee ¹ ist , und der Mechanismus der Hepatozyten - Schädigung und Zelltod durch Apoptose berichtet wurde von Pritchard und Butler ² beschrieben. Intermittierende Verabreichung dieser Verbindung wurde berichtet , dass Leberfibrose in Ratten , Hunden und ^3,4 induzieren.

Die Mechanismen und morphologischen Veränderungen der Leberfibrose wurden unter Verwendung dieses Modells ausführlich untersucht. In frühen Studien , die die Ratte mit 3-wöchigen Behandlung mit DMN produziert Nekrose zentrilobuläre hämorrhagischen gefolgt von micronodular Zirrhose ohne Steatose ^5. Es wurde , dass in der frühen Fibrose gezeigt, gebildet wurde , war das Kollagen mehr Kreuz mit Typ verknüpft III mehr im Vordergrund ist als Typ - I - ^6. Gemeinsam mit anderen Ursachen, DMN induzierte fibrotische Veränderungen wurden mit einem Anstieg in Kupffer-Zellen verbunden sind; Leber Makrophagen, die ich wohnenn die Sinusoide. Diese Zellen verwandeln sich in Myofibroblasten und produzieren große Mengen an extrazellulären Matrix , die das primäre Problem in Fibrose ist ^7.

Hinsichtlich zellulärer Signal, Nakamura et al. Gezeigt , dass TGF-β eine kritische Rolle bei der Progression der Leberfibrose ⁸ spielt. Sie verwendeten ein Adenovirus ein verkürztes Typ II TGF-β-Rezeptor exprimieren, spezifisch zu TGF-β-Signalisierung inhibieren. Leberfibrose bei diesen Ratten wurde spektakulär während DMN Behandlung angehalten, wenn zu den Kontrollgruppen verglichen. Andere Studien haben bestätigt , dass die Unterdrückung von TGF-β führt zur Linderung von Leberfibrose Entwicklung ^9,10. Das Modell wurde auch in einer globalen Gen Profilierungs Studie verwendet , um andere fibrosis Marker und Proteine ​​zu identifizieren , die als Arzneimittelziele für anti-fibrotische Therapie ¹¹ verwendet werden könnten.

Andere chemische Mittel verwendet Leberfibrose zu induzieren umfassen Thioacetamid (TAA) und cArbon Tetrachlorid (CCl _4). TAA wurde zuerst bei Ratten verwendet und später in Mäusen ^12. Die Vorteile dieses Modells sind: einfache chemische Verabreichung im Trinkwasser, die Reproduzierbarkeit des Modells mit charakteristischen micronodular Zirrhose und biochemische Veränderungen. Die Nachteile umfassen: die lange Zeitdauer von 3 Monaten bei Leberfibrose zu entwickeln, und der Mangel an Verständnis des molekularen Mechanismus zur Induktion von Leberfibrose. Wie für CCl _4, deren Verwendung aus den folgenden Gründen abgelehnt hat: es ist nicht die menschliche Lebererkrankung nachahmt, hat schädliche Auswirkungen auf die Ozonschicht verursacht Schmerzen und Leiden für die Tiere, ist sehr giftig für Menschen und erfordert zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen in der Handhabung und Entsorgung ^13,14.

Längerer Gallengangaufstau (durch einen chirurgischen Eingriff) als ein experimentelles Modell für die Leberzirrhose wurde zuerst von Kountouras et al. ^15. Diese Methode ist nicht-toxisch für Menschen und Tiere. However, die Zeit für Leberfibrose erforderlich variiert zu entwickeln. Eine Überprüfung von 30 Berichte von Marques et al. ^16, festgestellt , dass es von 7 Tage bis vier Wochen nach der Operation nahm für Leberfibrose zu entwickeln. Die pathologischen Veränderungen beschrieben imitieren die der menschlichen chronischen biliären Fibrose und das Modell für die Forscher interessiert in diesem Bereich besser geeignet wäre.

Zusammenfassend erzeugt die intermittierende Verabreichung einer konstanten Dosis von DMN in der Ratte über 4 Wochen Leberfibrose, die die menschliche Erkrankung imitiert. Dosierte Ratten zeigen fortschreitende Entwicklung von Leberschäden und parenchymal Fibrose ^4,17. Der Verlauf der Erkrankung und der Schwere kann über Blutproben oder Opfer von Tieren zu bestimmten Zeitpunkten überwacht werden und der Effekt ist sehr gut reproduzierbar ^18. Damit das Modell für potentielle anti-fibrotische Mittel ^10,19,20 weithin verwendet , um die Mechanismen der Leberfibrose und Leberzirrhose zu studieren sowie zu screenen ist.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Tierpflege und Verwendung Ausschuss der Hochschule für angewandte Wissenschaft, Temasek Polytechnic genehmigt.

1. Herstellung von DMN

1. Pipette 200 ul DMN (1 g / ml Stammlösung) und 19,8 ml PBS werden 10 mg / ml DMN Lösung für die Injektion herzustellen.
   Hinweis: DMN krebserregend ist. Verwenden Sie eine Abzugshaube, die DMN vorzubereiten und durchzuführen, um die Tier-Injektionen.

2. intraperitoneale Injektion von DMN

1. Verwenden männliche Wistar-Ratten mit einem durchschnittlichen Gewicht von 150-200 g. Akklimatisieren Ratten für 4 bis 7 Tage vor Beginn des Experiments.
2. Pflegen Ratten bei Raumtemperatur von 22 ± 1 ° C mit 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkel-Zyklen. Geben Sie Rattenfutter und Wasser ad libitum.
3. Messen Sie Lebensmittel und Wasserentnahmestellen täglich. Messen Sie das Körpergewicht pro Woche.
4. Berechnen der Menge an DMN für jede Ratte basierend auf einer Dosis von 10 mg / kg Körpergewicht. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel to das berechnete Volumen von DMN-Lösung in die Spritze zu ziehen.
5. Begrenze die Ratte für die intraperitoneale Injektion ^21.
6. Mit der Ratte richtig verhalten, führen die Nadel in den rechten unteren Quadranten des Abdomens, für die korrekte Platzierung der Nadel im Bauchraum zu überprüfen (sollte abgesaugt werden nichts) auf dem Kolben der Spritze zurückziehen und langsam DMN Lösung zu injizieren.
7. Wenn die Dosis von DMN verabreicht worden ist, die Nadel langsam zurückziehen und in die Kanülenabwurfbehälter entsorgt werden.
8. Führen Sie die intraperitoneale Injektionen von DMN für 3 aufeinanderfolgende Tage in der Woche für 4 Wochen. Verwalten Sie die Injektionen zur gleichen Zeit jeden Tag. Re-Berechnung der Dosierung basierend auf dem Körpergewicht zu Beginn jeder Woche von Injektionen.
9. Sammeln Sie Blut aus der Schwanzvene wöchentlich biochemische Parameter zu messen: Alanin - Aminotransferase (ALT) und Aspartat - Aminotransferase (AST) ^22.
10. Messen Serum ALT und AST Kommerzielle Vet mitTest-Chemie Analyzer.

3. Brutto Prüfung und Ernte der Leber

1. Euthanize die Ratten durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital bei einer Dosis von 100 mg / kg Körpergewicht. Sicherzustellen Tod durch den Mangel an Herzschlag überprüft.
2. Bereiten Sie sich für die post mortem und beurteilen den Zustand des Tieres , wie von Parkinson et al. ²³ Platz tote Ratten auf Sezieren Bord in Rückenlage mit dem Bauch nach oben.
3. Desinfizieren und die Haut mit 70% Ethanol befeuchten.
4. Mit einer Schere einschneiden der Haut die gesamte Länge des Ventralfläche vom Anus bis zum Kinn, und die Haut zu reflektieren. Mit der Schere einschneiden die Bauchdecke aus dem Anus zu den xiphoid Knorpel, um die Bauchorgane aussetzen.
5. Untersuchen Sie die Bauchorgane in situ für alle Anomalien zu überprüfen. Notieren Sie alle Änderungen in Farbe, Größe, die Lage der Organe und das Vorhandensein von Flüssigkeit in der Bauchhöhle. Untersuchendie Konsistenz von Organen und beachten Sie das Vorhandensein von Gerüchen.
6. Mit einer Schere und Pinzette, sezieren die gesamte Leber frei von seiner Bänder und Anhänge.
   1. Beginnen Sie an der Hilus, wo sie an der Membran angebracht ist, und arbeiten alle Leberlappen von Anhängen zu befreien. Schneiden Sie vorsichtig alle Bänder und Blutgefäße.
7. Übertragen Sie die Leber auf eine Petrischale und wiegen die Leber.
8. Mit einem Skalpell geschnitten 2 bis 5 mm dicke Abschnitte von Leberlappen. Aus Gründen der Einheitlichkeit nehmen immer Proben aus dem gleichen Leberlappen. Nehmen Sie einen Keil etwa 5 mm Durchmesser in der Dicke, von der rechten Seitenlappen ²⁴ etwa 1 cm vom Rand des lobe.Immediately Ort in 10% gepuffertem Formalin - Fixierung. Stellen Sie sicher, das Gewebe zu Formalin Volumen 1:10 oder mehr.
9. Ernte und sofort einfrieren Portionen (mit flüssigem Stickstoff) von Leberlappen an dieser Stelle erforderlich, wenn für andere Studien. Wie bei (3,8), Probe aus der gleichen Leberlappen für Konsistenz.

4. Verarbeitung, Einbetten und Schneiden der Leber

1. Fixieren die Leberproben in 10% gepuffertem Formalin für mindestens 24 Stunden.
2. Nach der Fixierung schneiden Sie die Leber, legen Sie in Kassetten und sie in den Korb des automatisierten Gewebeprozessor laden.
3. Platzieren Sie den Korb mit Kassetten in die erste Station, die 10% gepuffertem Formalin enthält. Achten Sie darauf, die Kassetten vollständig unter Wasser. Sie kann für bis zu 12 Stunden in dieser Kammer bleiben, bis der Zyklus beginnt.
4. Programmieren Sie die Gewebeprozessor die Kassetten für 1 Stunde jeden, durch aufeinanderfolgende Stationen mit den folgenden Lösungen zu drehen: Ethanol in einer Konzentration von 50%, 70%, 90%, 100% (2 Stationen), Xylol (2 Stationen) und flüssiges Paraffin ( 2 Stationen).
5. Übertragen Sie die Leberproben in das Wachsbad des Einbettungsstation. Sicherzustellen, daß die Einbettungsmaschine auf mindestens eine Stunde früher umgeschaltet wird.
6. Mit vorgewärmten Zange (65 ° C), nehmen Sie jede Kassette aus dem wax Bad und Platz auf der warmen Platte (65 ° C) des Einbettungs Maschine. Dispense ausreichende Menge an flüssigem Paraffin in den Edelstahlbasisform (vorgewärmt auf 65 ° C) bis halb voll. Übertragen Sie den Abschnitt der Leber aus der Kassette in die Form. Sicherstellen, dass die Probe mit der Schnittfläche platziert flach auf den Boden der Form (werden mikroskopisch untersucht).
7. Füllen Sie die Form vollständig mit flüssigem Paraffin, montieren Sie die leere Kassette auf und legen Sie die Form auf die 4 ° C-Platte des Einbettungs Maschine für mindestens 30 Minuten abkühlen lassen.
8. Überprüfen Sie, ob das Wachs abgekühlt und verfestigt wird, und entfernen Sie den Paraffinblock aus der Form. Der Block sollte sich leicht herausspringen und nicht kleben oder zu knacken. Wenn dies geschieht, schmelzen den Block und diesen Schritt wiederholen. Der Paraffinblock kann geschnitten werden, sobald es erstarrt. Blöcke können bei Raumtemperatur für viele Jahre gelagert werden.
9. Platzieren Sie den Paraffinblock in dem Mikrotom und Abschnitt bei 10 & mgr; m Dicke, bis die Wachsschichtausreichend für die eingebettete Lebergewebe sichtbar sein wird entfernt.
10. Ändern Sie die Einstellung auf dem Mikrotom bei 5 & mgr; m Dicke zu schneiden. Mit einer Pinzette, holen einen gut Abschnitt geschnitten, indem sie am Rand festhalten und sorgfältig den Abschnitt im Wasserbad schwimmen bei einer Temperatur von 40 ° C.
11. Sanft legen Sie einen sauberen Glasobjektträger unter dem schwimmenden Abschnitt und heben Sie sie auf die Oberfläche des Glasträger. Legen Sie die Folie auf eine Folie wärmer bei 37 ° C über Nacht.

5. Masson Trichromfärbung

1. Bevor die Flecken anwenden, behandeln Sie die Folien um das Wachs zu entfernen und das Gewebe rehydrieren wie folgt:
   1. Tauchen Sie die Abschnitte in Xylol für 5 min. Repeat 2x.
   2. Tauchen Sie die Abschnitte in 100% Ethanol für 3 min. Wiederholen 1x.
   3. Tauchen Sie die Abschnitte für jeweils 1 min in den folgenden Lösungen von Ethanol: 90%, 80% und 70%.
2. Spülen Sie die Folie unter fließendem Wasser zu entfernen alle vorhandenen Ethanol auf der Folie.
3. Tauchen Sie Dias in Eisen-Hämatoxylin für 10 Minuten in den Zellkern zu färben.
4. Spülen Sie die Folien mit Wasser, um den überschüssigen Farbstoff aus der Folie zu entfernen.
5. Tauchen Sie die Folien in Biebricher Scharlach-Säurefuchsin für 2 Minuten in das Zytoplasma zu färben.
6. Spülen Sie die Folien mit Wasser.
7. Legen Sie die Folien in Phosphorwolfram / Phosphomolybdänsäure-Lösung für 10 min, um die Aufnahme von Anilinblau zu fördern. Ändern Sie die Phosphorwolfram / Phosphomolybdänsäure Lösung nach 2 Runden Einsatz.
8. Legen Sie die Folien in Anilin-Blau-Lösung für 10 min die Kollagenfasern zu färben.
9. Spülen Sie das überschüssige Fleck mit Wasser und legen Sie die Folien in 1% ige Lösung Essigsäure für 1 min Differenzierung stattfinden kann die Farbe des Schiebers mehr zart und transparent zu machen.
10. Spülen Sie die Folien mit Wasser und füllen Sie die Gewebeschnitte zu entwässern. Die Dehydratisierung Schritte sind wie folgt:
11. Eintauchen der Objektträger nacheinander 10 Sekunden lang jedes Mal in der folgenden concentrations Ethanol: 70%, 80%, 95% und 100%.
12. Eintauchen der Objektträger für 30 Sekunden in 100% igem Ethanol. Wiederholen 1x.
13. Spülen Sie die Folien durch 3 Stationen Xylol für jeweils 5 min Ethanol zu entfernen.
14. Montieren Sie einen Deckglas auf die Probe mit Montage Medien (zB DPX mountant) und trocknen lassen.
    Hinweis: DPX ein synthetisches Harz ist, das schnell trocknet, bewahrt Fleck und schützt den Gewebeschnitt.

6. Fibrosis Punkten auf Massons Trichom Gefärbte Schnitte von Leber

1. Haben Sie einen Veterinär - Pathologe beurteilen die Schwere der Fibrose nach der Fibrose ²⁵ punkten. Es wäre optimal, wenn die Fibrose scoring durch zwei oder drei unabhängig Pathologen in verblindet Weise durchgeführt wird. In einem solchen Szenario eine Endnote nach Diskussion und Gruppen Bewertung zu sortieren, alle Unterschiede in Scoring erhalten.

Ergebnis	Beschreibung
0	Keine Fibrose
1	Faserige Expansion einiger Portalbereiche mit oder ohne kurze Bindegewebssepten
2	Faserige Expansion der meisten Portalbereiche mit oder ohne kurze Bindegewebssepten
3	Faserige Expansion der meisten Portalbereiche, gelegentliche Portal zum Portal (PP) überbrück
4	Faserige Ausbau der Portalbereiche mit markierten Bridging (Portal zu Portal (PP) sowie Portal zentrale (PC)
5	So bezeichnete Bridging (PP und / oder PC) mit gelegentlichen Knötchen (unvollständige Zirrhose)
6	Zirrhose, wahrscheinlich oder sicher

Tabelle 1: Fibrose - Score ²⁵ verwendet die Massons Trichom Stained Leberschnitten für das Lesen.

Ergebnisse

DMN behandelten Ratten, Gewicht zu verlieren und weniger kräftig mit gekräuselten Haarmantel. Es gibt einen signifikanten Verlust der durchschnittlichen Körpergewicht von DMN behandelten Ratten; erste nachweisbare nach 2 Wochen der Behandlung DMN, und dieser Unterschied ist noch durch Wochen 3 und 4 nach DMN Behandlung (Abbildung 1a). Als die Ratten DMN über aufeinanderfolgende Wochen erhalten, Schädigung der Leber bewirkt, dass es kleiner wird. Die Leber-Index; Das...

Diskussion

Wir haben ein Verfahren beschrieben, ein Tiermodell der Leberfibrose zu machen und die Schwere der Leberfibrose zu beurteilen. Es ist wichtig, die richtige Dosis von DMN und sich an den Zeitplan für die wöchentliche intraperitoneale Injektionen zu liefern. Als das Experiment fortschreitet, ist es entscheidend, die Ratten und neu zu berechnen, um die Dosis zu Beginn jeder Woche der DMN-Injektionen zu wiegen. Beachten Sie, dass DMN giftig ist, und muss in der Abzugsschrank behandelt werden. Wir führen die intraperitone...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethylnitrosamine	Wako	147-03781
Formalin	Sinopharm chemicals	F63257009
Ethanol	Sigma	64-17-5
Xylene	Fisher	1330-20-7
Masson trichome stains
Aniline Blue	Electron Microscopy Sciences	#42755
Acid Fuschin	Electron Microscopy Sciences	RT42685
Scarlet Red	Electron Microscopy Sciences	#26905
Phosphotungstic Acid Hydrate	ALFA AESAR	ALFA40116.4
Phosphomolybdic Acid Hydrate	Sigma SG	221856-25G
Weigert's Iron Hematoxilyn	Merck	1.15973.0002
DPX Mounting Medium	Merck	HX066873
Tissue processor	Leica	Leica TP 1020
Embedding machine	Sakura	Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System
Microtome	Leica	Leica RM 2235
Vet Test Analyzer	Idexx	Vet Test 8008