RNA הפרעה מבוססת חקירת הפונקציה של חלבון מחממי הלם 27 במהלך הקרנית אפיתל לריפוי פצעים

Summary

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

Abstract

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Introduction

תאי אפיתל קרניים (CECs) הם לשפוך ברציפות לתוך שכבת דמעות, בזמן שהם מוחלפים בו זמנית על ידי תאים מן לימבוס ושכבות הבזליים אפיתל קרניים. ¹ לחצים חיצוניים שונים יכולים לגרום אפופטוזיס קלוף של CECs. ² חלבוני הלם החום (HSPs) שמורים מאוד ניתן לחלק לשתי משפחות לפי גודל מולקולרי. ³ מש' HSP הגדולה כולל Hsp90, HSP70, ו HSP60, והמשפחה הקטנה כולל HSP27. ⁴ זירחון של HSP27 ידוע לשחק תפקיד חשוב בהישרדות תא והוא נחוץ לצורך נדידת תאים עקב התפקיד של חלבון זה שיפוץ יקטין. ^5-7 לכן, ניסינו לבחון את התפקיד הפוטנציאלי של זירחון HSP27 גירת CEC ו אפופטוזיס מודל במבחנה של ריפוי פצע אפיתל.

התערבות RNA (RNAi) באף אחת קטנה או קצר RNAs התערבות (siRNA) יש geעניין nerated בשתי ביולוגיה בסיסית ויישומים, כפי שהוא עשוי לאפשר את הביטוי של כל גן של עניין להיות דפק למטה. ⁸ בזאת, השתמשנו siRNA ספציפי-HSP27 להעריך את התרומה של HSP27 לריפוי אפופטוזיס פצע CEC. שיטות RNAi מסורתית עבור הגן לדפוק למטה בתאים להשתמש דופלקסים RNA סינתטיים, לרבות שני oligonucleotides 21-mer ללא שינוי, אשר ניתן לקבץ ליצור siRNAs. RNAi siRNA כי השתמשנו במחקר הנוכחי הוא שיטה פשוטה ויעילה מאוד transfect תאים, מגיב זה עובד עם שורות תאים הנציחו שונות. במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים את השיטות בהן השתמשו בניתוח זה, כולל assay הפצע כיוונית הנגרמת מאפס, סופג המערבי, assay transfection siRNA, assay immunofluorescence, cytometry הזרימה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

שורת תאים 1.

1. תרבות 10 ⁶ תאים אפיתל הקרנית אדם הנציח טלומרז (HCECs) בצלחת 6-היטב (צפיפות: 1039.9 תא / מ"מ ²⁾ בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO ₂ באמצעות מדיום הגידול האפיתל הסימפונות (BEGM) עד הם מגיעים למפגש 95%.

2. ניתוח כתם המערבי לאחר יצירת פצעים Scratch אפיתל

1. Streak קצה פיפטה 200 μl סטרילי על פני באר HCECs תרבותי ומחוברות ארבע פעמים לכל צלחת בארון בטיחות ביולוגית (Class II, A2 סוג) דגירה HCECs בנפרד 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO ₂ עבור 1, 5, 10, 30, 60, ו -120 דקות.
2. השתמש צלחת אחת 6-היטב מזה שישה מדגמים שונים בהתאם לזמן הדגירה לאחר פציעת אפיתל קרנית.
3. לשטוף monolayers HCEC נפצע שלוש פעמים עם 1x PBS ולאחר מכן להוסיף 2.0 מ"ל BEGM היטב כל אחד.
4. ניתוק HCECs באמצעות 2מ"ל 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) לכל היטב במשך 5 דקות, צנטריפוגות ב 900 XG במשך 5 דקות בתוך שפופרת 15 מ"ל, ואת לשאוב טריפסין-EDTA בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
5. להשעות HCECs עם 1 מ"ל 1x PBS ולהעבירם צינור 1.5 מ"ל.
6. HCECs צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 15 שניות ו PBS 1x לשאוב בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
7. Resuspend HCECs ב 100 חיץ μl קרים כקרח תמוגה (10 מ"מ טריס, 10 mM NaCl, 2 מ"מ EDTA, 25 מ"מ NaF, 2 מ"מ Na ₃ VO _4, 1 מ"מ פלואוריד phenylmethanesulfonyl [PMSF], מעכבי פרוטאז [1 מיקרומטר pepstatin A, 1 מיקרומטר leupeptin, ו -0.1 מיקרומטר aprotinin] ו -0.5% Triton X-100 [pH 7]) ומערבבים אותם היטב.
8. דגירה תאים עבור 30 דקות על הקרח כדי לגרום תמוגה התא.
9. lysates צנטריפוגה ב 4 ° C. ב XG 10,000 במשך 15 דקות, ולאחר מכן להעביר supernatants 1.5 מ"ל צינורות טרי (90 aliquots μl) ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס.
10. לקבוע ריכוזי חלבון סך של lysates התא באמצעות יחסי ציבור ברדפורדassay otein. ⁹
11. חלבונים הכולל תא טען 30 מיקרוגרם לג'ל acrylamide 10% או 12% עבור ג'ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide dodecyl נתרן (SDS-PAGE), ולאחר מכן electrophoretically העברת מופרדים להקות חלבון מסנני nitrocellulose עם זרם 200 מיליאמפר עבור שעה 1 ב 4 ° C להשתמש מבחני כתם מערביים.
12. ממברנות מסנן nitrocellulose בלוק עם 5% חלב רזה מלוחים טריס שנאגרו עם Tween 20 (TBST) במשך שעה 1, להוסיף נוגדנים polyclonal ארנב העיקרי נגד HSP27 הלא פוספורילציה (1: 1,000 דילול) או נוגדנים polyclonal ארנב העיקרי נגד HSP27 פוספורילציה (1 דילול 1,000) ב אלבומין 5% שור (BSA), ו דגירה ממברנות לילה ב 4 ° C על שייקר:.
13. זיהוי להקות immunoreactive באמצעות נוגדנים נגד ארנב peroxidase מצומדות חזרת עיזים (1: 10,000 דילול) ב 5% BSA לאחר הכביסה במשך 10 דקות 3 פעמים עם TBST.
14. דגירה הממברנה של ריאגנטים לומינול המערבי סופג (6-7 מ 'l לכל 10 ס"מ × קרום 5 ס"מ) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
15. הסר את הקרום מפתרון מגיב, להסיר נוזל עודף עם מגבה סופגת, ומניח מגן יריעת פלסטיק.
16. עבודה בחדר חשוך עם אור בטוח, להציב קרום מכוסה קלטת סרט עם צד חלבון הפונה כלפי מעלה.
17. מניחים הסרט X-ray על גבי הממברנה ולחשוף דקות 1.

3. siRNA Transfection Assay ¹⁰

1. HCECs תרבות ב 5 × 10 ⁵ תאים / גם בצלחת 6-היטב בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO ₂ באמצעות BEGM עד שהם מגיעים למפגש 95%.
2. לדלל את מגיב transfection (2.5 או 7.5 μl) עם 100 μl בינוני סרום מופחת עבור transfection (גורם לדילול היה 41 או 14.3) ו לפזר את HSP27 הספציפי מקושקש השליטה siRNA ב 100 μl בינוני סרום מופחת ליצור 10 או 50 ננומטר של HSP27 ספציפי מקושקש siRNA שליטה.
3. מערבבים 100 μ; פתרון siRNA l עם מגיב transfection 100 μl מדולל (1: 1 יחס) דגירה את התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. מוסיפים את מתחמי השומנים-siRNA לתאים. אז אחרי 4 תקשורת hr שינוי להשלים BEGM דגירת התאים למשך 2 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
5. לנתח תאי transfected על ידי מערבי סופג, כמתואר מ בסעיפים 4.1 ל -4.7 ילדים.

4. Assay כתם המערבי עבור תאים-טרנספקציה siRNA ¹¹

1. חלץ HSP27 ספציפיים מקושקשות HCECs שליטה transfected-siRNA בתוך ארון בטיחות ביולוגית באמצעות 100 חיץ תמוגה μl קרים כקרח (10 טריס מ"מ, 10 מ"מ NaCl, 2 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 25 מ"מ NaF, 2 מ"מ Na ₃ VO _4, 1 מ"מ פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF), מעכבי פרוטאז, ו -0.5% Triton X-100, pH 7).
2. דגירה תאים עבור 30 דקות על הקרח כדי לגרום תמוגה התא.
3. lysates גלולה ב XG 10,000 במשך 15 דקות ולאחר מכן להעביר supernatants אל גיגית 1.5 מיליליטר טריes (90 μl aliquots) ולאחסן אותם ב -80 ° C.
4. לקבוע ריכוזי חלבון של התא lysates באמצעות השיטה ברדפורד. ⁹
5. דגימות טענו עם כמויות שווות של חלבוני תא הכוללים על ג'ל acrylamide 10% או 12%, לייחד את הג'ל על SDS-PAGE, ו electrophoretically להעביר את להקות חלבון המופרדות כדי מסנני nitrocellulose עם זרם 200 מיליאמפר עבור שעה 1 ב 4 ° C עד להשתמש מבחני כתם מערביים.
6. ממברנות nitrocellulose מסנן בלוק עם 5% חלב רזה מלוחים טריס שנאגרו עם Tween 20 (TBST) במשך שעה 1, להוסיף נוגדנים ראשוניים נגד HSP27 פוספורילציה הלא פוספורילציה (1: 1,000 דילול), Akt פוספורילציה (1: 1,000 דילול) הלא פוספורילציה Akt (1: 1,000 דילול, לשמש כסמן הישרדות התא), Bcl-2 הקשורים חלבון X (1: 1,000 דילול, משמש חלבון פרו-אפופטוטיים), ו dehydrogenase 3-פוספט glyceraldehyde (GAPDH; 1 : דילול 200, משמש כביקורת טעינה) ב אלבומין 5% שור (BSA), ודגירת ממברנות הלילה ב 4 ° C על שייקר.
7. זיהוי להקות immunoreactive באמצעות נוגדנים נגד ארנב peroxidase מצומדות חזרת עיזים (1: 10,000 דילול) BSA 5% לאחר הכביסה 3 פעמים עם TBST, 10 דקות כל אחד לשטוף.
8. דגירה הממברנה של ריאגנטים לומינול המערבי סופג (6-7 מ"ל לכל 10 ס"מ × 5 ס"מ קרום) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
9. הסר את הקרום מפתרון מגיב, להסיר נוזל עודף עם מגבה סופגת, ומניח מגן יריעת פלסטיק.
10. עבודה בחדר חשוך עם אור בטוח, מניח את הקרום המכוסה קלטת סרט עם צד החלבון הפונה כלפי מעלה.
11. מניח סרט X-ray על גבי הקרום ולחשוף דקות 1.

5. נגרמת Scratch ערכת Assay פציעה כיוונית של נדידת תאי ¹²

1. בארון בטיחות ביולוגית, להפוך פצע ידי גרירת קצה פיפטה סטרילית על פני באר תרבויות ומחוברות שלHSP27 ספציפי-טרנספקציה siRNA או HCECs המלא המקושקש טרנספקציה-siRNA.
2. מיד לאחר פציעה, לשטוף את התאים פעמיים עם בופר פוספט 1x (PBS) ולשמור אותם בתרבויות BEGM באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם אווירה 5% CO ₂ למשך 24 שעות לאחר פציעה.
3. לצלם תמונות HCEC באמצעות מיקרוסקופ זקוף בהגדלה 100X 24 שעות לאחר ופצע ולבצע משטחת רקע באמצעות מסנן פקודת תוכנת ניתוח תמונה.
4. באמצעות פקודת המדידות בוחרות, להגדיר השטח של עניין (AOI) עם אותה הצורה מצולע בגודל שיכול לכסות בניצב מקצה לקצה של פצע ראשוני, ולקבוע שלושה AOI שונים באזור הפצוע של כל דגימה.
5. באופן אוטומטי לספור את המספר הסלולרי בכל תחום באמצעות אפשרויות תפריט מדוד רוזן / גודל.

6. ניתוח cytometry זרימה של אפופטוזיס

1. תרבות siRNA-טרנספקציה HSP27 ספציפי ובקרה שלאירנ"א-טרנספקציה HCECs המכילים כל 10 ננומטר siRNA בריכוז של 5 × 10 ⁵ תאים / גם ב 6 צלחות היטב עד התאים מגיעים 95 מפגש% בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO ₂ ב BEGM.
2. ניתוק HCECs באמצעות 2 מ"ל 0.25% טריפסין-EDTA לכל טוב במשך 5 דקות, צנטריפוגות ב 900 XG במשך 5 דקות בתוך שפופרת 15 מ"ל, ואת לשאוב טריפסין-EDTA בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
3. שטפו תאים פעמיים עם קר PBS ולאחר מכן resuspend התאים 1x חיץ מחייב (0.1 M HEPES / NaOH [pH 7.4], 1.4 M NaCl, ו -25 מ"מ CaCl ₂₎ בריכוז של 10 ⁶ תאים / מ"ל.
4. העברת 100 μl ההשעיה תא (1 x 10 ⁵ תאים) לתוך צינור תרבות 5 מ"ל.
5. הוסף 5 μl והעמסת מצומדות isothiocyanate V Annexin ו יודיד propidium 5 μl.
6. בעדינות מערבולת התאים דגירה אותם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
7. הוסף 200 μl של חיץ מחייב 1x על צינור אחד ולנתח את התאים על ידי ג זרימהytometer בתוך שעה 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הביטוי של HSP27 פוספורילציה גדל באופן משמעותי ב 5, 10, ו -30 דקות לאחר שריטה ופצע לעומת HCECs unwounded ^13. ניתוח כתם המערבי גילה כי הביטוי של פוספורילציה HSP27 ו פוספורילציה Akt הופחתו הן באופן משמעותי, ואילו הביטוי של Bax הוגדל משמעותית HCECs-טרנספקציה siRNA ספציפיים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

In this present study, we evaluated the potential role of HSP27 in corneal epithelial wounding using in vitro approaches. The critical steps involved siRNA transfection for HSP27 knock-down to observe the function of HSP27 in cells subjected to stress. Notably, a role for HSP27 was revealed by these experiments in epithelial cell migration and apoptosis during corneal epithelial wound healing. Unlike previous studies¹⁰ that used rat HSP27-specific siRNA to transfect vascular smooth muscle cells, we us...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological safety cabinet	CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republic of Korea	CHC-777A2-06	Class II, Type A2
Stealth RNAi™ siRNA	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Bronchial epithelium growth medium
Protease inhibitor	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	P8340 ,P7626	1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin
Bradford protein assay	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	#500-0001	Bradford protein assay
Nitrocellulose filters	Amersham, Little Chalfont, UK	RPN3032D	Western blotting membrane
Non-phosphorylated HSP27	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351	1:1,000 dilution (Total HSP27)
Phosphorylated HSP27 (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594	1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Transfection reagent
Phosphorylated Akt (Ser473)	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4060	1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)
Non-phosphorylated Akt	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4061	1:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4062	1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	No. 4063	1:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	1:10,000 dilution
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	reduced serum medium for transfection
Image analysis software	Olympus, Inc., Tokyo, Japan	Image-Pro Plus 5.0
Skimed milk powder	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0497
Sodium Chloride	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Six well culture plate	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	35.00 mm diameter / well
24-well culuture dish	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Orbital shaker	N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea	NB1015
Bovine serum albumin	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ		Flow cytometry
X-Ray Film	Kodak, Rochester, NY		Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen
western blotting luminol reagent	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2048
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547