Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi

Özet

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

Özet

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Giriş

Aynı anda limbusta ve kornea epitel bazal tabakadan hücreler tarafından değiştirilir ise kornea epitel hücreleri (kurulları) sürekli gözyaşı içine dökülürler. ¹ Çeşitli dışsal stres CDKÖ apoptozunu ve deskuamasyon uyarabilir. ² ısı şok proteinleri (HSPler) yüksek ölçüde korunmuş ve molekül büyüklüğüne göre iki aile ayrılabilir. ³ büyük HSP ailesi HSP90, HSP70 ve HSP60, ve daha küçük bir aile Hsp27 içerir içerir. ^4. Hsp27 fosforilasyon hücre canlılığı ile önemli bir rol oynadığı bilinmektedir çünkü aktin yeniden bu proteinin rolü hücre göçü için gereklidir. ^5-7 Bu nedenle, epitel yara iyileşmesi bir in vitro modelinde MSK göç ve apoptoz Hsp27 fosforilasyonunun potansiyel rolünü test etmek için çalışmıştır.

RNA enterferans (RNAi), küçük veya kısa müdahale RNA'lar kullanılarak (siRNA) ge sahiptirpotansiyel verir gibi hem temel ve uygulamalı biyoloji nerated ilgi, ilgi herhangi bir genin ifadesi çaldı aşağı olmak. ⁸ Burada, MSK yara iyileşmesi ve apoptoz ile Hsp27 katkısını değerlendirmek için Hsp27 özel siRNA kullanılır. hücrelerinde gen knock-down Geleneksel RNAi yöntemler siRNA'lar oluşturmak için monte edilebilir, iki modifiye edilmemiş 21-mer oligonükleotitlerin de dahil olmak üzere, sentetik RNA çiftleri kullanmak. Bu, bu çalışmada kullanılan RNAi siRNA hücreleri transfekte etmek üzere, basit ve oldukça etkili bir yöntem olup, bu reaktif, çeşitli ölümsüz hücre çizgileri ile birlikte çalışır. Bu bu çalışmada, bir çizik kaynaklı yönlü yara deneyi, batı blot, siRNA transfeksiyon deneyinde, immunfloresans yöntemi de dahil olmak üzere, bu analiz için kullanılan yöntemler, göstermek ve akım sitometri.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Hücre Hattı

1. 6-çukurlu plaka içinde kültürü 10 ⁶ telomeraz-ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri (HCECs) bronşiyal epitel büyüme ortamı (Begm) kullanılarak% 5 _CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde (yoğunluk 1039,9 hücre / ^mm2 kadar) onlar% 95 izdiham ulaşmak.

2. Western Blot Analizi Epitel Scratch yaralar oluşturma sonra

1. Streak steril 200 ul pipet konfluent kültürlü HCECs bir kuyunun yüzeyi boyunca ucu biyolojik güvenlik kabini çanak başına dört kez (Sınıf II, Tip A2) ve% 5 CO ₂ atmosfer ile 37 ° C inkübatör ayrı ayrı HCECs inkübe 1, 5, 10, 30, 60 ve 120 dakika karıştırıldı.
2. korneal epitelyal yaralama sonra inkübasyon süresine göre altı farklı numuneler için, bir 6-yuvalı plaka kullanınız.
3. 1X PBS ile yaralandı HCEC mono tabakalar üç kez yıkayın ve daha sonra her kuyuya 2.0 mi Begm ekleyin.
4. 2 kullanılarak HCECs ayırınmi,% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik 5 dakika boyunca oyuk başına asit (EDTA), 15 ml'lik bir tüp içinde 5 dakika için 900 x g'de santrifüj ve aspire tripsin-EDTA 1 ml pipet kullanarak.
5. PBS 1X 1 ml HCECs askıya alma ve bir 1.5 ml'lik tübe transfer edin.
6. 15 sn için 10,000 x g'de santrifüjleyin HCECs ve aspirat 1X PBS, 1 ml pipet kullanarak.
7. 100 ul buz gibi soğuk lisis tamponunda yeniden süspanse HCECs (10 mM Tris, 10 mM NaCI, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM fenilmetansülfonil florit [PMSF], proteaz inhibitörleri [pepstatin A 1 uM, 1 uM löpeptin ve 0.1 uM aprotinin] ve% 0.5 Triton X-100 [pH 7]) ve iyice karıştırın.
8. Hücre lizizi uyarılması için, buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe hücreleri.
9. Santrifüj 15 dakika boyunca 10,000 x g'de 4 ° C'de lizatları, ve sonra taze 1.5 ml tüpler (90 ul tümbölenler) süpernatantlar transferi ve -80 ° C'de saklayın.
10. Bradford pr kullanılarak hücre lizatlarının toplam protein konsantrasyonunu belirlemekotein deneyi. ⁹
11. daha sonra, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve bir% 10 ya da% 12 akrilamid jel yükle 30 ug toplam hücre proteinleri elektroforetik transferi 4 ° 'de 1 saat süre ile, bir 200 mA akım ile nitroselüloz filtreler protein bantları ayrıldı Cı Western blot deneylerinde kullanım.
12. % 5 blok nitroselüloz filtre zarları fosforilatlanmamış Hsp27 karşı birincil tavşan poliklonal antikor ekleyin, 1 saat süre ile, Tween 20 (TBST) Tris-tamponlu tuzlu su içinde yağsız süt (1: 1000 seyrelti) veya fosforile Hsp27 karşı birincil tavşan poliklonal antikoru (1 : 1,000% 5 bovin serum albümini seyreltme) (BSA) ve bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe membranlar.
13. TBST ile 10 dakika süre ile 3 kez yıkandıktan sonra,% 5 BSA (10,000 seyreltme 1) yabanturpu peroksidaz-konjuge keçi anti-tavşan antikorları kullanılarak immünoreaktif bantlar algılar.
14. Western lekeleme luminol reaktifler membran inkübe (6-7 mOda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5 cm'lik membran x 10 cm) başına l.
15. reaktif çözeltisinden membran kaldırmak, bir plastik levha koruyucusu aşırı emici bir havlu ile sıvı ve yer çıkarın.
16. güvenli bir ışık ile karanlık bir odada çalışan protein tarafı yukarı bakacak şekilde bir film kaseti kaplı membran yerleştirin.
17. zarın üzerine X-ışını filmi yerleştirin ve 1 dakika boyunca maruz kalmaktadır.

3. siRNA Transfeksiyon Deneyi ¹⁰

1. Kültür 5 x 10 ⁵ hücre HCECs / oyuk bunlar% 95 izdiham ulaşana kadar Begm kullanılarak% 5 _CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu plaka.
2. 10 ya da 50 nM oluşturmak için azaltılmış serum orta transfeksiyon (seyreltme faktörü 41 veya 14.3 idi) için 100 ul azaltılmış serum orta transfeksiyon ayıracı (2.5 veya 7.5 ul) sulandırmak ve Hsp27 özel çözülür ve 100 ul kontrol siRNA şifreli Hsp27 özgü ve kontrol siRNA şifreli.
3. 100 mikron Mix100 ul seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile l siRNA çözeltisi (1: 1 oranında) ve oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe karışımı.
4. hücrelere siRNA lipid kompleksleri ekleyin. Daha sonra 4 saat değiştirme ortamı sonra 37 ° C'de 2 gün boyunca hücrelerle Begm doldurup kuluçkalanması.
5. 4.7 bölümler 4.1 altında tarif edildiği gibi, western blotting ile transfekte edilmiş hücrelerin analiz.

SiRNA transfekte hücreleri ¹¹ 4. Batı Benek tahlili

1. Hsp27 özgü ekstrakte ve 100 ul buz gibi soğuk lisis tamponu (10 mM Tris, 10 mM NaCI, 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO kullanılarak bir biyolojik güvenlik kabini kontrol siRNA transfekte HCECs karıştırılmış _4, 1 mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), proteaz inhibitörleri, ve% 0.5 Triton X-100, pH 7).
2. Hücre lizizi uyarılması için, buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe hücreleri.
3. 10,000 x g'de Pelet lizatları, 15 dakika ve daha sonra da yeni bir 1.5 ml'lik küvet süpernatantlar aktarmakes (90 ul alikotları) ve -80 ° C'de saklayın.
4. Bradford protein deneyi kullanılarak hücre lizatlarının protein konsantrasyonlarını belirlemek. ⁹
5. % 10 ya da% 12 akrilamid jel üzerinde toplam hücre Proteinlerin eşit miktarları ile Numuneleri, SDS-PAGE jelin maruz ve elektroforetik olarak 4 ° C 'de, 1 saat boyunca 200 mA akım ile nitroselüloz filtrelerine Ayrılan protein bantları aktarmak Western blot deneylerinde kullanımı.
6. : (1000 sulandırma 1): (1000 sulandırma 1), fosforilatlanmış Akt% 5 blok nitroselüloz filtre zarları fosforillenmiş ve fosforilatlanmamış Hsp27 karşı birincil antikor ekleyin, 1 saat süre ile, Tween 20 (TBST) Tris-tamponlu tuzlu su içinde yağsız süt Akt fosforilatlanmamış (1: 1000 seyreltme, bir hücrelerin hayatta kalma belirteci olarak kullanılır) Bcl-2 ile ilişkili X proteini (1: 1000 seyreltme, bir pro-apoptotik protein olarak kullanılır) ve gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH 1; :% 5 büyükbaş hayvan serumu albümini bir yükleme kontrolü olarak kullanılan 200 seyreltme) (BSA) vebir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe membranlar.
7. yıkamadan sonra TBST ile 3 kez 10 dakika her yıkama% 5 BSA (10,000 seyreltme 1) yabanturpu peroksidaz-konjuge keçi anti-tavşan antikorları kullanılarak immünoreaktif bantlar algılar.
8. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca Western lekeleme luminol reaktifler membran (6-7 mi başına 10 cm x 5 cm zarı) inkübe edin.
9. reaktif çözeltisinden membran kaldırmak, bir plastik levha koruyucusu aşırı emici bir havlu ile sıvı ve yer çıkarın.
10. güvenli bir ışık ile karanlık bir odada çalışan protein tarafı yukarı bakacak şekilde bir film kaseti kaplı membran yerleştirin.
11. zarın üzerine X-ışını filmi yerleştirin ve 1 dakika boyunca maruz kalmaktadır.

5. Scratch kaynaklı Hücre Göç ¹² Yönlü Yaralama Deneyi Değerlendirilmesi

1. Bir biyolojik güvenlik kabini, bir birleşik kültürlerin bir kuyu yüzeyi boyunca steril bir pipet sürükleyerek bir yara yapmakHsp27 özgü siRNA transfekte veya karıştırılmış kontrol siRNA transfekte HCECs.
2. Hemen yaralama sonra, yaralama sonrası 24 saat boyunca bir% 5 _CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde Begm kültürlerinde bunları 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkama hücreleri ve bakımı.
3. 24 saat yaralama sonra 100X büyütmede dik bir mikroskop kullanılarak HCEC görüntüleri fotoğraflamak ve arka plan Filtre kullanarak düzleştirme gerçekleştirmek görüntü analiz yazılımı komut.
4. Seç Ölçümler komutunu kullanarak, ilk yara uçtan uca dik kapağı aynı büyüklükteki çokgen şekli ile İlgi (AOI) ait Alan tanımlamak ve her numunenin yaralı alanda üç farklı AOI belirler.
5. Otomatik olarak Kont / Boyut Ölçüm menü seçeneklerini kullanarak her alanda hücre sayısını.

Apoptoz 6. Akım Sitometri Analizi

1. Kültür Hsp27 özgü siRNA transfekte edilmiş ve kontrol sistemHücreler Begm bir% 5 _CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde% 95 kaynaşmaya eriştikten kadar / oyuk 6 oyuklu plakalar içerisinde 5 x 10 ⁵ hücre konsantrasyonunda her biri 10 nM siRNA içeren HCECs IRNA-transfekte edildi.
2. 1 ml pipet kullanılarak 5, 15 ml tüp içinde dakika ve aspirat tripsin-EDTA 900 x g'de 5 dakika santrifüj için oyuk başına 2 mi% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak HCECs ayırın.
3. Soğuk PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve daha sonra 10 ⁶ hücre / ml'lik bir konsantrasyonda bir tampon (0.1 M HEPES / NaOH [pH 7.4], 1.4 M NaCl, ve 25 mM _CaCI2) bağlanma 1x hücreleri tekrar süspansiyon.
4. 5 ml'lik bir kültürden tüp içine hücre süspansiyonu (1 x 10 ⁵ hücre) ul transfer 100.
5. 5 ul flöresin izotiyosiyanat-konjuge Annexin V ve 5 ul propidyum iyodür ekleyin.
6. Yavaşça hücreleri girdap ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe.
7. bir akış c hücreleri her tüpe 1x bağlayıcı tampon 200 ul ekleyin ve analiz1 saat içinde ytometer.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Fosforile Hsp27 ifadesi anlamlı 5, 10 arttı ve sıfırdan 30 dakika sonra yaralı olmayan HCECs ¹³ ile karşılaştırıldığında yaralama. Western blot analizi, Bax ekspresyonu anlamlı Hsp27 özgü siRNA transfekte HCECs (Şekil 1A-D) 'de artmıştır, oysa fosforile Hsp27 ve fosforile Akt ekspresyon hem de önemli ölçüde azalır olduğunu göstermiştir. Fosforile Hsp27 sentezleme% 30 ve 40 10 nM ve% Hsp27 özgü 50 nM siRNA transfekte edilmiş h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

In this present study, we evaluated the potential role of HSP27 in corneal epithelial wounding using in vitro approaches. The critical steps involved siRNA transfection for HSP27 knock-down to observe the function of HSP27 in cells subjected to stress. Notably, a role for HSP27 was revealed by these experiments in epithelial cell migration and apoptosis during corneal epithelial wound healing. Unlike previous studies¹⁰ that used rat HSP27-specific siRNA to transfect vascular smooth muscle cells, we us...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological safety cabinet	CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republic of Korea	CHC-777A2-06	Class II, Type A2
Stealth RNAi™ siRNA	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Bronchial epithelium growth medium
Protease inhibitor	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	P8340 ,P7626	1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin
Bradford protein assay	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	#500-0001	Bradford protein assay
Nitrocellulose filters	Amersham, Little Chalfont, UK	RPN3032D	Western blotting membrane
Non-phosphorylated HSP27	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351	1:1,000 dilution (Total HSP27)
Phosphorylated HSP27 (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594	1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Transfection reagent
Phosphorylated Akt (Ser473)	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4060	1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)
Non-phosphorylated Akt	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4061	1:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4062	1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	No. 4063	1:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	1:10,000 dilution
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	reduced serum medium for transfection
Image analysis software	Olympus, Inc., Tokyo, Japan	Image-Pro Plus 5.0
Skimed milk powder	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0497
Sodium Chloride	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Six well culture plate	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	35.00 mm diameter / well
24-well culuture dish	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Orbital shaker	N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea	NB1015
Bovine serum albumin	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ		Flow cytometry
X-Ray Film	Kodak, Rochester, NY		Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen
western blotting luminol reagent	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2048
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547