RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung

Zusammenfassung

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

Zusammenfassung

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Einleitung

Hornhautepithelzellen (LME) werden kontinuierlich in Tränenfilm vergossen, während sie von Zellen aus dem Limbus und Hornhautepithels basalen Schichten gleichzeitig ersetzt werden. ¹ Verschiedene extrinsische Stressoren können die Apoptose und Schuppung der LME induzieren. ² Die Hitzeschockproteine (HSP) hoch konserviert und können in zwei Familien nach Molekülgrße unterteilen. ³ die größte Familie HSP umfasst HSP90, HSP70 und HSP60, und die kleinere Familie umfasst HSP27. ⁴ ist die Phosphorylierung von HSP27 ist bekannt , eine wichtige Rolle in Zellüberleben zu spielen und ist für die Zellmigration erforderlich wegen der Rolle dieses Proteins in die Aktin - Umbildung. ^5-7 Daher wir die mögliche Rolle von HSP27 - Phosphorylierung in CEC Migration und Apoptose in einem in vitro - Modell von epithelialen Wundheilung zu testen versucht.

RNA-Interferenz (RNAi) entweder kleiner oder short interfering RNAs (siRNA) mit GEnerated Interesse sowohl in der Grundlagen- und angewandten Biologie, da sie möglicherweise die Expression jedes Gens von Interesse erlaubt zerlegten werden. ⁸ Hier haben wir HSP27-spezifische siRNA , den Beitrag von HSP27 CEC Wundheilung und Apoptose zu bewerten. Traditionelle RNAi Methoden für die Gen-knock-down in Zellen verwenden synthetische RNA-Duplexe, darunter zwei unmodifizierten 21-mer Oligonukleotide, die zusammengesetzt werden können siRNAs zu erstellen. Die RNAi siRNA, die wir in dieser vorliegenden Untersuchung verwendet wird, ist eine einfache und hocheffiziente Methode, um Zellen zu transfizieren, und dieses Reagens arbeitet mit verschiedenen immortalisierten Zelllinien. In der vorliegenden Studie zeigen wir die Methoden für diese Analyse verwendet, einschließlich eines Kratzers induzierten Richtungs Wunden-Assay, Western Blot, siRNA-Transfektion Assay, Immunfluoreszenztest und Durchflusszytometrie.

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Protokoll

1. Zelllinie

1. Kultur 10 ⁶ Telomerase-immortalisierten humanen Cornea - Epithelzellen (hCEC) in einer 6-Well - Platte (Dichte: 1039,9 Zellen / mm ²⁾ in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO ₂ -Atmosphäre unter Verwendung bronchiale Epithel - Wachstumsmedium (BEGM) bis sie erreichen 95% Konfluenz.

2. Western-Blot-Analyse nach Epithelial Scratch Wunden Erstellen

1. Streak eine sterile 200 ul Pipettenspitze über die Oberfläche eines gut konfluierender kultiviert hCEC viermal pro Schale in einem biologischen Sicherheitsschrank (Klasse II, Typ A2) und Inkubation hCEC separat in einem 37 ° C Inkubator mit einer 5% igen CO ₂ -Atmosphäre für 1, 5, 10, 30, 60 und 120 min.
2. Verwenden einer 6-Well-Platte für sechs verschiedene Proben nach der Inkubationszeit nach Hornhautepithels Verwundung.
3. Waschen Sie verwundete HCEC Monolayern dreimal mit 1x PBS und fügen Sie dann 2,0 ml BEGM in jede Vertiefung.
4. Nehmen Sie hCEC mit 2ml 0,25% Trypsin-(EDTA) pro Vertiefung für 5 Minuten, Zentrifuge bei 900 xg für 5 min in einem 15-ml-Röhrchen und absaugen Trypsin-EDTA unter Verwendung einer 1 ml Pipette.
5. Suspend hCEC mit 1 ml 1x PBS und übertragen sie in ein 1,5-ml-Röhrchen.
6. Zentrifuge hCEC bei 10.000 × g für 15 Sekunden und absaugen 1x PBS unter Verwendung einer 1 ml Pipette.
7. Resuspendieren hCEC in 100 & mgr; l eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid [PMSF], Proteaseinhibitoren [1 uM Pepstatin A, 1 uM Leupeptin und 0,1 uM Aprotinin] und 0,5% Triton X-100 [pH 7]) und sie gut mischen.
8. Inkubiere Zellen für 30 min auf Eis Zelllyse zu induzieren.
9. Centrifuge Lysate bei 4 ° C bei 10.000 × g für 15 Minuten, und dann Stände übertragen an die frische 1,5-ml-Röhrchen (90 & mgr; l-Aliquots) und lagern Sie sie bei -80 ° C.
10. Bestimmen Gesamtproteinkonzentrationen von Zelllysaten des Bradford pr mitotein Test. ⁹
11. Last 30 ug Gesamtzellproteine ​​in einen 10% oder 12% Acrylamid-Gel für Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und dann elektrophoretisch Übertragung getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulosefilter mit einem 200 mA Strom für 1 h bei 4 ° C in Western-Blot-Assays verwendet werden.
12. Block Nitrocellulose-Filtermembranen mit 5% Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) für 1 h, hinzufügen primären polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen nicht-phosphorylierten HSP27 (1: 1000 Verdünnung) oder primärem polyklonalem Kaninchen-Antikörper gegen phosphoryliertes HSP27 (1 : 1000 Verdünnung) in 5% Rinderserumalbumin (BSA) und die Membranen bei 4 ° C auf einem Schüttler über Nacht inkubiert.
13. Erkennen immunoreaktive Banden unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1: 10.000 Verdünnung) in 5% BSA nach dem Waschen für 10 min 3 mal mit TBST.
14. Inkubieren Sie die Membran in den Western-Blot Luminol Reagenzien (6-7 ml pro 10 cm × 5 cm-Membran) für 1 min bei Raumtemperatur.
15. Entfernen Sie die Membran aus Reagenzlösung, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem saugfähigen Tuch, und in eine Plastikfolie Schutz.
16. Die Arbeit in einem dunklen Raum mit einem sicheren Licht, legen bedeckt Membran in einer Filmkassette mit Proteinseite nach oben zeigt.
17. Platzieren Röntgenfilm auf der Membran und freizulegen, für 1 min.

3. siRNA Transfection Assay ¹⁰

1. Kultur hCEC bei 5 × 10 ⁵ Zellen / Vertiefung in einer 6-Well - Platte in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO ₂ -Atmosphäre unter Verwendung BEGM , bis sie 95% Konfluenz erreichen.
2. Man verdünnt das Transfektionsreagenz (2,5 oder 7,5 ul) mit 100 & mgr; l reduziert Serum-Medium für die Transfektion (der Verdünnungsfaktor betrug 41 oder 14.3) und lösen die HSP27-spezifische und verschlüsselten Kontroll-siRNA in 100 & mgr; l reduziert Serum-Medium zu erstellen 10 oder 50 nM HSP27-spezifische und verschlüsselten Kontroll-siRNA.
3. Mischungs 100 μ; L siRNA-Lösung mit 100 & mgr; l verdünnt Transfektionsreagenz (1: 1-Verhältnis) und die Mischung 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Fügen Sie die siRNA-Lipid-Komplexe zu den Zellen. Dann nach 4 h Änderungsmedien BEGM abzuschließen und die Zellen für 2 Tage bei 37 ° C inkubieren.
5. Analysieren transfizierten Zellen mittels Western Blot, wie sich aus den Abschnitten 4.1 bis 4.7 beschrieben.

4. Western Blot - Assay für ¹¹ siRNA-transfizierten Zellen

1. Extrahieren Sie HSP27-spezifische und verschlüsselten Kontroll - siRNA-transfizierten hCEC in einem biologischen Sicherheitsschrank mit 100 ul eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), Proteaseinhibitoren, und 0,5% Triton X-100, pH 7).
2. Inkubiere Zellen für 30 min auf Eis Zelllyse zu induzieren.
3. Pellet-Lysate bei 10.000 × g für 15 min und dann Überstand auf frische 1,5 ml Wanne übertragenes (90 & mgr; l-Aliquots) und lagern Sie sie bei -80 ° C.
4. Bestimmen Proteinkonzentrationen der Zelllysate des Bradford - Protein - Assay. ⁹
5. Belastungsproben mit gleichen Mengen an Gesamtzellproteine ​​auf einem 10% bzw. 12% Acrylamidgel unterziehen um das Gel SDS-PAGE und elektrophoretisch übertragen die abgetrennten Proteinbanden auf Nitrocellulosefilter mit einem 200 mA Strom für 1 h bei 4 ° C zu verwenden Sie in Western-Blot-Assays.
6. Block Nitrocellulose-Filtermembranen mit 5% Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) für 1 h, hinzufügen primären Antikörper gegen phosphorylierte und nicht-phosphorylierte HSP27 (1: 1000 Verdünnung), phosphoryliertes Akt (1: 1000 Verdünnung), nicht-phosphoryliertem Akt (1: 1000 Verdünnung, als Zellüberlebensmarker verwendet), Bcl-2-assoziierten X-Protein (1: 1000 Verdünnung, als pro-apoptotische Protein verwendet) und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH; 1 : 200-Verdünnung, als Ladekontrolle) in 5% Rinderserumalbumin (BSA) verwendet, undbrüten die Membranen über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler.
7. Erkennen immunoreaktive Banden unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1: 10.000 Verdünnung) in 5% BSA nach 3-maligem Waschen mit TBST, 10 min jede Waschung.
8. Inkubieren der Membran in den Western-Blotting Luminol Reagenzien (6-7 ml pro 10 cm × 5 cm-Membran) für 1 min bei Raumtemperatur.
9. Entfernen Sie die Membran aus Reagenzlösung, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem saugfähigen Tuch, und in eine Plastikfolie Schutz.
10. Die Arbeit in einem dunklen Raum mit einem sicheren Licht, legen Sie die bedeckte Membran in einer Filmkassette mit der Proteinseite nach oben zeigt.
11. Platzieren Röntgenfilm auf der Oberseite der Membran und freizulegen, für 1 min.

5. Scratch-induzierte Directional Verwundung Assay Bewertung der Zellmigration ¹²

1. In einem biologischen Sicherheitsschrank, eine Wunde, indem sie mit einer sterilen Pipettenspitze über die Oberfläche eines gut konfluenter Kulturen ziehen vonHSP27-spezifische siRNA-transfizierten oder verschlüsselt Kontroll-siRNA-transfizierten hCEC.
2. Unmittelbar nach der Verwundung, wasche die Zellen zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und halten sie in BEGM Kulturen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO ₂ -Atmosphäre für 24 Stunden nach der Verwundung.
3. Fotografieren Sie HCEC Bilder einen aufrechten Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung 24 Stunden nach der Verwundung und führen mit Hintergrund Abflachen der Filter verwenden Befehl in die Bildanalyse-Software.
4. Mit dem Befehl Auswählen Messungen definieren Sie die Area of ​​Interest (AOI) mit der gleichen Größe polygonale Form, die sich von Ende senkrecht abdecken kann der anfänglichen Wunde zu beenden, und zu bestimmen, drei verschiedene AOI im verletzten Bereich jeder Probe.
5. zählen automatisch die Zellzahl in jedem Feld die Count / Größe Measure Menü-Optionen.

6. Durchflusszytometrie Analyse von Apoptosis

1. Kultur HSP27-spezifische siRNA-transfizierten und Kontroll siRNA-transfizierten hCEC jeweils 10 nM siRNA in einer Konzentration von 5 × 10 ⁵ Zellen enthält / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen bis die Zellen 95% Konfluenz in einer 37 ° C - Inkubator mit 5% CO ₂ -Atmosphäre in BEGM erreichen.
2. Nehmen Sie hCEC mit 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA pro Vertiefung für 5 Minuten, Zentrifuge bei 900 xg für 5 min in einem 15-ml-Röhrchen und absaugen Trypsin-EDTA eine 1 ml Pipette.
3. Wasche die Zellen zweimal mit kaltem PBS und dann Resuspendieren der Zellen in 1x Bindungspuffer (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl, und 25 mM CaCl ₂₎ bei einer Konzentration von 10 ⁶ Zellen / ml.
4. Transfer von 100 & mgr; l Zellsuspension (1 x 10 ⁵ Zellen) in einen 5 ml - Kulturröhrchen.
5. In 5 ul Fluoresceinisothiocyanat-konjugierten Annexin V und 5 ul Propidiumiodid.
6. Die Zellen vorsichtig vortexen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
7. Mit 200 & mgr; l 1x Bindungspuffer in jedes Röhrchen und zu analysieren, um die Zellen durch einen Strömungs cytometer innerhalb 1 Stunde.

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Ergebnisse

Die Expression von phosphoryliertem HSP27 signifikant bei 5, 10 erhöht, und 30 min nach der Verwundung scratch Vergleich zu unverwundeten hCEC ^13. Western - Blot - Analyse zeigte , dass die Expression von HSP27 phosphorylierten und phosphorylierten Akt waren beide signifikant reduziert, wohingegen die Expression von Bax signifikant in HSP27-spezifische siRNA-transfizierten hCEC (1A-E) erhöht wurde. Das phosphorylierte HSP27 - Expression wurde durch 30% und 4...

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Diskussion

In this present study, we evaluated the potential role of HSP27 in corneal epithelial wounding using in vitro approaches. The critical steps involved siRNA transfection for HSP27 knock-down to observe the function of HSP27 in cells subjected to stress. Notably, a role for HSP27 was revealed by these experiments in epithelial cell migration and apoptosis during corneal epithelial wound healing. Unlike previous studies¹⁰ that used rat HSP27-specific siRNA to transfect vascular smooth muscle cells, we us...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological safety cabinet	CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republic of Korea	CHC-777A2-06	Class II, Type A2
Stealth RNAi™ siRNA	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Bronchial epithelium growth medium
Protease inhibitor	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	P8340 ,P7626	1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin
Bradford protein assay	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	#500-0001	Bradford protein assay
Nitrocellulose filters	Amersham, Little Chalfont, UK	RPN3032D	Western blotting membrane
Non-phosphorylated HSP27	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351	1:1,000 dilution (Total HSP27)
Phosphorylated HSP27 (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594	1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Transfection reagent
Phosphorylated Akt (Ser473)	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4060	1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)
Non-phosphorylated Akt	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4061	1:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4062	1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	No. 4063	1:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	1:10,000 dilution
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	reduced serum medium for transfection
Image analysis software	Olympus, Inc., Tokyo, Japan	Image-Pro Plus 5.0
Skimed milk powder	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0497
Sodium Chloride	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Six well culture plate	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	35.00 mm diameter / well
24-well culuture dish	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Orbital shaker	N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea	NB1015
Bovine serum albumin	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ		Flow cytometry
X-Ray Film	Kodak, Rochester, NY		Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen
western blotting luminol reagent	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2048
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547