עירור החיצוני של הנוירונים באמצעות שדות חשמליים ומגנטיים ב אחד" ותרבויות דו ממדים

Summary

תרבויות עצביים הם מודל טוב ללימוד טכניקות גירוי המוח החדש דרך השפעתם על נוירונים בודדים או אוכלוסייה של נוירונים. להלן שיטות שונות עבור גירוי של תרבויות עצביות בדוגמת על ידי שדה חשמלי המיוצר ישירות על ידי אלקטרודות אמבטיה או המושרה על ידי שדה מגנטי משתנה זמן.

Abstract

תא עצב יפטר פוטנציאל פעולה כאשר פוטנציאל הממברנה שלה עולה על סף מסוים. בפעילות אופיינית של המוח, זה קורה כתוצאה תשומות הכימיקלים סינפסות שלה. עם זאת, הנוירונים יכול גם להתרגש שדה חשמלי שהוטל. בפרט, יישומים קליניים האחרונים להפעיל נוירונים ידי יצירת שדה חשמלי חיצונית. לכן עניין לחקור כיצד הנוירון מגיב לשדה החיצוני ומה גורם פוטנציאל הפעולה. למרבה המזל, יישום מדויק ומבוקר של שדה חשמלי חיצוני אפשרי עבור תאים עצביים עובריים אשר נכרתו, ניתקו גדלו בתרבויות. זה מאפשר חקירה של שאלות אלה במערכת מאוד לשחזור.

במאמר זה כמה מהטכניקות המשמשות יישום מבוקר של שדה חשמלי חיצוני על תרבויות עצביות נסקרים. הרשתות יכולות להיות חד ממדית, בדוגמת כלומר ב לינאהצורות r או מותרים לגדול על המטוס השלם של המצע, ובכך שני ממדי. יתר על כן, עירור יכול להיווצר על ידי יישום ישיר של שדה חשמלי באמצעות אלקטרודות שקוע בתוך נוזל (אלקטרודות אמבטיה) או על ידי גרימת השדה החשמלי באמצעות יצירה מרחוק של פולסים מגנטיים.

Introduction

האינטראקציה בין נוירונים ושדות חשמליים חיצוניים יש שלכות יסוד וכן פרקטי. אמנם ידוע מאז ימי וולטה ששדה חשמלי לשימוש חיצוני יכול לרגש רקמה, המנגנונים האחראים לייצור של פוטנציאל פעולה נובע בנוירונים הם רק מתחילים לאחרונה להתפורר ^{1, 2, 3, 4.} זה כולל מציאת תשובות לשאלות לגבי המנגנון שגורם לאובדן קיטוב של פוטנציאל הממברנה, תפקידיו של תכונות הממברנה של תעלות יונים, ואפילו באזור הנוירון מגיב השדה החשמלי ^{2, 5.} טיפולים עצביים ^{6, 7, 8, 9,} 10 מתודולוגיות במיוחד תלויות במידע זה, אשר יכול להיות מכריע עבור מיקוד בתחום לקה להבנת תוצאות הטיפול. הבנה כזו יכולה גם לסייע בפיתוח פרוטוקולים לטיפול וגישות חדשות עבור גירוי של אזורים שונים במוח.

מדידת האינטראקציה בתוך המוח in vivo מוסיפה מרכיב חשוב להבנה זו, אבל הוא הכביד על ידי אי-הדיוק ויכולת הבקרה נמוכה של מדידות בתוך הגולגולת. לעומת זאת, מדידות בתרבויות יכולות להתבצע בקלות בנפח גבוה עם דיוק גבוה, אות מצוינת בביצועי רעש רמה גבוהה של שחזור של שליטה. שימוש בתרביות מגוון רחב של מאפיינים עצביים של התנהגות ברשת קולקטיבית ניתן הובהר ^{11, 12, 13, 14, 15, 16.} בדומה לכך, המערכת היטב נשלטה הזה צפוי להיות יעיל מאוד הבהרת המנגנון שבאמצעותו שיטות גירוי אחרות לעבוד, למשל איך פתיחת הערוץ במהלך גירוי אופטי בנוירונים פעיל optogenetically ^{17, 18, 19} היא אחראית ליצירת פוטנציאל פעולה.

כאן הדגש הוא על המתאר את התפתחות והבנה של כלים שיכולים לרגש הנוירון ביעילות באמצעות שדה חשמלי חיצוני. במאמר זה אנו מתארים את ההכנה דו ממדים ותרבויות בהיפוקמפוס בדוגמת חד ממדיות, גירוי באמצעות תצורות וכיוון שונים של שדה חשמלי מיושם ישירות על ידי אלקטרודות אמבטיה, ולבסוף גירוי של דו ממדים בדוגמת תרבויות חדות ממדיות על ידי המשתנים עם זמן שדה מגנטי, אשר ומשרה שדה חשמלי^{5, 20, 21.}

Protocol

משפט ואתיקה: נהלים הקשורים בטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדי השתמש (IACUC) של מכון ויצמן למדע, והחוק הישראלי המתאים. מכון ויצמן הוא מוכר על ידי האגודה הערכה וההסמכה של הבינלאומי טיפול בבעלי חיים מעבדה (AAALAC). הטיפול בבעלי החיים המוסדי ויצמן ועדת השימוש אשרה במחקר זה, שנערך עם נוירונים בהיפוקמפוס.

1. הכנת דו מימדי (2D) ו חד ממדי (1D) תרבויות בהיפוקמפוס

1. הכנת coverslips עבור תרבויות 2D.
   1. כן בינוני ציפוי (PM) הכוללת: 0.9 תקשורת חיונית מינימום המ"ל (MEM) + 3G, 0.05 נסיוב עגל עוברי מיליליטר (FCS), 0.05 סרום סוס המ"ל חום מומת (HS HI) ו 1 μL של תוסף B27. הערה: MEM + 3G מכיל לכל 500 מ"ל של ממ x 1, 1 מ"ל של gentamycin, 5 מ"ל של 100x L-גלוטמין התייצב (ראה טבלת חומרים / ריאגנטים) ו 5 מ"ל של 60% D - (+) - גלוקוז.
   2. הכן חיץ borate מורכב: 1.9 גר 'בורקס (decahydrate נתרן tetraborate) ב 200 מ"ל מים מזוקקים כפול (DDW) (לערבב ב 60 מעלות צלזיוס) ו 1.24 גרם חומצת בור ב 200 מ"ל DDW. לכייל פתרון סופי ל- pH 8.5 באמצעות 1 M HCl. הערה: הפתרון הסופי הוא 400 מ"ל 0.1 M חיץ borate.
   3. לטבול את coverslips זכוכית ב 65% חומצה חנקתית עבור 2 h. לשטוף שלוש פעמים DDW ואחריו שלוש שטיפות עם ריאגנט אנליטית המוחלט (AR ABS) אתנול.
   4. לעבור כל coverslip בקצרה דרך הלהבה של מבער בונזן שתיים או שלוש פעמים במשך 1 - 2 של, ולאחר מכן לעזוב כדי לדגור לילה 24 צלחות היטב עם 1 מ"ל פתרון 0.01% פולי- L- ליזין מדולל 1: 5 במאגר borate ( 0.1 M, pH 8.4). לאחר מכן לשטוף coverslips ב DDW שלוש פעמים ולהשאיר עם 1 מ"ל PM היטב לכל תקן 37 ° C, 5% CO ₂ באינקובטור במשך הלילה.
2. הכנת coverslips עבור תרבויות 1D.
   1. g הנקיcoverslips נַעֲרָה ידי טבילה בתמיסה פיראניה בסיס המורכב 75 מ"ל DDW, 25 פתרון אמוניה מ"ל 25% ו 25 מ"ל מי חמצן 30%. פתרון מקום עם coverslips זכוכית על צלחת חימום ב ~ 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן לייבש את coverslips זכוכית עם חנקן.
   2. coverslips מעיל הראשון עם סרט כרום דק (99.999%) של עובי 6 ואחריו שכבה 30 א 'של זהב (99.999%), או באמצעות אדים או גמגום בתצהיר.
      1. כדי להשיג שיעור מקרטעת של 0.05 - 1 A / s להשתמש במכונת מקרטעת עם 2 דואר קורות ומערכת ואקום של 260 l / s עם יעד בגדלי 2" ו 4" . השתמש במת סיבוב שיכול ללכת מ 0 - 100 סיבובים לדקה (סל"ד). השתמש זרם ישר (DC) גמגום הכוח של 0 - 750 וואט.
      2. השתמש ברוטציה של 30 סל"ד ו ארגון 99.999% כדי לקבל פלזמה ב 10 לחץ mTorr בתא.
      3. הפעילו את אספקת החשמל של רובים המקרטעת ב 40 W כוח גמגום DC עבור כרום, שמוביל ~ 0.12 Å / s שער הכיסוי, ו ב 10 W DC כוח sputter עבור זהב, המוביל ~ 0.28 Å / s.
   3. ממיסים 0.1 גרם 1-octadecanethiol ב 100 מ"ל ABS אתנול AR באמצעות אולטרסאונד למשך 30 דקות. מקום Cr- מצופה coverslips מצופה עבור 2 שעות בפתרון זה, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול ABS ו יבש עם חנקן.
   4. הכן פתרון של 100 מ"ל Dulbecco של פוספט שנאגרו מלוחים (D-PBS) ו -3.5 גרם של תלת לחסום שיתוף פולימר (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים ) על ידי ערבוב עבור 1 - 2 שעות ב 600 - 700 סל"ד. מקום coverslips בפתרון עבור 1 ח. יבש coverslips עם חנקן.
   5. מכני לחרוט את הדפוס הרצוי על ידי גירוד שכבת ביו דחייה ²² . לעשות זאת באמצעות הקושר עט, שבו העט מוחלף על ידי מחט תחריט. גרדו את התבנית דרך שכבות המתכת כדי להגיע אל הזכוכית הבסיסית. שליטה על תהליך זה על ידי מחשב כדי להשיג דפוס משוכפל הרצוי. דפוסים שנוצרו על ידי תהליך זה הם להדגים ד באיור 2 ואיור 3.
   6. הכן שכבת תואם-ביו של 100 מ"ל D-PBS, 3.5 גרם שיתוף פולימר Tri-גוש, 35.7 μL / פיברונקטין מ"ל ו 29 μl / laminin מ"ל.
      1. לעקר coverslips לאור אולטרה-סגול דק '10 לפחות. דגירה coverslips למשך הלילה פתרון ביו-תואם מוכן.
         הערה: השכבה ביו-התואמת תהווה היחיד שבו השכבה ביו-הדחייה כבר חרוטה מעל בשלב הקודם.
      2. ביום לשטוף למחרת coverslips פעמיים עם P-אס. דגירת coverslips ב PM הלילה. Coverslips מוכן כעת ציפוי תא.
3. בצע לנתיחה על פי נהלים קבועים אשר פורסמו בהרחבה בעבר ^{23, 24.}
   1. בקיצור, ההיפוקמפוס תמצית או קליפה מעובר עכברוש, בדרך כלל יום E19, או מעכברים, בדרך כלל יום E17 ^23,class = "Xref"> 24.
   2. לנתק התאים הראשון בתמיסת פפאין למשך 20 - 30 דקות, ואחריו טחינה דקה מכני ²⁴ עם טפטפות זכוכית שקצותיהם הם אש מלוטשת.
      הערה: אם התאים באים עכברים מהונדסים גנטיים אז הרקמה מעוברת אחד צריכה להישמר בתוך שפופרת 1.5 מיליליטר פלסטיק נפרדת במהלך התהליך כולו.
   3. ספירת תאים עם כחול trypan לפני הזריעה.
      הערה: בעלי חיים מהונדסים גנטי הספירה צריכה להיעשות בנפרד עבור כל עובר.
   4. עבור תרבויות 2D, הנוירונים עכבר הזרע בבית נוירונים 750,000 ו עכברוש בבית 850,000 תאים לכל טוב. עבור 1D, סיד 650,000 תאים לכל טוב. Shake צלחת מעט מייד לאחר הזריעה כדי להבטיח כיסוי הומוגנית של coverslip.
4. תחזוקה של התרבויות העצביות.
   1. הכן שינוי המדיום (CM) מורכב (לכל מ"ל):. 0.9 3G מ"ל ממ +, 0.1 HS מ"ל HI, 10 μL 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) עם 100x uridine
   2. הכן בינוני סופי (FM) מורכב (לכל מ"ל): 0.9 מ"ל ממ + 3G ו 0.1 HS מ"ל HI.
   3. החלף PM עם 1-1.5 מ"ל CM לאחר 4 ימים במבחנה (DIV). בשעה 6 DIV, להחליף 50% של CM עם CM טרי. בשלב DIV 8, לשנות את המדיום כדי 1.5 מ"ל FM, ואחריו שינוי 50% של FM כל 2 ימים. לאחר כ פעילות סינכרונית שבוע ספונטנית עולה.
5. הדמיה של פעילות ספונטנית או עורר תרבויות עצביות עם צבעי ניאון.
   1. הכן תמיסה של 50 מיקרוגרם צבע פלואורסצנטי רגיש סידן (ראו טבלה של חומרים / ריאגנטים) ב 50 μL DMSO (sulfoxide דימתיל).
   2. כן פתרון הקלטה תאי (EM) המכיל (מ"מ) 10 HEPES, 4 KCl, 2 ₂ CaCl, 1 ₂ MgCl, 139 NaCl, 10 D- גלוקוז, סוכרוז 45 (pH 7.4).
   3. דגירה תרבות העצבית 2 מ"ל EM עם 8 μL של פתרון צבע רגיש סידן ניאון עבור 1 h. להגן מפני אור בעדינות לסובב כדי להבטיח homogenהתפשטות מפוקפקת של הצבע לתאים.
   4. חלף פתרון עם טרי EM לפני ההדמיה. הדמית פלורסנט מודגמת באיור 4.
   5. תמונה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם פילטרים אופטיים עבור דימות פלואורסצנטי סידן (שיא עירור ב 488 ננומטר, שיא פליטה ב 520 ננומטר), באמצעות מצלמה ותוכנה מסוגלת לכמת את העוצמת בכל אזור של עניין (ROI) בתוך שדה ראייה של המיקרוסקופ.

גירוי חשמלי 2. של תרבויות

הערה: תוכנית ההתקנה הבסיסית עבור גירוי חשמלי מוצג באיור 1. תלוש כיסוי שעליו תרבות העצבית כבר גדל במשך כ 14 ימים מושם בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פעילות חשמלית של תאי העצב הוא צלם באמצעות צבעי סידן רגישים בזמן מתח מוחל באמצעות שני זוגות של אלקטרודות אמבטיה הממוקמים מחוץ לתרבות. האלקטרודות הם מונעים על ידי כפיגנרטור ignal שתפוקתו המועצמת על ידי מגבר ערוץ כפול. בקרת מתח עבור גירוי עדיפה על השליטה הנוכחית הסטנדרטית יותר ^{25, 26} מכיוון וקטורי השדה החשמליים נקבעים ישירות, ובכך לאפשר תוספת וקטור פשוטה שילוב. זה דורש בדיקה קפדנית של האחידות של השדה החשמלי, אשר יכול להתבצע על המדגם השלם במקרה של בקרת מתח. כאשר טיפול בקרת מתח באמצעות יש לנקוט כדי למנוע לולאות קרקע ההומוגניות של השדה החשמלי צריך להיות מאומת (ראה 2.2 להלן).

1. עבור גירוי חשמלי עם שדה חשמלי הומוגני להשתמש זוג חוטי אלקטרודות מקבילים.
   1. השתמשו אלקטרודות עשויות פלטינה עם עובי בסדר גודל של 0.005 "" (127 מיקרומטר). כאשר בשימוש עם 13 את coverslips מ"מ, להבטיח כי המרחק בין שתי האלקטרודות הוא סביב 11 מ"מ, ולמקם האלקטרודהים 1 מ"מ מעל התרבות.
      הערה: כדי להפוך את מחזיק האלקטרודה (איורים 5 א ו 6A) להשתמש polytetrafluoroethylene (PTFE). לקדוח חורים צרים דרך PTFE להכניס את האלקטרודות. המכשיר צריך להיות גבוה יותר מאשר הפתרון התאי כך בקצה העליון, שבו אלקטרודות נחשפים, לא יבוא במגע עם הפתרון. עבור בידוד, להשתמש בדבק אפוקסי על כל חלק של מוביל אלקטרודה שעשויים להיחשף.
   2. השתמש בצורה דופקת מרובעת עם מחזור העבודה 50%, ללא רכיב DC להימנע אלקטרוליזה. וארי הדופק משך בין 10 מיקרו-שניות ו 4 ms לגרום גירוי יעיל בלי לשרוף את התרבות. ודא כי משרעת היא בסדר גודל של ± 22 V (ראה איור 5). הדופק המרובע ניתן לצפות על אוסצילוסקופ מחובר במקביל אלקטרודות.
      הערה: עבור תכנות קל של כל צורת גל רצוי, להשתמש בתוכנת עריכת צורת הגל מסחרית (ראה רשימת חומרים ). זן בצורה גרפית את צורת הגל הרצוי ולשלוח אותו מחולל צורת הגל.
2. כדי לבדוק הומוגניות שדה להשתמש אלקטרודה בדיקה. להשתמש ברשת של לפחות 1 מ"מ x 1 מ"מ כדי לאפשר הבדיקה להתרגש באזור שבין האלקטרודות ולמדוד פוטנציאל חשמלי.
   1. למדוד פוטנציאל חשמלי. להשתמש כדי לחשב את השדה החשמלי. השתמש באחת האלקטרודות כמו אלקטרודה התייחסות. מדדו את השדה החשמלי משתנה משכי הדופק בין 100 מיקרו-שניות כדי 4 ms (ראה איור 5 עבור דוגמה משך הדופק 100 מיקרו-שניות) כדי לוודא שהשדה הוא הומוגני בטווח של משכי מגרה.
      הערה: ראה איור 5D עבור דוגמא הומוגניות שדה חשמלי נמדדה כאשר משך הדופק היה 1 ms.
3. השתמש 2 זוגות בניצב של אלקטרודות אמבטיה לייצר צורות שדה חשמליות מסובכות יותר, וכדילהיות מסוגל להתמצא בשטח בכיוונים שונים (ראו איור. 6B). המכשיר עם 2 זוגות אלקטרודות ישמש, ואת האות על כל זוג של אלקטרודות תקוים על שני אוסצילוסקופ נפרד.
   1. מקם את האלקטרודות 1 מ"מ מעל התרבות במרחק של 10 - 11 מ"מ זה מזה. ודא ששני זוגות אלקטרודה הם צפים (אין חיבור לאדמה), ואין להם שום מכנה משותף על ידי מדידת התנגדות בין כל סט של אלקטרודות ואימות בהעדר קצרים בין כל האלקטרודות. ודא כי כל הציוד המשמש, אשר מחובר אלקטרודות (כגון אוסילוסקופים, המגברים, מחוללי האותות, וכו ') הוא צף ביחס לקרקע על ידי בדיקה שכל הציוד צף כי אף אחד אלקטרודות ההתייחסות נוגע כל ציוד מקורקע.
   2. כדי לשנות את הנטייה שדה, לשנות את משרעת של מתח נמאס לשני זוגות אלקטרודה עם מילpect זה לזה (ראה איור 7 א). לדוגמא, עבור 0 ° שימוש ± 22 V על זוג אלקטרודה אשר בניצב הדפוס ו 0 V עבור האלקטרודה האחר. במשך 45 °, להשתמש ± 15.6 V משני זוגות של אלקטרודות בפיגור לא שלב, תמורת סכום וקטור משרעת של 15.6 ² 15.6 ² = 22 ^2.
   3. כדי להחיל שדה מסתובב להשתמש גל אחד של דופק מתח סינוס גל אחד בודד של דופק מתח קוסינוס לשני הזוגות אלקטרודות לייצר משרעת קבועה מסתובבת שדה חשמלי (ראה איור 6).
      הערה: כפי שניתן לראות באיור 6B, בעת שימוש מחזור אחד של גל סינוס עם ± 22 V ב אלקטרודה אחת מחזור אחד של גל קוסינוס עם ± 22 V ב האלקטרודה האחר, סכום הווקטור הוא שדה חשמלי מסתובב עם משך המחזור זהה גל סינוס וקוסינוס, וכן עם משרעת של ± 22 V.
4. כדי למדוד ולחשב ChronAxie ו Rheobase של אקסונים בתרבות העצבית לעומת דנדריטים באותה תרבות לבצע את הצעדים הבאים.
   1. השתמש בסידן סידן רגיש סידן עבור הדמיה סידן כמתואר בטבלה של חומרים / ריאגנטים ב 1.5) עם תרבות 1D בדוגמת על רזה (170 מיקרומטר), ארוך (10 מ"מ) שורות. צבע רגיש סידן יחול על התרבות, מודגרת במשך 45 דקות. צבע יהיה שטף על ידי החלפת פתרון הקלטה טריים.
   2. לנתק את הרשת כדי להשיג נתונים סטטיסטיים של האוכלוסייה של התגובה הישירה לגירוי חשמלי, ללא ההשפעה של שידור סינפטי. כדי לעשות זאת, להחיל שילוב של 40 מיקרומטר של bicuculline, אשר חוסמת את פעילות מעכב של גמא- Aminobutyric חומצה A (GABA) קולטנים, 10 מיקרומטר של 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) , כדי לחסום את α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) ו קולטנים kainate ו 20 מיקרומטר של (2R) -amino-5-phosphonovaleחומצה כלורית (APV), אשר חוסם את הקולטנים N-methyl-D-aspartate (NMDA). החוסמים יתווספו פתרון ההקלטה.
   3. החל דופק מרובע כמתואר 2.1 ו 2.3 עם משתנים משכי הזמן בין 100 מיקרו-שניות ו 4 ms. האות ניתן לצפות על אוסצילוסקופ.
   4. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם תוכנית רכישת התמונה (ראה 1.5) כדי לנטר את עוצמת הארעיים סידן בכמה רואיס, שכל אחת מהן מכילה כמה מאות נוירונים. לרכוש תמונות באמצעות מצלמת EMCCD רגישה (ראה רשימת חומרים), מסוגלות שיעור רכישת תמונה של 20 מסגרות לפחות לשנייה. השינוי בעוצמת האור הוא יחסי לכמות של נוירונים שהיו מגורה. הערך את השבריר של נוירונים מגורה באמצעות השינוי ביחס בעצמה.
   5. עבור כל משך הדופק (100 מיקרו-שניות כדי 4 ms), לשנות את משרעת של מתח להחיל את האלקטרודות החל מהשעה מתח שבו אין שינוי בעוצמת נתפסת (כמה וולט), כדי thדואר מתח שבו השינויים בעוצמת עקב המתח מיושם כבר רוויים (עד ± 22 V).
      הערה: השינוי בעוצמת יחולק בתור ⁵ גאוס המצטברים בגין המתח להחיל עבור גירוי לכל משך זמן של דופק המתח.
   6. התאם הפצה גאוס מצטבר עבור עוצמת לעומת מתח מיושם לכל משך ולחלץ את הממוצע גאוס מן ההתקף הזה.
      הערה: ממוצע זהו מתח הנציג שאליו הנוירונים הגיבו.
   7. בסוף התהליך זה להשיג עבור כל משך גירוי מתח ממוצע שאליו הנוירונים הגיבו. השתמש זוגות אלה של משכים ועוצמות לשרטט עקומות הכח-Duration (ראה איור 7).

3. גירוי מגנטי של תרבויות

הערה: תוכנית ההתקנה הבסיסית עבור גירוי מגנטי מוצג באיור 2. בפינה השמאלית העליונה מוצגמיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המשמש לתמונות צבע סידן רגיש הנוירונים. סליל מגנטי (עיגולים כחולים) ממוקם סביב 5 מ"מ באופן קונבנציונלי מעל תרבות טבעת עצביים, (מתאר כחול). סליל איסוף (עיגול אדום) על היקף צלחת פטרי מנטרת את המתח המושרה על ידי הדופק המגנטי. בצד שמאל למעלה מוצג הדינמיקה נמדדת של מגנטי מגנטי (MS) סליל עם עומס מתח קבלים של 5000 קילו וולט, משולב סליל טנדר. שדה חשמלי המושרה (מחושב עבור רדיוס טבעת של 14 מ"מ) מתואר בירוק בעוד השדה המגנטי מתואר בכחול. בתחתית מוצגים תמונות של התרבות העצבית. בתחתית השמאלית הוא שדה שדה בהיר של coverslip 24 מ"מ בדוגמת. האזורים הלבנים הם הנוירונים. הדפוס המצולם מורכב מתרבויות טבעת קונצנטריות עם רדיוסים שונים. בפינה הימנית התחתונה הוא זום על קטע קצר של הטבעות, מראה נוירונים בודדים. עבור קנה מידה, רוחב הטבעותה הוא כ 200 מיקרומטר.

1. לגדל את הנוירונים בתבנית טבעת עגולה (חרוט כמתואר 1.2.5) עבור גירוי תרבות 1D. השתמש צבע פלואורסצנטי רגיש סידן הדמיה סידן (כמתואר בסעיף 1.5) עם תרבות 1D בדוגמת על רזה (170 מיקרומטר), רב קווי (10 מ"מ).
   1. השתמש סליל מגנטי עגול ולמקם בצלחת פטרי כ 5 מ"מ מתחת קונצנטריים עם הסליל. השתמש סליל המנהג של כ 30 מ"מ (קוטר פנימי, קוטר חיצוני 46 מ"מ) סליל עם השראות של L = 90 MH מונע על ידי MS תוצרת בית או מסחרי טעון עם מתח מקסימלי של 5 קילו.
   2. פריקת מתח גבוה וזרם דרך סליל מוליך באמצעות מתג גבוה הנוכחי-מתח גבוה כדי לעורר תרבויות עצביות מגנטי. ממריץ מגנטי (MS) יכול להיבנות כמתואר ²¹ באמצעות קבלים גדולים, בסדר גודל של 100 MF, כדי להשיג מתח גבוה של 1 - 5 קילו. לחלופין להשתמש באופן מסחריMS זמין (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים).
      הערה: השתמש 0.254 מ"מ עובי ו 6.35 מ"מ רחב צופה פוליאסטר מלבן חוט נחושת לפברק סליל תוצרת בית ^21. מפעיל את החוטים על מסגרות בהתאמה אישית, מבודד עם סיבי זכוכית ומטיחן אפוקסי (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים). לחלופין להשתמש סלילי זמין מסחרית (ראו טבלה של חומרים / ריאגנטים).
2. השתמש מסתובב בשדות מגנטיים כדי לעורר תרבויות 2D.
3. עכשיו, השתמש בשדות מגנטיים מסתובבים כדי לעורר תרבויות 2D. לפטר את TMS ללא תרבות בצלחת, בעוצמות שונות, כדי להראות את הקשר הליניארי של קריאת הסליל עם העוצמות.
4. הבא, בעת ההקלטה ארעית סידן עם תרבות עצבית, להתחיל ירי TMS להגדיל עוצמות בעוד הן ההקלטה ארעית סידן ואת הסליל. בתחילה, התפרצויות רשת שנצפו כמו הארעיים סידן גדולים, shoULD לא לסנכרן עם להרים קוצים TMS סליל. המשך להגביר את העצימות, בשלב מסוים, הארעי סידן מתחיל להיות מסונכרן עם קוצי TMS. לחלופין, או בנוסף, לאחר השיג תגובה מסונכרנת, להתחיל להקטין את העוצמות עד הסנכרון הוא בוטל, כדי לקבוע את סף TMS.
   הערה: יש לשמור על תנאי קבוע אך ורק עבור כל אחד מהערכים, באמצעות הנפח המדויק בכל פעם, באותו כלי ועמדות סליל מדויקים אורינטציות.
   1. הר סליל הטנדר על הבסיס של מנת ההקלטה, כך שהוא נמצא במקביל מטוס לתרבות העצבית ו בתנוחה קבועה ביחס לתרבות.
      הערה: הדבר מבטיח כי התלות של המיצוב של סליל האיסוף ביחס המגנט הוא נאמן לתפקיד התרבות ושכל בפערים בין המיצוב יהיו זניחים על קריאות סליל איסוף.
      1. השתמש בשני סליליים עצמאיים כי הםבניצב זה לזה (איור 8B) כדי ליצור שדה חשמלי מגנטי מושרה מסתובב. חברו כל סליל כדי MS משלו. ודא כי לגירוי לפרוק זרמים דומים בפיגור פאזה של 90 מעלות (איור 10A), וכתוצאה מכך שדה מגנטי מסתובב שסורק 270 מעלות של המרחב האמיתי במגרש מרבי של ~ 270 V / m (האיור 10B).
      2. מקם את התרבות העצבית בתוך מיכל זכוכית כדורי מלא פתרון ההקלטה החיצוני (EM).
      3. נטור גירוי (שינוי בעוצמת קרינה של נוירונים) עם המצלמה כפי שמתואר בשלב 2.4.4.
      4. במקרה של סלילי צלב (איור 8B), למקם את ההקבלה סליל איסוף ובמרחק ספציפי מתחת תרבות העצבית. בזהירות לשמור את התצורה הזו לאורך כל הניסויים.
5. חישוב אנליטי השדה החשמלי עבור configura 1Dtion ידי E _max = k ₁ Br, כאשר E _מקס הוא משרעת מקסימלית של השדה החשמלי המושרה ואת מכוונת לאורך המשיק של טבעות עם רדיוס r. B היא האמפליטודה של פולס מגנטי ו k ₁ הוא קבוע המידתיות ממדי שניתן למדוד באמצעות סליל איסוף (איור 8 א).
6. השתמש חבילת סימולציה נומרית (ראה רשימת חומר) כדי לדמות את השדה החשמלי ²¹ מספרית.

תוצאות

הפרוטוקול המובא מאפשר דפוסים קלים של תרבויות עצביות. כאשר הוא משולב עם כמה שיטות שפיתחנו עבור גירוי, הוא מאפשר לבצע מדידות של כמה תכונות הנוירון מהותי כגון Chronaxie ו Rheobase ^5, להשוות המאפיינים של נוירונים בריאים וחולים ^27, כדי...

Discussion

דפוסי 1D הוא כלי חשוב שיכול לשמש עבור מגוון רחב של יישומים. לדוגמא, השתמשנו דפוסי 1D ליצירת שערים לוגיים מתרבויות עצביות ²⁹ ולאחרונה למדוד את Chronaxie ו Rheobase של נוירונים בהיפוקמפוס חולדה ^5, ו להאטת מהירות התפשטות אותות של פעילות הירי ב נוירונים בהי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M	Fluka	21098	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4