JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Nöronal kültürler tek nöronlar üzerindeki etkisi veya nöronların nüfusu yoluyla ortaya çıkan beyin stimülasyonu teknikleri incelemek için iyi bir modeldir. Banyo elektrotlar doğrudan üretilen ya da zaman içinde değişen bir manyetik alan tarafından indüklenen bir elektrik alanı ile desenli nöronal kültürler uyarılması için farklı yöntemler burada sunulmuştur.

Özet

zar potansiyeli, belirli bir eşik değerini aştığında bir nöron, bir eylem potansiyelini ateşleyeceği şeklindeki. beyin tipik aktivitesi, bu da sinaps kimyasal girdi bir sonucu olarak ortaya çıkar. Ancak, nöronlar da dayatılan elektrik alanı ile uyarılabilir. Özellikle, son klinik uygulamalar dışarıdan bir elektrik alanı oluşturarak nöronları aktif hale getirin. Bu nöron dış alana yanıt verir ve hangi işlemin potansiyelini nasıl neden araştırmak için ilgi odağı olmaktadır. Neyse ki, bir dış elektrik alanı hassas ve kontrollü bir uygulama, kesilmiş ayrılır ve kültür içinde yetiştirilir, embriyonik nöronal hücreler için mümkündür. Bu son derece tekrarlanabilir sisteminde bu soruların soruşturma sağlar.

Bu yazıda nöronal kültürler üzerinde dış elektrik alanın kontrollü uygulama için kullanılan bazı teknikler gözden geçirilmiştir. Ağlar ya tek boyutlu, yani linea de desenli olabilirr biçimleri ya da substrat bütün düzlemde büyümesine izin verilir ve bu şekilde iki boyutlu. Ayrıca, tahrik sıvısı (banyo elektrotlar) 'de ya da manyetik impuls uzaktan yaratılması kullanarak elektrik alanı uyararak daldırılmış elektrodlar aracılığıyla elektrik alanının doğrudan uygulanması ile oluşturulabilir.

Giriş

nöronlar ve dış elektrik alan arasındaki etkileşimin temel etkileri yanı sıra pratik olanları vardır. Bu, dışarıdan uygulanan bir elektrik alanı dokuyu harekete ki Volta zamanlardan beri bilinmekle birlikte, nöronlarda bir Sonuçta elde edilen eylem potansiyeli üretimi için sorumlu olan mekanizmalar sadece son 3, 4, 2, 1 çözülemeyen başlıyor. Bu elektrik alanı 2, 5 yanıt nöron membran potansiyelinin depolarizasyonu, membran özelliklerinin ve iyon kanallarının rolü ve hatta bölgeyi neden mekanizmasına ilişkin sorulara cevap bulmak içerir. Nörostimülasyon 6, 7, 8, 9 Tedavi, 10 metodolojiler etkilenen alanları hedefleyen ve tedavinin sonucunu anlamak için önemli olabilir, bu bilgilerin, özellikle bağımlıdır. Böyle bir anlayış da beyinde farklı alanlarda uyarılması için tedavi protokolleri ve yeni yaklaşımlar geliştirmede yardımcı olabilir.

In vivo beyin içinde etkileşimi Ölçüm Bu anlayışa önemli bir bileşen ekler, ancak hassas olmamasından ve kafatası içindeki ölçümler, düşük kontrol edilebilirlik nedeniyle engellenmektedir. Bunun aksine, kültürlerde ölçümleri kolayca yüksek hassasiyet, gürültü performansı mükemmel sinyal ve tekrarlanabilirliği ve kontrol, yüksek bir derecede yüksek hacimde gerçekleştirilebilir. Toplu ağ davranışı nöronal özelliklerinin büyük bir çeşitlilik 14, 13, 12, 11 açımlanabilir kültürleri kullanılarak, 15, 16. Benzer şekilde, bu iyi bir şekilde kontrol sistemi optogenetically aktif nöronların 17, 18 optik uyarılması sırasında kanalı açma, 19 aksiyon potansiyelinin oluşturmak için sorumlu kadar, örneğin diğer uyarım yöntemler işe hangi mekanizma, açıklık son derece etkili olduğu tahmin edilmektedir.

İşte odak verimli bir dış elektrik alanı sayesinde nöronlara heyecanlandırmak araçlar geliştirilmesi ve anlayış açıklayan üzerindedir. Bu yazıda tek boyutlu kültürleri farklı yapılandırmalar ve banyo elektrotlarla doğrudan uygulanan bir elektrik alanı yönünü, ve iki boyutlu son olarak uyarılması ile uyarı, iki boyutlu ve tek boyutlu model verilmiş hipokampal kültürlerin hazırlanmasını tarif desenli zamana göre değişen bir elektrik alanı oluşturur, manyetik alan,5, 20, 21.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvan işlemeyi kapsayan Prosedürler Weizmann Bilim Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve uygun İsrail hukuk kurallarına uygun olarak yapıldı. Weizmann Enstitüsü Laboratuarı Uluslar arası Hayvan Bakım Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiştir. Weizmann Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi hipokampal nöronlar ile yürütülen bu çalışmayı onayladı.

(2D) iki boyutlu ve tek boyutlu (1D) Hipokampal Kültürler hazırlanması 1.

  1. 2B kültürleri için lamelleri hazırlanması.
    1. 0.9 ml minimum temel ortam (MEM) + 3G, 0.05 ml cenin buzağı serumu (FCS), 0.05 ml ısı ile inaktive edilmiş at serumu (HI HS) ve B27 takviyesi 1 uL: kaplama ortamı oluşan (PM) hazırlayın. Not: MEM + 3G MEM 1 x her 500 ml için içerir, gentamisin, 1 mL, stabilize L-glutamin 100x 5 mL (bakınız Malzemeler / Reaktifler) ve% 60 D 5 mL Tablosu - (+) - glikoz.
    2. oluşan borat tamponu hazırlayın: 200 ml iki kez damıtılmış su (DDW) içerisinde 1.9 g boraks (sodyum tetraborat dekahidrat) (60 ° C'de karıştırın) ve 200 mL DDW içinde 1.24 g borik asit. 1 M HCI kullanılarak pH 8.5 nihai çözelti titre edilir. Not: Nihai çözelti, 400 mL 0.1 M borat tamponudur.
    3. 2 saat boyunca% 65 nitrik asit içinde cam lamelleri bırakın. Mutlak analitik reaktif (ABS AR), etanol ile üç kez durulanır, ardından DDW içinde üç kez yıkayın.
    4. (Borat tampon maddesi içinde 5: 2 s, ve ardından 1 seyreltilmiş 1 ml poli-L-lisin,% 0.01 çözelti ile gece boyunca 24 oyuklu plakalar inkübe bırakın - 1 Bunsen brülör alevi ile kısa bir süre, iki ya da üç kez her lamel geçmek 0.1 M, pH 8.4). Daha sonra DDW içinde üç kez lamelleri yıkayın ve gece boyunca standart bir 37 ° C de, oyuk başına 1 ml PM ile,% 5 CO2 kuluçka bırakın.
  2. 1D kültürler için lamelleri hazırlanması.
    1. Temiz gr75 mL DDW, 25 ml% 25'lik amonyak çözeltisi ve 25 ml% 30 hidrojen peroksit içeren bir baz pirana çözeltisi içine daldırma ile lass lamelleri. ~ 50 ° C'de bir ısıtma plakası üzerinde cam kapak 30 dakika boyunca ve daha sonra nitrojen ile birlikte bir cam lamelleri kuru ile yer çözeltisi.
    2. birinci yerleştirme buhar veya püskürtmeyle kullanılarak altın (% 99.999) bir 30 tabakası tarafından takip 6 Â kalınlığa sahip ince bir krom filmi (% 99.999) ile kaplayın lamelleri.
      1. 0.05 bir püskürtme hızı elde etmek için 1 - A / S 2 E-profil ve bir vakum hedefi ile 260 l / s sistemi 2" boyutları ve 4" ile bir püskürtme makinesi kullanın. (RPM) başına 100 mermi - 0 dan gidebilecekleri bir rotasyon sahne kullanın. 750 Watt - 0 gücünü sputter bir doğru akım (DC) kullanın.
      2. 30 rpm'lik bir dönme kullanarak ve oda içinde 10 mTorr basıncında plazma elde etmek için 99,999% argon.
      3. yol açan, krom DC püskürtme gücünü B 40 ° C'de püskürtme tabancaları güç kaynağı İşlet -0.12 A / s kaplama oranı, 10 ° C sıcaklıkta DC B ~ 0.28 Â / sn giden altın için güç püskürtmeyle çökeltilmesi.
    3. 30 dakika boyunca ultrason kullanılarak 100 mL ABS AR etanol içinde 0.1 g 1-oktadekanetiol çözülür. daha sonra etanol ABS AR ve azot ile yıkayın ve bu çözelti 2 saat boyunca Cr-Au kaplı lamelleri.
    4. 700 rpm - 600 2 saat - 100 mL Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (D-PBS) bir tri-blok ko-polimer 3.5 g bir çözeltisi hazırlandı 1 karıştırma ile (Malzeme / Reaktifler İçindekiler'i bakınız). 1 saat boyunca çözelti içinde lamelleri. azot ile kuru lamelleri.
    5. Mekanik olarak biyo-ret tabaka 22 kazınarak istenilen desen etch. Kalem, bir aşındırma iğne ile değiştirilir bir kalem çizici kullanılarak yapın. altta yatan cam ulaşmak için metal katmanlar ile desen kaşı. Çoğaltılmış istenilen desen elde etmek için bilgisayar tarafından bu işlemi kontrol eder. Bu işlem tarafından oluşturulan Grafikleri göstermek olan Şekil 2 ve Şekil 3'te d.
    6. 100 ml D-PBS, 3.5 g tri-blok ko-polimeri, 35.7 mL / mL fibronektin ve 29 ul / ml laminin bir biyo-uyumlu bir tabaka hazırlanır.
      1. En az 10 dakika boyunca ultraviyole ışık lamelleri sterilize edin. hazırlanan biyo-uyumlu bir çözelti içinde bir gece boyunca lamelleri inkübe edin.
        NOT: biyo-uyumlu katman biyo-ret tabakası önceki adımda kapalı kazınmış olan sadece nereye oluşturacaktır.
      2. Ertesi gün yıkama On P-DBS ile iki kez lamelleri. gecede PM lamelleri inkübe edin. Lameller artık hücre kaplama için hazır.
  3. Daha önce 23, 24 kapsamlı yayınlanmıştır standart prosedürlere göre diseksiyon.
    1. Tipik olarak, gün E19 sıçan embriyolarından kısa özüt hipokamp veya korteks, olarak, ya da tipik olarak günde farelere, E17 23'ten,class = "xref"> 24.
    2. Kimin ipuçları yangın cilalı cam pipetler ile mekanik öğütüldükten 24, ardından 30 dk, - ilk 20 için papain çözüm hücreleri ayırmak.
      Not: Hücreler daha sonra genetik olarak modifiye edilmiş farelerden geliyorsa her embriyo doku olarak tüm işlem esnasında ayrı bir 1.5 ml plastik bir tüp içinde muhafaza edilmelidir.
    3. ekim önce tripan mavisi ile hücre sayımı.
      NOT: genetiği değiştirilmiş hayvanlar için sayım her embriyo için ayrı ayrı yapılmalıdır.
    4. oyuk başına 850,000 hücre 750,000 ve sıçan nöronlarının de 2B kültürleri, tohum fare nöronlar için. 1D için, oyuk başına 650,000 hücre tohum. lamel homojen kapsama sağlamak için tohumlama sonra biraz hemen plakayı sallayın.
  4. nöronal kültürlerin Bakım.
    1. orta (mL başına) oluşan (CM) değişen hazırlayın. 0.9 ml MEM + 3G, 0.1 mL HI HS, 10 uL uridin 100x ile 5-floro-2'-deoksiüridin (FUDR)
    2. 0.9 ml MEM + 3G ve 0.1 ml HI HS: Son (mL başına) oluşan ortamı (FM) hazırlayın.
    3. In vitro olarak 4 gün (DIV), sonra 1-1.5 ml CM ile PM değiştirin. 6 DIV anda, taze CM CM% 50 değiştirin. DIV 8 'de, her 2 günde bir FM% 50 değişim, ardından 1.5 mL FM ortamı, değiştirin. Yaklaşık bir hafta sonra spontan senkron aktivite ortaya çıkar.
  5. floresan boyalar ile birlikte nöron kültürlerinde spontan veya uyarılmış aktivitesinin görüntülenmesi.
    1. 50 ug kalsiyuma duyarlı fluoresan boya, bir çözelti hazırlayın 50 uL DMSO (dimetil sülfoksit) içinde (Malzeme / Reaktifler İçindekiler'i bakınız).
    2. Hücredışı kayıt solüsyonu (EM) (mM olarak), 10 HEPES, 4 KCI ihtiva eden hazırlama 2 CaCl2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glikoz, 45 sukroz (pH 7.4).
    3. 1 saat boyunca kalsiyuma duyarlı fluoresan boya çözeltisi 8 uL 2 mL EM nöronal kültür inkübe. Işıktan koruyunuz ve yavaşça homojen sağlamak için döndürmekhücrelere boyanın lı yayıldı.
    4. görüntüleme öncesi taze EM ile çözüm değiştirin. Floresan Görüntüleme, Şekil 4'te gösterilmiştir.
    5. Kalsiyum fluoresans görüntü (488 nm 'de uyarım pik, 520 nm dalga boyunda emisyon tepe) için optik filtrelerle bir flüoresans mikroskop görüntü, bakış alanı içinde (ROI), herhangi bir bölgesinde yoğunluğunu ölçmek yeteneğine sahip bir kamerayı ve yazılım kullanılarak mikroskop.

Kültürlerin 2. Elektrik Uyarımı

NOT: Elektrik stimülasyonu için temel kurulum Şekil 1'de gösterilmiştir. nöronal kültür yaklaşık 14 gün geliştirilmiş olan bir kapak kayma bir floresan mikroskobu altında bir Petri tabağına yerleştirilir. bir voltaj kültürün dışında konumlandırılmış banyo iki elektrot çiftleri üzerinden uygulanır ise nöronların elektriksel aktivitesi kalsiyuma duyarlı boyalar kullanılarak görüntülenir. elektrotları tarafından sürülür, çıkış bir çift kanal amplifikatör ile yükseltilir ignal jeneratör. Uyarılması için gerilim kontrolü, böylece basit bir vektör toplamını ve kombinasyonu sağlayarak, daha çok standart akım kontrolü 25, elektrik alan vektörleri, doğrudan tespit edilir, çünkü 26 tercih edilir. Bu gerilim kontrolü durum için tüm örnek üzerinde yapılabilir elektrik alanın bütünlüğü, dikkatli bir çek gerektirir. kullanarak voltaj kontrolü bakımı herhangi Şasi döngüleri oluşmasını önlemek için alınması gereken ve elektrik alanın homojenlik doğrulanması gerekir zaman (aşağıda 2.2 bakınız).

  1. homojen bir elektrik alanı ile elektrik stimülasyonu için paralel elektrot telleri bir çift kullanın.
    1. 0.005 '' (127 um) mertebesinde bir kalınlığı olan platinden yapılmış elektrotları kullanarak. 13 mm'lik lamelleri ile birlikte kullanıldığında, iki elektrot arasındaki mesafe yaklaşık 11 mm olduğundan emin olun ve elektrot yerleştirmekkültürünün üzerinde 1 mm.
      NOT: elektrot tutucu (Şekil 5A ve Şekil 6A) kullanmak politetrafloroetilen (PTFE) yapmak için. elektrotlar eklemek için PTFE ile dar delik delin. Elektrotlar maruz kalan en sonunda, çözelti ile temas asla böylece cihaz dışı çözelti daha yüksek olmalıdır. yalıtımı için, maruz kalabileceği elektrot potansiyel herhangi bir parçası üzerinde epoksi yapıştırıcı kullanılır.
    2. elektroliz önlemek için bir DC bileşenine sahip bir% 50 görev döngüsü ile bir kare dalga şekli kullanın. kültür yakmadan etkili uyarılmasını 10 us ve 4 ms arasında puls süresi değişir. Genlik ± 22 V (bakınız Şekil 5) arasında sırayla olduğundan emin olun. kare dalga elektrot paralel olarak bağlı bir osiloskop üzerine gözlenebilir.
      NOT: istenilen dalga kolay programlama, ticari bir dalga formu düzenleme yazılımı kullanmak için (Malzemeler listesini görmek       ). İstenilen dalga şekli grafiksel olarak girin ve dalga formu üretecine gönderin.
  2. Alan homojenliğini test etmek için bir prob elektrodu kullanın. Probun elektrotlar arasındaki alan içerisinde hareket etmesini sağlamak ve elektrik potansiyelini ölçmek için en az 1 mm x 1 mm'lik bir ızgarayı kullanın.
    1. Elektrik potansiyelini ölçün. kullanım figure-protocol-10198 Elektrik alanını hesaplamak için. Elektrotlardan birini referans elektrot olarak kullanın. Alanın uyarıcı süreler içinde homojen olduğunu doğrulamak için, 100 μs ila 4 ms arasındaki değişen darbe süreleri ile elektrik alanını ölçün (bkz. Şekil 5B , 100 μs darbe süresi örneği için).
      NOT: Darbe süresi 1 ms olduğunda, ölçülen bir elektrik alan homojenliğinin bir örneği için bkz. Şekil 5D .
  3. Daha karmaşık elektrik alan şekilleri üretmek için 2 dikey banyo elektrodu çifti kullanın ve(Şek. 6B bakınız) farklı yönlerde alan yönlendirmek mümkün. Elektrotların 2 çift cihaz kullanılır, ve elektrotlar her bir çifti üzerine sinyali iki ayrı osiloskoplarda gözlenecektir.
    1. birbirinden 11 mm - elektrotları kültür üzerinde ve 10 bir mesafede 1 mm yerleştirin. Her iki elektrot çiftleri (bir zemin bağlantısı var) yüzen, ve elektrotlar her set arasında bir direnç ölçüm ve elektrotların her arasındaki kısa devre olmaması doğrulayarak bir ortak bir zemin yok olduğundan emin olun. Kontrol ederek (örneğin vb osiloskop, amplifikatörler, sinyal verici gibi) elektrotlara bağlanır kullanılan tüm ekipman, zemine göre kayan olduğundan emin olun tüm ekipman kayan ve referans elektrot hiçbirinin değecek herhangi topraklı ekipmanı.
    2. Alan yönünü değiştirmek için, res ile iki elektrot çifti beslenen gerilim genliğini değiştirmekbirbirine pect (bkz Şekil 7A). Örneğin, 0 ° kullanımı elektrot çifti V 22 ± paternine dik olan ve diğer elektrot için 0 V. 45 ° için, 15.6 2 + 15.6 ° 2 = 22 2 bir amplitüd vektör toplamı için, herhangi bir faz gecikmesi, elektrotların her iki çifti ile 15.6 V ± kullanımı.
    3. Bir dönme alanı elektrik alan döner sabit bir amplitüd üretilmesi için bir sinüs voltaj darbesinin tek dalga biçimi ve iki elektrot çifti için bir kosinüs voltaj darbesinin tek dalga formunu kullanmak uygulamak için (bakınız ŞEKİL 6B).
      NOT: ± 22 bir elektrotta V ve diğer elektrotta ± 22 V bir kosinüs dalga bir devir ile bir sinüs dalgası bir devir kullanıldığında Şekil 6B'de görülebileceği gibi, vektör toplamı olan bir dönen elektrik alanıdır sinüs ve kosinüs dalgalarının aynı ve ± 22 V lik bir genlik ile çevrim süresi
  4. Chron ölçmek ve hesaplamak içinAynı kültürde dendritler vs nöronal kültüründe aksonların axie ve Rheobase aşağıdaki adımları uygulayın.
    1. 10 mm), hatlar (uzun ince (170 um üzerinde desenli bir 1D kültürü) ile) Malzemeler / Reaktifler Tablo tarif ve 1.5 de olduğu gibi, kalsiyum görüntülemesi için bir kalsiyuma duyarlı fluoresan boya kullanın. Kalsiyum duyarlı boya kültür uygulandı ve 45 dakika süre ile inkübe edilir. boya taze kayıt solüsyonu ile değiştirerek yıkanacaktır.
    2. sinaptik iletim etkisi olmadan, elektriksel uyarım doğrudan yanıt nüfus istatistiklerini elde etmek şebekeyi ayırın. Bunu yapmak için, bicuculline 40 uM, bloklar gama-aminobütirik asit-A inhibe edici etki (GABA A) reseptörleri, bir kombinasyonunu uygulamak 10 6-siyano-7-nitrokuinoksalin-2,3-dion uM (CNQX) , α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik (AMPA) ve kainat reseptörleri ve (2R) 20 uM amino-5-phosphonovale engellemekasitin (APV), bloke eden, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörleri. blokerler kayıt solüsyonu eklenir.
    3. 100 us ve 4 ms arasında zaman süreleri değişen 2.1 ve 2.3 de tarif edildiği gibi bir kare pulsu uygular. Sinyal osiloskopta gözlenebilir.
    4. Birkaç ROI'ler kalsiyum geçici yoğunluğunu izlemek üzere (1.5), bir görüntü elde etme programı ile, bir floresans mikroskobu kullanarak, bir kaç yüz nöronların içeren. saniyede en az 20 kare bir görüntü elde etme oranı kapasitesine sahip bir hassas EMCCD kamera kullanarak görüntü (Malzeme listesi), elde edin. ışık yoğunluğundaki değişim uyarıldı nöronların miktarı ile orantılıdır. yoğunluk nispi değişimi ile uyarılan nöronlar fraksiyonu tahmin.
    5. Her bir darbe süresi (4 ms ila 100 us) için, yoğunluğunda herhangi bir değişiklik (birkaç Volt) görülen bir voltajda başlangıç ​​elektrotlara uygulanan gerilim genliğini değiştirmek, inci(22 V ± kadar) bağlı uygulanan voltaj ile şiddetindeki değişiklikler doymuş e- gerilimi.
      Not: yoğunluk değişimi voltaj darbesinin her zaman süresi için uyarılması için uygulanan voltaj ile ilgili olarak, bir toplu Gauss 5 gibi dağıtılacaktır.
    6. Her süresince uygulanan gerilimin vs yoğunluğu için kümülatif Gauss dağılımı Fit ve bu uyum gelen Gauss ortalama ayıklamak.
      NOT: Bu ortalama nöronlar yanıt verdiği için temsili gerilimdir.
    7. Bu işlemin sonunda bu nöronların yanıt verdi, her uyarım süresi için bir ortalama gerilim elde. Güç-Süresi eğrileri çizmek için süre ve güçlü çiftlerini kullanarak (bakınız Şekil 7).

Kültürlerin 3. Manyetik Uyarım

Not: Manyetik uyarılması için temel kurulum, Şekil 2'de gösterilmiştir. Sağ üstte gösterilirNöronlarda kalsiyum duyarlı boyaların imgesinde kullanılan inverted fluorescence mikroskopu. Manyetik bobin (mavi daireler) nöronal halka kültürünün (mavi çizgi) üzerinde 5 mm'lik konsantrik olarak konumlandırılmıştır. Petri kabının çevresindeki bir başlatma bobini (kırmızı daire), manyetik darbe tarafından indüklenen voltajı izler. Sol üstte, manyetik uyarıcının (MS) bobininin ölçülen dinamikleri, başlatma bobinden entegre edildiği gibi 5.000 kV'lık bir kapasitör voltaj yüküyle gösterilmektedir. İndüklenen elektrik alanı (14 mm'lik bir halka yarıçapı için hesaplanmıştır), yeşil olarak gösterilirken, manyetik alan mavi ile gösterilir. Alt kısmında nöronal kültürün resimleri gösterilmektedir. Sol altta, desenli 24 mm lamellerin parlak bir alan görüntüsü var. Beyaz alanlar nöronlardır. Fotoğraflı desen, farklı yarıçaplara sahip konsantrik halka kültürlerinden oluşur. Sağ alt kısımda, halkaların kısa bir bölümüne zum yaparak bireysel nöronlar gösteriliyor. Bir ölçek için yüzüklerin genişliğiinci yaklaşık 200 um'dir.

  1. 1D kültür uyarılması için dairesel bir halka şeklinde nöronlar büyütün (1.2.5 tarif edildiği gibi muamelesi). ince (170 um) üzerinde desenli bir 1D kültür, uzun (10 mm) hatları ile (bölüm 1.5'de anlatıldığı gibi) kalsiyum görüntülemesi için bir kalsiyuma duyarlı fluoresan boya kullanın.
    1. dairesel bir manyetik bobin kullanarak ve bir Petri tabağına bobinle altında ve eş yaklaşık olarak 5 mm yerleştirin. 5 kV maksimal voltaj ile yüklü bir ev yapımı veya ticari MS tarafından tahrik edilen L bir indüktans = 90 mH ile yaklaşık 30 mm (iç çap, 46 mm dış çapı), bobinin özel bir bobin kullanın.
    2. manyetik olarak nöronal kültürleri canlandırmak için yüksek akım-yüksek gerilim anahtarını kullanarak bir iletken bobin aracılığıyla yüksek gerilim ve akım deşarj edin. 5 kV - 1, yüksek bir gerilim elde etmek için, 100 mF gibi büyük bir kondansatör kullanılarak 21 de tarif edildiği gibi manyetik bir stimülatörü (MS) inşa edilebilir. Alternatif olarak, ticari olarak kullanmakMevcut MS (bakınız Malzeme / Reaktifler Tablo).
      Not: bir ev yapımı bobini 21 imal etmek için bir 0,254 mm kalınlığında ve 6.35 mm genişliğinde, polyester kaplı dikdörtgen bakır tel kullanınız. Epoksi, cam elyafları ve döküm ile izole özel yapılmış kare, teller açın (Malzeme / Reaktifler Tablo). Alternatif olarak (Malzemeler / Reaktifler Tablo) ticari olarak temin edilebilir batarya kullanılması.
  2. 2B kültürleri uyarmak için dönen manyetik alanlar kullanın.
  3. Şimdi, 2D kültürleri teşvik etmek döner manyetik alanları kullanın. şiddetleri ile bobin okuma doğrusal bir korelasyon göstermektedir etmek, farklı yoğunluklarda, çanak hiçbir kültürü ile TMS ateşleyin.
  4. Bir nöronal kültürü ile geçici kalsiyum kaydederken Sonra, geçici kalsiyum ve bobin hem kayıt sırasında yoğunlukları artırmayı TMS ateş etmeye. İlk olarak, ağ patlamaları Sho büyük kalsiyum geçici olarak gözlenenuld ile senkronize bobin TMS sivri almak değil. bir noktada, yoğunluğunu artırmaya devam eden kalsiyum geçici TMS ani senkronize hale başlar. Alternatif olarak, veya ek olarak, bir senkronize bir yanıt elde ettikten sonra, senkronizasyon TMS eşik seviyesinin belirlenmesi için kaldırılmıştır kadar yoğunlukları azalan başlar.
    NOT: Koşullar muhafaza kesinlikle tam hacmini her zaman aynı damarları ve kesin bobin pozisyonları ve yönelimleri kullanarak, kurulumları her biri için sabit olmalıdır.
    1. Bu nöronal kültüre paralel bir düzlemde ve kültüre göre sabit bir konumda olacak şekilde kayıt çanak tabanında alma bobini monte edin.
      NOT: Bu mıknatısa göre alma bobin konumlandırma bağımlılık kültürünün pozisyonuna sadık olmasını sağlar ve konumlandırma herhangi tutarsızlıklar pikap bobin okumaları üzerine önemsiz olacağı.
      1. iki bağımsız bobinleri kullanınbirbirine dik yerleştirilmiş (Şekil 8B), bir döner manyetik ve indüklenen elektrik alan oluşturmak için. kendi MS'e her bobin bağlayın. Uyarıcıları ~ 270 V / m arasında bir maksimum alanda (Şekil 10B) gerçek alan 270 derecelik tarayan bir döner manyetik alan içinde elde edilen, 90 ° (Şekil 10A) bir faz gecikmesi, benzer akımları tahliye emin olun.
      2. harici kayıt solüsyonu (EM) ile doldurulmuş bir küresel cam kap içinde nöronal kültür yerleştirin.
      3. Adım 2.4.4 tarif edildiği gibi kamera ile stimülasyonu (nöronların floresan değişimi) izleyin.
      4. Çapraz bobinler (Şekil 8B) olması durumunda, alma bobini paralel konumlandırmak ve nöronal kültür altında belirli bir mesafede. Dikkatle deneyler boyunca bu yapılandırmayı sürdürmek.
  5. analitik 1D ayarlaya için elektrik alanı hesaplayınEmax indüklenen elektrik alanının maksimum genliği ve yarıçapı r olan halkaların teğet olan Emaks = k, 1 Br ile tion. B manyetik dalga amplitüdü ve k, 1 alma bobini (Şekil 8A) kullanılarak ölçülebilir bir boyutsal orantı sabitidir.
  6. Sayısal olarak elektrik alanı 21 simüle etmek sayısal simülasyon paketi (Malzeme listesine bakın) kullanın.

Sonuçlar

Sunulan protokol nöronal kültürlerin kolay uygulamalar için elektron verir. Biz uyarılması için geliştirilmiş çeşitli yöntemler ile kombine edildiğinde, sağlıklı ve hastalıklı nöronlar 27 özelliklerini karşılaştırmak için bir fonksiyonu olarak kültürleri canlandırmak için en uygun yollar bulmak, böyle Chronaxie ve Rheobase 5 gibi bazı içsel nöron özelliklerin ölçümlerini yapar sağlar yapıları ve...

Tartışmalar

1D desen çeşitli uygulamalar için kullanılabilir önemli bir araçtır. Örneğin, nöronal kültürler 29 mantık kapıları oluşturmak ve daha yakın zamanda sıçan hipokampal nöronlarının 5 Chronaxie ve Rheobase ölçmek ve kıyasla Down sendromlu hipokampal nöronlar ateşleme aktivitesinin sinyal yayılma hızının yavaşlatılması için 1D model oluşturmanın kullandık vahşi tip (WT) hipokampal nöronlar 27. 1D desen için öneri...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Yazarlar çok yararlı tartışmalar için Ofer Feinerman Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef ve Eitan Reuveny teşekkür ederim. Yazarlar teknolojinin erken sürümlerini geliştirmek için Ilan Breskin ve Jordi Soriano teşekkür ederim. Yazarlar teorik kavramlarla yardım Tsvi Tlusty ve Jean-Pierre Eckmann teşekkür ederim. Bu araştırma Minerva Vakfı, Bilim ve Teknoloji, İsrail, Bakanlığı tarafından ve İsrail Bilim Vakfı hibe 1320-1309 ve Bi-Ulusal Bilim Vakfı hibe 2008331 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
APVSigma-AldrichA8054Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 suppGibco17504-044Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicucullineSigma-Aldrich14343Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)Sigma-AldrichS9640Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acidFrutarom LTD5550710Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 MFluka 21098Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQXSigma-AldrichC239Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOLCOMSOL IncMultiphysics 3.5Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 MSigma-Aldrich65146Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBSSigma-AldrichD8537Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS)Gibco12657-029Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
FibronectinSigma-AldrichF1141Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AMLife technologiesF14201Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDRSigma-AldrichF0503Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
GentamycinSigma-AldrichG1272Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100xGibco35050-038Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 MSigma-AldrichH0887Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HSBI04-124-1APlating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 MMerck1049361000Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin Sigma-AldrichL2020Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1Gibco21090-022Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 MSigma-AldrichM1028Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 MBio-Lab19030591Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
OctadecanethiolSigma-Aldrich01858Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF PrillBASF Corparation 50475278Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution Sigma-Aldrich P47075Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 MSigma-AldrichS1888Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol Sigma-Aldrich1858Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINESigma-AldrichU3750Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machineAJA International, IncATC Orion-5Series coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter Hewlett Packard HP 7475AEtching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires A-M Systems, Carlsborg WA767000Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generatorBKPrecision4079Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
AmplifierHomemadeVoltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supplyMatrix MPS-3005 LK-3 Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulationMagstim, Spring Gardens, UKRapid 2Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
EpoxyCognisVersamid 140Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
EpoxyShellEPON 815 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,  Carlsborg WA 767000Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coilHomemadeMagnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SWB&K Precision Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897AndorSensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

Referanslar

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez, ., Tlusty, M., T, E., Moses, Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 123n ronal a larelektrikli uyar mmanyetik stim lasyonChronaxieRheobasekalsiyum g r nt lemedesenli k lt rler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır