Excitação externa de Neurônios Usando Campos Elétricos e Magnéticos em One e culturas bidimensionais

Resumo

culturas neuronais são um bom modelo para o estudo de técnicas emergentes de estimulação do cérebro através de seus efeitos sobre os neurônios individuais ou uma população de neurônios. Aqui apresentados são diferentes métodos para a estimulação de culturas neuronais modeladas por um campo eléctrico produzido directamente por eléctrodos de banho ou induzida por um campo magnético variável no tempo.

Resumo

Um neurónio irá disparar um potencial de acção, quando o seu potencial de membrana excede um determinado limiar. A actividade típica do cérebro, isto ocorre como resultado de entradas químicos às suas sinapses. No entanto, os neurônios também pode ser excitado por um campo eléctrico imposto. Em particular, aplicações clínicas recentes ativar os neurônios, criando um campo elétrico externo. Por isso, é de interesse para investigar como o neurônio responde ao campo externo eo que faz com que o potencial de ação. Felizmente, a aplicação precisa e controlada de um campo eléctrico externo é possível que as células neuronais embrionárias que são excisados, dissociadas e cultivadas em culturas. Isso permite que a investigação dessas questões em um sistema altamente reprodutível.

Neste artigo algumas das técnicas utilizadas para aplicação controlada de campo elétrico externo em culturas neuronais são revistos. As redes podem ser unidimensional, ou seja padronizado em lineaformas R ou deixadas a crescer em todo o plano do substrato, e, assim, bidimensional. Além disso, a excitao pode ser criada por aplicação directa do campo eléctrico através de eléctrodos imersos no fluido (eléctrodos de banho) ou através da indução do campo eléctrico utilizando o criação remota de impulsos magnéticos.

Introdução

A interacção entre os neurónios e os campos eléctricos externos tem implicações fundamentais, bem como os práticos. Embora seja conhecido desde os tempos de Volta que um campo eléctrico aplicado externamente pode excitar tecido, os mecanismos responsáveis para a produção de um potencial de acção resultante em neurónios são apenas recentemente começando a ser desvendado ^{1, 2, 3, 4.} Isto inclui encontrar respostas a perguntas sobre o mecanismo que causa despolarização do potencial de membrana, o papel das propriedades da membrana e de canais iônicos, e até mesmo a região do neurônio que reage ao campo elétrico ^{2, 5.} Terapêutico neuro ^{6, 7, 8, 9,}

A medição da interação dentro do cérebro in vivo acrescenta um componente importante a esta compreensão, mas é dificultada pela imprecisão e baixa controlabilidade das medições dentro do crânio. Em contraste, as medições em culturas podem ser facilmente realizadas em alto volume com alta precisão, excelente desempenho sinal-ruído e um alto grau de reprodutibilidade e de controle. Usando culturas uma grande variedade de propriedades neuronais do comportamento coletivo da rede pode ser elucidada ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15, 16.} De igual modo, este sistema é bem controlada esperado ser altamente eficientes para elucidar o mecanismo pelo qual outros métodos de estimulação trabalhar, por exemplo, como a abertura do canal durante a estimulação óptica em neurónios optogenetically activas ^{17, 18, 19,} é responsável pela criação de potencial de acção.

Aqui, o foco está em descrever o desenvolvimento e compreensão das ferramentas que podem eficientemente excitam o neurônio através de um campo elétrico externo. Neste documento descreve-se a preparação de bidimensional e unidimensional culturas de hipocampo estampados, estimulação utilizando diferentes configurações e orientação de um campo eléctrico aplicado directamente por eléctrodos de banho, e, finalmente, a estimulação da bidimensional e modelado culturas unidimensionais por um tempo variando no campo magnético, o que induz um campo eléctrico^{5, 20, 21.}

Protocolo

Declaração de Ética: Os procedimentos envolvendo manuseio de animais foram feitos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Instituto Weizmann de Ciência e a lei israelense apropriada. O Instituto Weizmann é credenciado pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC). O Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal de Weizmann aprovou este estudo, conduzido com os neurônios do hipocampo.

1. Preparação de culturas hipocampais bidimensionais (2D) e unidimensionais (1D)

1. Preparação de lamínulas para culturas 2D.
   1. Preparar o meio de revestimento (PM) composto por: 0,9 mL de meio essencial mínimo (MEM) + 3G, 0,05 mL de soro fetal de vitelo (FCS), 0,05 mL de soro de cavalo inativado pelo calor (HI HS) e 1μL de suplemento B27. Nota: MEM + 3G contém para cada 500 mL de MEM x 1, 1 mL de gentamicina, 5 mL de L-glutamina estabilizada 100x (ver Tabela de Materiais / Reagentes) e 5 mL de 60% de D - (+) - glucose.
   2. Preparar tampão borato composto por: 1,9 g de bórax (tetraborato de sódio deca-hidrato) em 200 mL de água duplamente destilada (ADD) (mistura a 60 ° C) e 1,24 g de ácido bórico em 200 ml de DDW. Titula-se a solução final a pH 8,5 utilizando HCl 1 M. Nota: A solução final é de 400 ml de 0,1 M tampão de borato.
   3. Imergir lamelas de vidro em ácido nítrico a 65% durante 2 h. Lavar três vezes em DDW, seguido por três lavagens com reagente analítica absoluta (ABS AR) etanol.
   4. Passar cada lamela rapidamente através da chama de um queimador de Bunsen duas ou três vezes por 1 - 2 s, e, em seguida, deixou-se incubar durante a noite em placas de 24 poços com uma solução a 0,01% de poli-L-lisina ml diluída 1: 5 em tampão de borato ( 0,1 M, pH 8,4). Em seguida, lavar lamelas em DDW três vezes e deixar com um PM mL por poço num padrão de 37 ° C, 5% incubadora de CO ₂ durante a noite.
2. Preparação de lamelas para culturas 1D.
   1. Limpe glamelas lass por imersão em uma solução de base piranha consistindo de 75 mL de DDW, 25 mL de solução de amoníaco a 25% e 25 mL de 30% de peróxido de hidrogénio. solução lugar com as lamelas de vidro sobre uma placa de aquecimento a ~ 50 ° C durante 30 min e, em seguida, secar a lamelas de vidro com azoto.
   2. lamelas de revestimento primeiro por uma película fina de crómio (99,999%) de 6 de espessura, seguida por uma camada de 30 Å de ouro (99,999%), usando qualquer um de vapor ou deposição por pulverização catódica.
      1. Para conseguir uma taxa de pulverização catódica de 0,05-1 a / s usar uma máquina de pulverização catódica com 2 E-vigas e um sistema de vácuo de 260 l / s com alvo tamanhos 2" e 4" . Use uma etapa de rotação que pode ir de 0 - 100 rotações por minuto (RPM). Use uma corrente contínua (DC) por pulverização catódica poder de 0 - 750 Watts.
      2. Usar uma rotação de 30 rpm e árgon 99,999% para obter plasma a 10 mTorr pressão na câmara.
      3. Operar a fonte de alimentação dos canhões de pulverização de 40 W de energia DC de descarga eléctrica durante o cromo, levando a ~ 0,12 Å / s taxa de cobertura, e a 10 W DC sputter poder para o ouro, levando a ~ 0,28 Å / s.
   3. Dissolver 0,1 g de 1-octadecanotiol em 100 mL de etanol ABS AR utilizando ultra-som durante 30 min. Colocar lamínulas revestidas de Cr-Au durante 2 h nesta solução, em seguida, lavar com etanol ABS AR e secar com azoto.
   4. Preparar uma solução de 100 mL de solução salina tamponada com fosfato Dulbecco (D-PBS) e 3,5 g de um copolímero tribloco (ver Tabela de Materiais / Reagentes ) por agitação durante 1 - 2 h a 600-700 rpm. Coloque lamínulas na solução por 1 h. Seque lamínulas com nitrogênio.
   5. Mecanicamente gravar o padrão desejado arranhando a camada de bio-rejeição ²² . Faça isso usando um plotter caneta, onde a caneta é substituída por uma agulha de gravação. Raspe o padrão através das camadas de metal para alcançar o vidro subjacente. Controle este processo por um computador para conseguir um padrão replicado desejado. Padrões formados por este processo são d na Figura 2 e na Figura 3.
   6. Prepara-se uma camada de bio-compatíveis de 100 ml de D-PBS, 3,5 g de tri-bloco de co-polímero, 35,7 uL / ​​mL de fibronectina e 29 ul / ml de laminina.
      1. Esterilizar lamelas em luz ultra-violeta durante pelo menos 10 min. Incubar lamelas na solução durante a noite bio-compatível preparado.
         NOTA: A camada de bio-compatível irá formar apenas quando a camada de bio-rejeição foi gravado fora no passo anterior.
      2. No próximo dia lavagem lamelas duas vezes com P-DBS. Incubar lamínulas em PM durante a noite. Lamelas estão agora prontos para revestimento celular.
3. Realizar dissecção de acordo com os procedimentos padrão que foram publicados anteriormente extensivamente ^{23, 24.}
   1. Em resumo, hipocampo extracto ou córtex de embriões de rato, tipicamente no dia E19, ou a partir de ratinhos, tipicamente no dia E17 ^23,class = "xref"> 24.
   2. Dissociar células primeiro em solução de papaína por 20 - 30 min, seguido por trituração mecânica ²⁴ com pipetas de vidro cujas pontas são fogo polido.
      NOTA: Se as células provenientes de murganhos geneticamente modificados, em seguida, o tecido de cada embrião deve ser mantida num tubo de plástico separada 1,5 mL ao longo de todo o processo.
   3. Contar as células com azul de tripano antes de semear.
      NOTA: Para os animais geneticamente modificados a contagem deve ser feita separadamente para cada embrião.
   4. Para culturas 2D, neurónios de rato de sementes em 750.000 e de rato em neurónios 850.000 células por poço. Para 1D, semear a 650.000 células por cavidade. Agitar ligeiramente placa imediatamente após a sementeira para assegurar a cobertura homogénea da lamela.
4. Manutenção das culturas neuronais.
   1. Prepare mudando médio (CM) composto de (por ml):. 0,9 mL de MEM + 3G, 0,1 mL de HI HS, 10 ul de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR) com 100x uridina
   2. Prepare meio final (FM) de composto (por ml): 0,9 mL de MEM + 3G e 0,1 mL de HI HS.
   3. Substituir PM com 1-1,5 mL CM após 4 dias in vitro (DIV). Às 6 DIV, substituir 50% do CM com CM fresco. No DIV 8, mudar o meio de 1,5 mL de FM, seguido de uma variação de 50% de FM a cada 2 dias. Depois de cerca de uma semana a actividade espontânea síncrono emerge.
5. Imagem da atividade espontânea ou evocada em culturas neuronais com corantes fluorescentes.
   1. Prepara-se uma solução de 50 ug de cálcio corante fluorescente sensível (ver Tabela de Reagentes Materiais /) em 50 mL de DMSO (sulfóxido de dimetilo).
   2. Preparar a soluo de registo extracelular (ME) contendo (em mM) 10 de HEPES, 4 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 139 de NaCl, 10 a D-glucose, 45 sacarose (pH 7,4).
   3. Incubar cultura neuronal em 2 mL de EM com 8 ul de solução de corante fluorescente sensível cálcio durante 1 h. Proteger da luz e rodar cuidadosamente para garantir Homogenpropagação ous do corante para as células.
   4. Substituir solução com EM fresco antes da imagiologia. A imagem fluorescente é demonstrado na Figura 4.
   5. Imagem num microscópio de fluorescência com filtros ópticos para imagiologia de fluorescência de cálcio (pico de excitação a 488 nm, pico de emissão a 520 nm), usando uma câmara e um software capaz de quantificar a intensidade de qualquer região de interesse (ROI) no interior do campo de visão de o microscópio.

2. Estimulação Elétrica de Culturas

NOTA: A configuração básica para a estimulação eléctrica é mostrada na Figura 1. Uma lamela de cobertura em que a cultura neuronal foi cultivado durante cerca de 14 dias é colocado numa placa de Petri com um microscópio de fluorescência. A actividade eléctrica dos neurónios é visualizada utilizando corantes sensível ao cálcio, enquanto é aplicada uma voltagem através de dois pares de eléctrodos de banho que está posicionado do lado de fora da cultura. Os eléctrodos são movidos por quantogerador ignal cuja saída é amplificado por um amplificador de dois canais. Controle de tensão de estimulação é preferido em relação ao controlo de corrente mais padrão ^{25, 26} porque os vectores de campo eléctrico são determinadas directamente, permitindo assim a adição de vectores simples e combinação. Isto requer uma verificação cuidadosa da uniformidade do campo elétrico, que pode ser realizada ao longo de toda a amostra para o caso de controle de tensão. Quando se utiliza o cuidado controle de tensão deve ser tomado para evitar quaisquer circuitos de terra e a homogeneidade do campo eléctrico deve ser verificado (ver 2.2 abaixo).

1. Para a estimulação eléctrica com um campo eléctrico homogéneo usar um par de fios de eléctrodos paralelos.
   1. Utilizar eléctrodos de platina com uma espessura da ordem de 0.005 '' (127? M). Quando utilizado com as lamelas de 13 mm, garantir que a distância entre os dois eléctrodos é de cerca de 11 mm, e posicionar o eléctrodos 1 mm acima da cultura.
      NOTA: Para fazer o suporte do eléctrodo (Figuras 5A e 6A) usar o politetrafluoretileno (PTFE). Perfurar orifícios estreitos através do PTFE para inserir os eléctrodos. O dispositivo deve ser mais elevada do que a solução extracelular de modo que a extremidade superior, em que os eléctrodos estão expostos, nunca entrar em contacto com a solução. Para isolamento, usar cola epóxi em qualquer parte dos condutores dos eléctrodos que pode ser expostas.
   2. Usar uma forma de impulso quadrado com um ciclo de trabalho de 50%, sem nenhum componente de DC para evitar electrólise. Variar entre a duração de impulso 10 us e 4 ms para causar estimulação eficaz sem queimar a cultura. Assegure-se que a amplitude é da ordem de ± 22 V (ver a Figura 5). O pulso quadrado pode ser observado num osciloscópio ligado em paralelo com os eléctrodos.
      NOTA: Para uma fácil programação de qualquer forma de onda desejada, use um software de edição de forma de onda comercial (ver lista Materiais ). Digite graficamente a forma de onda desejada e enviá-lo para o gerador de forma de onda.
2. Para testar a homogeneidade do campo usar um eléctrodo de sonda. Utilizar uma grelha de, pelo menos, 1 mm x 1 mm, para permitir que a sonda a ser movido na área entre os eléctrodos e medir o potencial eléctrico.
   1. Medir o potencial elétrico. Usar para calcular o campo elétrico. Usar um dos eléctrodos como um eléctrodo de referência. Medir o campo eléctrico com diferentes durações de pulso entre 100 uS a 4 ms (ver Figura 5B para um exemplo de 100 uS duração do pulso) para verificar que o campo é homogéneo dentro da gama de durações estimulantes.
      NOTA: Ver Figura 5D para um exemplo de um campo eléctrico homogeneidade medido quando a duração do impulso era de 1 ms.
3. Utilizam-se 2 pares perpendiculares de eléctrodos de banho para a produção de formas mais complicadas de campo eléctrico, e aser capaz de orientar o campo em diferentes direcções (ver Fig. 6B). O dispositivo com 2 pares de eléctrodos será utilizado, e o sinal em cada par dos eléctrodos vai ser observada em dois osciloscópios separadas.
   1. Posicionar os eléctrodos de 1 mm acima da cultura e, a uma distância de 10 - 11 mm um do outro. Certifique-se que ambos os pares de eletrodos são flutuante (não têm ligação à terra), e não têm qualquer fundamento comum medindo a resistência entre qualquer conjunto de eletrodos e verificação de ausência de curtos-circuitos entre qualquer um dos eletrodos. Verificar que todo o equipamento utilizado, o qual está ligado aos eléctrodos (tais como os osciloscópios, os amplificadores, os geradores de sinais, etc.) é flutuante em relação à terra, verificando que todos os equipamentos sejam flutuantes e que nenhum dos eléctrodos de referência está a tocar qualquer equipamento ligado à terra.
   2. Para mudar a orientação do campo, variar a amplitude da tensão de alimentação para os dois pares de eléctrodos com resEntre si (ver Figura 7A ). Por exemplo, para 0 ° usar ± 22 V no par de eléctrodos que são perpendiculares ao padrão e 0 V para o outro eléctrodo. Para 45 °, utilizar ± 15,6 V em ambos os pares de eléctrodos sem fase lag, para uma amplitude vector soma de 15,6 ² +15,6 ² = 22 ² .
   3. Para aplicar um campo rotativo, use uma única forma de onda de um pulso de tensão senoidal e uma única forma de onda de um impulso de tensão de coseno para os dois pares de eletrodos para produzir um campo elétrico de rotação de amplitude fixa (veja a Figura 6B ).
      NOTA: Como pode ser visto na Figura 6B , quando se utiliza um ciclo de uma onda sinusoidal com ± 22 V num eléctrodo e um ciclo de uma onda coseno com ± 22 V no outro eléctrodo, a soma vectorial é um campo eléctrico rotativo com A duração do ciclo igual às ondas seno e coseno, e com uma amplitude de ± 22 V.
4. Para medir e calcular ChronAxie e reobase de axónios na cultura neuronal vs dendritos na mesma cultura executar as seguintes etapas.
   1. Utilizar um corante fluorescente sensível cálcio para imagiologia de cálcio, como descrito na tabela de materiais / Reagentes e 1,5) com uma cultura 1D modelado na fina (170 um), 10 mm) de comprimento linhas (. Cálcio corante sensível será aplicado à cultura e incubou-se durante 45 minutos. O corante será lavada, substituindo com uma solução de gravação fresco.
   2. Desligue a rede para obter estatísticas populacionais da resposta direta à estimulação elétrica, sem o efeito da transmissão sináptica. Para fazer isso, aplicar uma combinação de 40 uM de bicuculina, que bloqueia os receptores a acção inibidora de ácido gama-aminobutírico-A _(GABAA), 10 uM de 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2.3-diona (CNQX) , para bloquear o α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolopropiónico (AMPA) e cainato e 20 uM de (2R) -amino-5-phosphonovaleácido ric (APV), que bloqueia o N-metil-D-aspartato (NMDA). Os bloqueadores vai ser adicionada à solução de gravação.
   3. Aplicar um pulso quadrado, conforme descrito em 2.1 e 2.3 com diferentes durações de tempo entre 100 ms e 4 ms. O sinal pode ser observado no osciloscópio.
   4. Usar um microscópio de fluorescência com um programa de aquisição de imagem (ver 1.5) para monitorar a intensidade dos transientes de cálcio em vários ROIs, contendo cada um a algumas centenas de neurónios. Adquirir imagens usando uma câmera EMCCD sensíveis (ver lista de materiais), capazes de uma taxa de aquisição de imagem de pelo menos 20 quadros por segundo. A alteração na intensidade da luz é proporcional à quantidade de neurónios que foram estimuladas. Estimar a fracção de neurónios estimuladas usando a mudança relativa na intensidade.
   5. Para cada duração de impulsos (100 uS a 4 ms), alterar a amplitude da tensão aplicada aos eléctrodos a partir de uma tensão onde nenhuma mudança na intensidade é visto (alguns volts), para the tensão, onde as alterações na intensidade devido à tensão aplicada tem saturado (até ± 22 V).
      NOTA: A mudança de intensidade irá ser distribuído como um cumulativa Gaussiana ⁵ com respeito à tensão aplicada para a estimulação para cada tempo de duração do impulso de tensão.
   6. Encaixar uma distribuição de Gauss acumulado para a intensidade versus a voltagem aplicada para cada duração e extrair a média de Gauss deste ajuste.
      NOTA: Esta média é a tensão representante para que os neurônios respondeu.
   7. No final deste processo de obtenção para cada período de estimulação de uma tensão média para que os neurónios respondeu. Use esses pares de durações e forças para traçar as curvas força-duração (ver Figura 7).

3. Estimulação Magnética das Culturas

Nota: A configuração básica para a estimulação magnético é mostrado na Figura 2. No topo direito é mostradoum microscópio de fluorescência invertido que é usado para corantes sensíveis imagem de cálcio nos neurónios. A bobina magnética (círculos azuis) está posicionado cerca de 5 mm acima de forma concêntrica um anel cultura neuronal, (contorno azul). Uma bobina de recolha (círculo vermelho), na circunferência da placa de Petri monitora a tensão induzida pelo impulso magnético. Na parte superior esquerda está mostrado a dinâmica de medição da bobina de estimulador magnico (MS) com uma carga de tensão do condensador de 5,000 kV, como integrado a partir da bobina de recolha. O campo eléctrico induzido (calculado para um raio de anel de 14 mm) é representado em verde, enquanto o campo magnético é mostrado em azul. Na parte inferior são mostradas as imagens da cultura neuronal. No canto inferior esquerdo é uma imagem de campo claro de uma lamela padronizada de 24 mm. As áreas brancas são os neurónios. O padrão consiste de culturas fotografado anéis concêntricos com diferentes raios. Na parte inferior direita é um zoom para um segmento curto dos anéis, mostrando os neurónios individuais. Para uma escala, wid dos anéisth é cerca de 200 um.

1. Crescer os neurónios em um padrão de anel circular (gravado como descrito em 1.2.5) para a estimulação cultura 1D. Utilizar um corante fluorescente sensível cálcio para imagiologia de cálcio (como descrito na secção 1.5), com uma cultura 1D modelado na fina (170 um), (10 mm) de linhas longas.
   1. Usar uma bobina magnética circular e posicionar uma placa de Petri de aproximadamente 5 mm abaixo e concêntricos com a bobina. Utilizar uma bobina de costume (diâmetro interno, diâmetro externo de 46 mm) da bobina de aproximadamente 30 mm com uma indutância de L = 90 mH accionado por um MS caseiras comerciais ou carregados com uma voltagem máxima de 5 kV.
   2. Descarregar uma alta tensão e a corrente através de uma bobina de condução através de um interruptor de alta corrente de alta voltagem para estimular magneticamente culturas neuronais. O estimulador magnico (MS) pode ser construído como descrito em ^21, utilizando grandes condensadores, da ordem de 100 mF, para obter uma alta voltagem de 1-5 kV. Alternativamente usar um comercialmenteMS disponível (ver Tabela de Materiais / Reagentes ).
      NOTA: Use um fio de cobre retangular revestido de poliéster de 0,254 mm de espessura e 6,35 mm de largura para fabricar uma bobina caseira ²¹ . Torne os fios em caixilhos feitos sob medida, isolados com fibras de vidro e moldados em epóxi (ver Tabela de Materiais / Reagentes ). Alternativamente, use bobinas disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais / Reagentes ).
2. Use campos magnéticos rotativos para estimular culturas 2D.
3. Agora, use os campos magnéticos rotativos para estimular culturas 2D. Incêndio do TMS sem cultura no prato, em intensidades diferentes, para mostrar a correlação linear da leitura da bobina com as intensidades.
4. Em seguida, enquanto registra transientes de cálcio com uma cultura neuronal, comece a disparar o TMS a intensidades crescentes enquanto registra os transientes de cálcio e a bobina. Inicialmente, as rajadas de rede observadas como grandes transientes de cálcio,uld não sincronizar com pegar picos bobina TMS. Continuando a aumentar a intensidade, em algum ponto, os transientes de cálcio começam a tornar-se sincronizado com os picos de TMS. Alternativamente, ou em adição, após obtenção de uma resposta sincronizado, começar a diminuir as intensidades até que a sincronização é abolida, para determinar o limiar de TMS.
   NOTA: As condições devem ser mantidas estritamente fixado para cada uma das configurações, usando o volume exato de cada vez, os mesmos navios e posições bobina exatas e orientações.
   1. Montar a bobina de recolha na base do prato de gravação de modo que ele está num plano paralelo à cultura neuronal e numa posição fixa com respeito à cultura.
      NOTA: Este assegura que a dependência do posicionamento da bobina de recolha em relação ao íman é fiel para a posição da cultura e que quaisquer discrepâncias no posicionamento será negligenciável sobre as leituras bobina de recolha.
      1. Use duas bobinas independentes que sãoposicionados perpendiculares uns aos outros (Figura 8B) para gerar um campo eléctrico e magnético induzido a rodar. Ligar cada bobina para as suas próprias MS. Assegure-se que os estimuladores de descarga correntes semelhantes a um atraso de fase de 90 graus (Figura 10A), resultando em um campo magnético rotativo que digitaliza 270 graus do espaço real em um campo máximo de ~ 270 V / m (Figura 10B).
      2. Posicionar a cultura neuronal dentro de um recipiente de vidro esférico preenchido com a solução de gravação externa (ME).
      3. Monitorar a estimulação (mudança na intensidade de fluorescência dos neurónios) com a câmara, conforme descrito no passo 2.4.4.
      4. No caso das bobinas cruzadas (Figura 8B), posicionar a bobina de recolha paralelo e a uma distância específica a seguir a cultura neuronal. Cuidadosamente manter esta configuração ao longo dos experimentos.
5. Calcular analiticamente o campo elétrico para Configura 1Dção por _Emax = k ₁ Br, onde E é o _máximo de amplitude máximo do campo eléctrico induzido e é dirigida ao longo da tangente dos anéis com raio r. B é a amplitude do impulso magnético e _um k é uma constante de proporcionalidade dimensional que pode ser medido usando a bobina de recolha (Figura 8A).
6. Use um pacote de simulação numérica (ver lista de materiais) para simular numericamente o campo elétrico ^21.

Resultados

O protocolo apresentado permite fácil padronização das culturas neuronais. Quando é combinado com vários métodos desenvolvidos para a estimulação, que permite fazer medições de alguns intrínsecas propriedades neuronais como chronaxie e reobase ^5, para comparar as propriedades dos neurónios saudáveis e doentes ^27, para encontrar formas ideais para estimular culturas como uma função de sua estrutura e muitos mais novas ab...

Discussão

Padrão 1D é uma ferramenta importante que pode ser usado para uma variedade de aplicações. Por exemplo, utilizamos padrões 1D para criar portas lógicas a partir de culturas neuronais ²⁹ e mais recentemente para medir o Chronaxie e Rheobase de neurônios do hipocampo de ratos ⁵ e a desaceleração da velocidade de propagação de sinal da atividade de disparo em neurônios do hipocampo de síndrome de Down em comparação com a Neurônios do hipocampo do tipo selvagem...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M	Fluka	21098	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4