צמיחה נדחית Assay העיכוב לכמת את ההשפעה של antimicrobials הנגזר חיידקים על תחרות

Summary

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Abstract

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

Introduction

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients ⁶. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community ⁶.

Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing ^3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another ¹. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community ⁷.

The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion ⁷.

Protocol

השיטה הבאה מותאמת ^7,8 לבחון זנים מתחרים עם זנים מייצרי מעכב.

הערה: פרוטוקול זה כרוך דור אירוסול עם תרבויות חיידקים. זה יכול להתבצע רק בתוך שטח כבוש עם יישום שיקולי בטיחות מקומית שאושרו. ריסוס של התרבות לצלחות אגרו בתוך ארון בטיחות ברמה 2 יהיה למזער זיהום של הצלחות אגרו ואת הסביבה המקיפה אותו. זה יהיה גם להגן על חוקר משאיפת אירוסול של החיידקים המרוססים, זהו חשש עיקרי אם החוקר משתמש ברמת בלימת 2 אורגניזמים. חייב להיות משוחק ציוד אישי הגנה מתאים. האזור שסביב בצלחת פטרי מכוסה הטוב ביותר עם רקמת הפנויה סופג. טיהור פוסט ספריי באמצעות אור UV מומלצת.

1. הכנת צלחות אגר

1. כן עירוי לב המוח (BHI) אגר ובהתאם manuההוראות של facturer.
2. חיטוי אגר BHI ב 121 ° C, 15 psi במשך 20 דקות, או על פי המלצות יצרן חיטוי, לעקר.
3. יוצקים 15 מ"ל aliquots של אגר BHI מעוקרים לתוך בצלחות פטרי סטרילית ולאפשר לו להגדיר.
   הערה: ודא כל צלחת אגרה לשמש בתוך assay המקור מאותו המניות של אגר וכי יש את אותה כמות של אגר בכל צלחת. זה מגביל את ההשתנות בחומרים מזינים זמינים ודיפוזיה מעכב בין צלחות המאפשרות השוואה.

2. הכנת סטרילי מרק

1. כן מרק BHI בהתאם להוראות היצרן.
2. הוסף 10 מ"ל aliquots של BHI ל -28 מ"ל בקבוקים אוניברסלי זכוכית.
3. חיטוי מרק BHI ב 121 ° C, 15 psi במשך 20 דקות, או על פי המלצות יצרן חיטוי, לעקר.
   הערה: ודא כי כל המרק בשימוש assay המקור מאותה אצווה של המרק AUToclaved בעת ובעונה אחת להגביל וריאציה בחומרים מזינים אשר יכול לגרום וריאציה בתוצאות.

3. בקבוק מאדה סטרילי הכנה (ים)

1. לפרק את בקבוק vapourizer.
2. ספריי חומר ניקוי פעיל משטח 5% דרך vapourizer לחסל מזהמים פנימיים, יש להשרות את הבקבוק vapourizer, המכסה vapourizer ב הסוכן ניקוי פעיל משטח 5% בין לילה.
   הערה: כפפות וציוד מגן אישי מתאים יש להשתמש במהלך הטיפול בו משטח חומר ניקוי פעיל.
3. יבש את מאדה, המכסה ובקבוקים מתחת למכסה המנוע לזרום אוויר סטרילי.
4. מלאו את הבקבוק עם אתנול 70%, לצרף vapourizer ולרסס כמה אתנול דרך vapourizer.
5. שים את המכסה על מאדה ולאחסן עם אתנול בתוך עד השימוש.
6. מיד לפני השימוש, בסביבה נקייה מחיידקים לשטוף את הבקבוק עם מרק BHI סטרילי ולרסס את מרק דרך vapourizer.
   הערה: פעולה זו מונעת AFF אתנולecting הבידוד מתווסף בקבוק בסעיף 6.3.

4. הכנת תרבות לילה החיידקים (הים)

1. Streak המתחרה ו מעכב זנים לצלחת אגר BHI סטרילית לדגור על 37 מעלות צלזיוס אירובית במשך כ 18 שעות (לילה).
   הערה: צלחת זו מייצרת מלאי של חיידקים שיכולים לשמש משכפל מרובה באותו השבוע, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס.
2. לחסן 10 מ"ל של BHI מרק סטרילית עם מושבה אחת של זן חיידקי נדרש המתחרה בתוך בקבוק אוניברסלי 28 מ"ל.
3. דגירת הבקבוק האוניברסלי על 37 מעלות צלזיוס אירובית לילה על ידי רועד ב 250 סל"ד ב שייקר מסלולית.

5. תרבות ספוט של מונעי-ייצור בודד

1. הכן את תרבות הלילה (ים) כמפורט בסעיף 4.
2. ודא צלחות אגרו יבשים לחלוטין, ללא עיבוי על המכסה, לפני החיסון (למשל על ידי דוגרי PLAte עבור 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס); זה מונע את הבידוד מלהתפשט פני הצלחת מאתר החיסון.
3. פיפטה 25 μl של התרבות לילה על גבי במרכז הצלחות אגרו. הימנע מדכא את הבוכנה פיפטה לחלוטין כדי למנוע בועות אוויר מפזרות תרבות ברחבי אגר.
4. אפשר התרבות להתייבש בטמפרטורת החדר כדי להגביל את התפשטות התרבות. דגירת הצלחות אגרו על 37 מעלות צלזיוס אירובית הלילה.

6. הכנת ריסוס הבידוד של הזנים מתחרים מבחן (ים)

1. הכן את תרבות הלילה כמפורט בסעיף 4. מדולל הקיפול 10 תרבות לילה במרק BHI להניב כ 4 x 10 ⁶ CFU מ"ל ^-1, ו השעיה של OD ₆₀₀ 0.3 ± 0.05.
   הערה: 10 דילול לקפל לא ייתן 4 x 10 ⁶ CFU מ"ל ^-1 עבור כל מיני חיידקים, לחשב את גורם לדילול הצורך על ידי התפשטות ציפוי דילולים סדרתי בין 1 x 10 -1 -1 x 10 ^-6.
2. יוצק את התרבות בדילול לתוך בקבוק מאדה בושם פלסטיק סטרילית.
   הערה: הנפח הכולל חייב להיות יותר מאשר הוא הכרחי עבור מספר צלחות אגר לרסס. כ 250 μl לכל צלחת מתאים בצלחת פטרי בקוטר 9 ס"מ.

7. צמיחה נדחית Assay העיכוב

1. רסס את התרבות דרך כל הבקבוקים המאדים כדי להבטיח שההתרבות טעונה מנגנון ספריי לפני הריסוס על אגר.
2. ממרחק של כ -15 ס"מ מעל אגר, לרסס כ 250 μl של התרבות מדולל (3 תרסיסים של מאדה טיפוסי 50 מ"ל) על פני השטח אגר כולו. דגירת הצלחות אגרו על 37 מעלות צלזיוס אירובית הלילה. חזור על צלחות אחרות עם אותו מספר התרסיסים.

8. פירוש תוצאות Assay עיכוב הצמיחה נדחות

1. מדוד את אזור עיכוב הצמיחה של competi מרוססטור זן (איור 1 א - ג, "X" כדי "X") במילימטרים, הפחתה בקוטר של המקום המרכזי של המפיק המעכב (איור 1 א - ג, "Y" כדי "Y").
   הערה: איור 1E מראה כיצד נתונים אלה אפשר היה להציג
2. רשום את ציון הבהירות עבור אזורים של עיכוב.
   הערה: זה מצביע על מידת העיכוב ציינה. דוגמאות מוצגות באיור 1 א - ד, זנים שיכולים לשמש סטנדרטיזציה מוצעים בסעיף נציג התוצאות. הסולם הבא יכול לשמש ניקוד בהיר: ציון בהירות של 0 לתאר אזור של עיכוב המלא של הצמיחה של מתחרת הזן. ציון של 1 לתאר אזור של עיכוב כמעט מוחלט של צמיחה, עם מושבות בודדות בלבד נוכחיות באזור סליקה. ציון של 2 לתאר אזור גלוי של צמיחה מופחתת, צמיחה בתוך אזור זה הוא conשוטף או ליד ומחוברות אבל מופחת בצפיפות על ידי> 50%. ציון של 3 לתאר הפחתת צמיחה מינימאלית בלבד, צמיחה היא ומחוברות מופחתות על ידי פחות מ -50%, אזור עדיין גלוי וניתן למדידה. ציון של 4 לתאר שום עכבות גלויות של צמיחה. ציון 5 לתאר כי הצמיחה של זן המתחרה הוגדלה ב הקרבה של מתח המבחן מייצר מעכב. ראה איור 1 עבור דוגמאות. ציונים אלה הם סובייקטיביים לנסיין.

9. משכפל

1. מבחנים חוזרים לפחות בשלושה עותקים ביולוגיים כדי לקבוע את השחזור של התוצאות שהושגו.
   הערה: אם משכפל מבוצעים בימים שונים, לקחת מידות וציון צלחות מייד לאחר הוצאתו דגירה, אז גם צלחות חנות ב 4 מעלות צלזיוס או לצלם באיכות גבוהה של צלחות לפני השלכת אותם. חפצים או צילומי צלחות מאפשר השוואה נוחה של תוצאות בין ימים שונים, tשלו חשוב במיוחד עבור מאשר ניקוד לשחזור פני ימים / ניסויים. עליך להיות מודע לכך אחסון של צלחות יש פוטנציאל לשנות את התוצאות.
   הערה: לקבלת צלחות מקום צילומים ברורות זקופה בלי המכסה שלהם על רקע שחור מט בשטח של אור מפוזר, להשתמש במצלמה ברזולוציה גבוהה (≥8 MP) מסוגל להתמקד בעצמים קרובים אל העדשה (מצב מאקרו). לחילופין, ישנם הדמיה ג'ל עם טרנס-נורת ה- מוגדר אור לבן יכול לייצר באיכות גבוהה, תמונות לשחזור מאוד.

תוצאות

תוצאות assay צריכות להיות נצפה כהבדל בזן עכברים המעולף המתחרה סמוך הבחין מרכזי המעכב לייצור זן (איור 1). ניתן לפרש הבדלים אלה מפני שהוא מעכב מלא (איור 1 א), עיכוב חלקי (איור 1B ו 1C), שום עכבות (1D איור) או קשר חיובי. המעבדה הנרחבת הזמינה זנים ס epidermidis Tü3298 וס epidermidis Rp62A, וס ' epidermidis Rp62A וס aureus ניומן שמש 1B דמויות 1D בהתאמה. אנו מציעים זנים אלה יכולים לשמש כדי לבדוק בפרוטוקול זה.

בהתאם מינים הנבדקים, עיכוב מלא ועיכוב חלקית הם ככל הנראה התוצאה של פפטידים מיקרוביאלית, אנטיביוטיקה או inhibito צמיחת diffusible האחר RS המיוצר על ידי זן מייצרי מעכב. עיכוב חלקי גם נקשר לזמינות מזין מופחת עבור זן מתחרה בשל ספיגת או sequestering של חומרי הזנה על ידי מעכב זן ^6.

השוואת הגודל של האזור של עיכוב בין בידודים מעכבים-ייצור השונים שנבדקו כנגד מתחרת הזן אותו מציינת הבדלים כל אחת מהפעולות הבאות: כמות מיקרוביאלית המיוצר על ידי הזן מייצרי המעכב; היכולת של המעכב כדי לנטרל באמצעות התקשורת; הסוג של מעכב הפיק את רמת ההתנגדות של זן מתחרה המעכבים שתופק. השוואת הגודל של האזור של עיכוב בין זנים מתחרים השונים שנבדקו נגד באותו הזן מייצרי המעכב מעידה על רמות ההתנגדות של הזנים המתחרה לבולמים שיופקו.

ithin-page = "1"> תוצאות ישתנו בהתאם לזן מעכבות משומשים זן מתחרה בשימוש. חזרות תוך שימוש באותו הזן מעכב ומתחרה רצויות אותו ציון הבהירות (בסעיף 8.2), זה מצביע על טכניקה טובה נעשית שימוש לאורך.

אם יישום עקבי של חיידקים התרחש הצלחות לא אמורות לשמש. לדוגמא, אם תרבות בדיקה המתחרה מדי לדלל את האזור של עיכוב יופיע גדול עם קצה מוגדר פחות ברור מאשר הוא ציין בדרך כלל (איור 2 א); זה ישפיע מהימנות של כל מדידות אזור השוואתיות. אם כתם הזן מייצר מעכב לא היה מיובש לחלוטין לפני דגירת הלילה, הזן המעכב צפוי להתפשט ולא ליצור נקודה ברורה (התרשים 2B), אשר בדרך כלל משפיעה מדידות אזור אלא גם יכול להשפיע על הניקוד הבהיר. אם הזן המתחרה הואלא רסס שווה זה יכול להוביל לפער אחיד של חיידקים (איור 2 ג). אם זן המתחרה מרוכז מדי יתכן כי הזן המתחרה עשוי לגדול על גבי הזן המעכב (איור 2 ג), ובמקרים קיצוניים זה יכול להוביל היפוך כמה מתפקידי זן מתחרה / מעכב.

איור 1:. הטווח של תוצאות איכותיות וכמותיים שניתן המתקבל assay עיכוב הצמיחה נדחה תוצאות עבור עיכוב הצמיחה יכול לנוע בין (א) עיכוב מלא (ציון של 0), (ב) עיכוב חלקי (ציון של 1) עיכוב חלקי, (ג) (ציון של 2) עד (ד) שום עכבות (ציון של 4). תוויות לציין את שולי הגידול של הזנים המעכבים (Y) והקצה החיצוני של העיכובאזורים (X). גודלו של האזור של מגוון עיכוב בין 0 מ"מ ליותר מ -10 מ"מ, כפי שמוצג (E), אשר מציגה את המידות של הצלחות שצולמו A, B, C ו- D תוצאות מוצגים עבור מבודד staphylococcal האחרון (א , C) או staphylococcal מעבדה הנפוץ מבודד ס epidermidis Tü3298 (מעכב) וס ' epidermidis Rp62A (המתחרה) (B), וס ' epidermidis Rp62A (מעכב) וס ' aureus ניומן (מתחרה) (D). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: דוגמאות של תוצאות לא עקביות עקב טכניקה גרועה תוצאות עלולות להיראות שונות מצפוי אם (א. ) זן מתחרה היה גם לדלל, (ב) הזן מעכב לא היה יבש לחלוטין לפני דגירה / צלחות לא היו יבש או (ג) אם זן המתחרה לא רוסס שווה התרכז מדי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

שלב קריטי של פרוטוקול תחרות מין חיידקים זה שמבדיל אותו מאחרים, הוא הדגיר הלילה של המעכב לבודד לפני התוספת של לבודד המתחרה. המתח המעכב דורש תקופת הצמיחה הזו כדי לייצר תרכובות מעכבות. כמו המתח המתחרה הוא מעולף על גבי אותו המדיום, שיטה זו מאפשרת לחוקר לבחון את מלוא הפוטנציאל של המתח מעכב להפריע צמיחה של הזן המתחרה. כתוצאה מכך, assay זה משקף את מה שקורה עם הטבע; אחד לבודד מוקם במלואה בתוך גומחה, והשני חייב להיות מסוגל לנטרל כל משתני מעכבות תוכל לפלוש הנישה בהצלחה.

ישנם שני חלקים לפרוטוקול זה כי הם ככל הנראה כדי לגרום תוצאות שגויות אם ביצע באופן שגוי. ראשית, עיקור שלם של בקבוקי מאדה יכול להציג זיהום חיידקים לתוך assay. Incubation של המרק נהג לשטוף את הבקבוק מאדה בשלב 3.6 בתוך כלי סטרילי ניתן להשתמש כדי לאשר בקבוקים עוקרו לחלוטין. שטיפות נוספות בפתרונות חיטוי, כגון Virkon, ניתן להשתמש לפני בכביסה ב חומר ניקוי פעיל שטח, כמתואר בשלב 3.2, אם נדרש עיקור נוסף.

בשלב שני שעלולות לגרום לתוצאות שגויות הוא הדילול של זן המתחרה (שלב 6.1). אם הדילול אינו אופטימלי, מדידות ברורות של עיכוב לא ניתן לקבוע בקלות. Assay זו הוטבה באמצעות מבודד אף שונה כמו מעכבים-ייצור זנים על פני מגוון רחב של גראם חיובי ומינים גראם שליליים לעומת ס aureus SH1000 כמו ^7,8 זן המתחרה. זה בהמשך נבדק באמצעות staphylococci coagulase השלילי השונה coagulase חיובי כמתחרת מעכבים-ייצור זנים. כאשר בודקים סוגים אחרים מאלה שתוארו לעיל כמתחרהזן, כמה אופטימיזציה של דילול עבור הבידוד עשוי להיות נחוץ.

אם ציוני בהירות להשתנות משמעותי בין חזרות, זה עשוי להיות נחוץ כדי לתקנן את בידוד הזן מתחרה על ידי הגדרת אותו צפיפות אופטית ספציפית. עם זאת, זה יגדיל את הזמן assay לוקח להקים, והוא צפוי להפחית את מספר הזנים אפשר לעבד לכל ניסוי. ראייה והתאמת התרבות כדי OD המתאים באמצעות תקן מק 'פרלנד עשויה לספק אלטרנטיבה מהירה.

מגבלה אחת של טכניקה זו היא שזה זה יכול להיות מיושם רק לחיידקים culturable. זו הסיבה מדוע מחקרים רבים משתמשים רצף 16S rRNA לחזות אינטראקציות הרחקה תחרותיות ^3,4,13. עם זאת, טכניקות גנטיות metagenomic יכול להבחין רק לחברי הקהילה ברמת המין, ו / או לא מדברים על וריאציה תכונה intraspecific בפרט. אפשר למסך את שיוכה של particulגן ar המקודד תכונה עם נוכחות או היעדר של ⁵ מינים של חיידקים, אך זה דורש ידע מראש של גן עשוי להיות מזוהה עם הרחקה של מינים.

שיקול בטיחות של טכניקה זו הוא כי, בשל הדור אירוסול של חיידקים, ניתן להשתמש בו רק במעבדות עם ארון בטיחות ברמה 2, או עם אמצעי בטיחות דומה. ישנן טכניקות חלופיות כדי לבדוק לתחרות בין בידודים המסבירים וריאצית תכונת intraspecific, ואינו מייצרים אירוסולים של חיידקים. שיטה אחת כזו היא assay אנטגוניזם סימולטני ^2. בשיטה זו, בידוד של תבדיד אחד משתרע על צלחת אגרה, וכן בידוד לבודד שני הוא הבחין או נדקר על גבי ברגע הראשון התייבש. זה יפיק בסביבה שבה הזנים נמצאים בתחרות ישירה (אנטגוניזם סימולטני), הן מתחרות לייצר תרכובות מעכבות ו scavenge מזינים ראשון. advantagדואר של assay עיכוב צמיחה נדחה על פני assay אנטגוניזם סימולטני הוא כי לבודד המעכב צריך תמיד את היתרון התחרותי של מוקמות באופן מלא לפני הפלישה של לבודד המתחרה. זהו מהורהר יותר של מה קורה בסביבה, כמו ברוב הנישות, לבודד אחד שיוקם לפני זן אחר הוא הוסיף, במקום שני מבודדים להתווסף באותו הזמן ^8.

חלופה נוספת להימנע דור אירוסול של חיידקים יהיה להוסיף המתחרה לבודדת אגר עליון, אשר יכולה להיות שפך ולא מרוססת על לבודד המעכב. עם זאת, היקף אגר העליון הוסיף היה צריך להיות כ 3 מ"ל כדי להבטיח אפילו כיסוי של הצלחת. בתוך הכרך הזה, לבודד המתחרה לא יהיה גדל באותו מדיה כמו לבודד המעכב, ולכן לא יכבד סובל מזינים מופחתים. המתחרה הייתה גם לא להיות בקשר ישיר עם כל תרכובות מעכבות until הם מתפזרים לתוך אגר העליון. כזה assay לא ניתן לתאר עיכוב נדחה או אנטגוניזם סימולטני.

שיטה דומה כבר השתמשה בעבר כדי להעריך את רמות התנגדות Bacitracin בקרב קליני ס aureus מבודד ^10. ההבדל העיקרי בין הפרוטוקול המתואר כאן וכי שתואר על ידי ^10, הוא הזנים המתחרים המסווגים רק האחרון כרגיש (להשלים בהירות inhibition- להבקיע 0) או עמידים (חלקיים ללא בהירות inhibition- להבקיע 1-5). את assay עיכוב צמיחה הנדחה יכול אפוא לשמש גם למסך רמות התנגדות ליצרני antimicrobials מסוים, או אפילו לחפש antimicrobials רומן פעיל נגד פתוגנים עמידים רבים-סמים.

הועלתה השערה כי microflora המארח יכול להיות מניפולציה כדי לחסל רצויה של לקהילת החיידקים ^9. יישום של corynebacteria או Staphylococcus epidermidis כבר הוכח לחסל ס קולוניזציה aureus ב nares ב חלק ניכר של האוכלוסייה ^11,12. מחקרים לתוך זנים ספציפיים שיכול להדיר אנשים רצויים תחרותית של הפלורה המארח, באמצעות טכניקות כגון זה המתואר כאן, ולכן עשויים להוביל רפוי בעתיד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion broth	Lab M	lab049	rich general purpose media
agar-agar	Merck Milipore	101614
Petri dishes	Sarstedt	82.1473.001
Plastic perfume vaporizer	not known	-	10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket
Universal bottles		no longer in production, alternative SLS BOT5006	28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap
Decon 90	Decon		surface active cleaning agent