Отложенный роста Анализ ингибирования для количественной оценки влияния бактерий, полученных Противомикробные по конкуренции

Резюме

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Аннотация

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

Введение

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients ⁶. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community ⁶.

Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing ^3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another ¹. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community ⁷.

The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion ⁷.

протокол

Следующий способ адаптирован к ^7,8 тестируемых штаммов конкурента штаммов ингибитора производства.

Примечание: Этот протокол включает в себя аэрозольную поколение с бактериальными культурами. Это может быть осуществлено только в замкнутых системах пространстве с реализацией на местном уровне утвержденных соображений безопасности. Опрыскивание культуры на чашках с агаром внутри шкафа безопасности 2 минимизирует загрязнение агара и окружающую среду. Это также позволит защитить исследователя от аэрозольной ингаляции распыленных бактерий, это является серьезной проблемой, если исследователь использует уровня удерживания 2 организмов. Соответствующие средства индивидуальной защиты должны носить. В районе, прилегающем Петри лучше всего покрыта одноразовой впитывающей ткани. Пост-спрей обеззараживание с помощью УФ-излучения рекомендуется.

1. Подготовка пластин агаре

1. Приготовьте сердца мозга настоя (BHI) агара в соответствии с МануИнструкции по дитель.
2. Автоклава агар BHI при 121 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 мин, или в соответствии с рекомендациями производителя автоклавные, стерилизовать.
3. Налейте 15 мл аликвоты стерилизованной BHI агар в стерильные чашки Петри и позволить ему установить.
   Примечание: Убедитесь, что каждый агаре пластина для использования в процессе этого анализа происходит из того же запаса агара и что существует такое же количество агара в каждой пластине. Это ограничивает изменчивость доступных питательных веществ и диффузии ингибитора между пластинами, позволяющими сопоставимость.

2. Подготовка Стерильный Бульон

1. Приготовьте бульон BHI в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Добавляют 10 мл аликвоты BHI до 28 мл стеклянных флаконах универсальные.
3. Автоклава бульон BHI при 121 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 мин, или в соответствии с рекомендациями производителя автоклавные, стерилизовать.
   Примечание: Убедитесь, что все бульоном, используемый в анализе происходит из той же самой партии бульона Autoclaved в то же время, чтобы ограничить изменение в питательных веществ, которые могут вызвать изменение в результатах.

3. Подготовка Стерильный Vaporizer бутылки (ы)

1. Разберите бутылку vapourizer.
2. Спрей 5% поверхности агента активного чистящего через vapourizer устранить внутренние загрязнители, смочите vapourizer бутылки, крышки и vapourizer в поверхностно-активного моющего средства 5% в течение ночи.
   Примечание: Перчатки и соответствующие средства индивидуальной защиты следует использовать при обращении с поверхностно-активное моющее средство.
3. Сушат испаритель, крышку и бутылки под капотом стерильной потока воздуха.
4. Заполните бутылку с 70% -ным этанолом, vapourizer и снова прикрепить спрей некоторые из этанола через vapourizer.
5. Положите крышку на испаритель и хранить с этанолом внутри до использования.
6. Непосредственно перед применением, асептически промыть бутылку стерильной BHI бульона и распылить бульон через vapourizer.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это предотвращает AFF этанолпрививочный выполнения над каждым добавляемые к бутылке в разделе 6.3.

4. Подготовка ночной культуры Бактериальный (ы)

1. Подряд конкурент и ингибитор штаммов на стерильную BHI агаром и инкубировали при 37 ° С в аэробных условиях в течение приблизительно 18 ч (в течение ночи).
   Примечание: Эта пластина создает запас бактерий, которые могут быть использованы для нескольких повторах в пределах одной недели при хранении при 4 ° С.
2. Инокулируйте 10 мл стерильной BHI бульона с одной колонии требуется конкурента бактериального штамма в пределах 28 мл универсального бутылки.
3. Выдержите универсальную бутылку при 37 ° C в течение ночи аэробно при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту в орбитальном шейкере.

5. Пятно культура Ингибитор-производства изолята

1. Подготовка ночной культуры (ы), как описано в разделе 4.
2. Убедитесь , что агаром полностью высохнут, без конденсации на крышке, перед посевом (например , путем инкубирования плат.е в течение 60 мин при 37 ° С); это предотвращает прививочный материал от распространения через пластину с сайта инокуляции.
3. Пипетка 25 мкл ночной культуры на центр чашки с агаром. Избегайте полностью удручает пипетки поршень предотвращает образование воздушных пузырей, которые распыляют культуры через агар.
4. Дайте культуру высохнуть при комнатной температуре, чтобы ограничить распространение этой культуры. Инкубируйте агаром при 37 ° С в аэробных условиях в течение ночи.

6. Подготовка спрей инокулята испытания Конкурент Strain (s)

1. Подготовка ночной культуры , как описано в разделе 4. Развести ночной культуры в 10 раз в BHI бульона с получением примерно 4 × 10 ⁶ КОЕ мл ^-1, и суспензию OD ₆₀₀ 0,3 ± 0,05.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 10 - кратное разведение не даст 4 × 10 ⁶ КОЕ мл ^-1 для всех видов бактерий, рассчитать необходимый коэффициент разбавления путем распространения металлизированный серийных разведений от 1 х 10 -1 -1 · 10 ^-6.
2. Вылейте разбавленную культуру в стерильный пластиковый флакон духов испарителем.
   Примечание: Общий объем должен быть больше, чем необходимо для количества чашек с агаром распыляется. Примерно 250 мкл на чашку подходит для 9 см диаметр чашки Петри.

7. Отложенный роста Анализ ингибирования

1. Распылить культуру через каждый из испарителей бутылок, чтобы гарантировать, что культура загружается в механизм распыления перед распылением на агар.
2. С расстояния примерно 15 см над агара, распылить приблизительно 250 мкл разведенной культуры (3 спреи типичного 50 мл испарителем) во всей поверхности агара. Инкубируйте агаром при 37 ° С в аэробных условиях в течение ночи. Повторите эти действия для других пластин с тем же числом спреев.

8. Интерпретация результатов будущих периодов роста Анализ ингибирования

1. Измерьте торможение роста зоны распыленного конкурентор деформации (рис 1А - С, "Х" к "Х") в миллиметрах, вычитая диаметр центрального пятна ингибитора-производителя (Рисунок 1A - C, "Y" к "Y").
   Примечание: На рисунке 1E показано , как можно было бы представить эти данные
2. Запишите счет ясности для зон ингибирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это указывает на степень ингибирования наблюдаемой. Примеры приведены на рисунке 1А - D, штаммы , которые могут быть использованы для стандартизации предложены в разделе результатов репрезентативной. Следующая шкала может быть использована для ясности скоринг: ясность оценка 0, чтобы описать зону полного ингибирования роста Конкурент штамма. Оценка 1 для описания зоны практически полного ингибирования роста, лишь отдельных колоний, находящихся в зоне очистки. 2 балла для описания видимой зоны пониженной роста, рост в пределах этой зоны консвободно или вблизи конфлюэнтного, но уменьшается плотность на> 50%. Счет 3 описать лишь минимальное снижение роста, рост сливная и снижаются менее чем на 50%, зона по-прежнему видна и измеримыми. 4 балла не описать никакого видимого ингибирования роста. Балл 5, чтобы описать, что рост штамма конкурента был увеличен в непосредственной близости от испытуемого ингибитора-продуцирующего штамма. На рисунке 1 примеры. Эти оценки носят субъективный характер к экспериментатору.

9. Реплицирует

1. Повторные анализы по крайней мере в трех экземплярах биологической для определения воспроизводимости полученных результатов.
   Примечание: Если дублированные выполняются в разные дни, проводить измерения и оценка пластины немедленно после извлечения из инкубации, а затем хранить или пластины при 4 ° С или принимать высококачественные фотографии пластин, прежде чем выбросить их. Хранение или фотографии пластин позволяет легко сравнивать результаты между различными дней, тего особенно важно для подтверждения воспроизводимый скоринг через дней / экспериментов. Имейте в виду, что хранение плит имеет потенциал, чтобы изменить результаты.
   Примечание: Для получения четких фотографий тарелок в вертикальном положении без их крышки на матовом черном фоне в области рассеянного света, используют камеру высокого разрешения (≥8 MP), способный фокусироваться на объектах близко к объективу (режим макро). В качестве альтернативы, некоторые гель томографы с транс-осветителя, установленные на белый свет может выпускать продукцию высокого качества, с высокой воспроизводимостью изображения.

Результаты

Результаты анализа должны наблюдаться как разница в штамме накладным конкурента рядом с центрально пятнистой ингибитора штамм-продуцент (рисунок 1). Эти различия можно интерпретировать как полное ингибирование (рис 1А), частичное ингибирование (рис 1B и 1C), без торможения (рис 1D) или положительной ассоциации. Широко доступны лаборатории штаммы S. эпидермидис Tü3298 и S. эпидермидис Rp62A и S. эпидермидис Rp62A и S. стафилококк Ньюмана были использованы в фиг.1В и 1D соответственно. Мы полагаем, что эти штаммы могут быть использованы для тестирования этого протокола.

В зависимости от видов тестирования, полное торможение и частичное ингибирование, скорее всего, является результатом антимикробных пептидов, антибиотиков или других диффундирующего inhibito ростаRS производимые ингибитором штамм-продуцент. Частичное ингибирование также было связано с сокращением доступности питательных веществ для штамма конкурента благодаря поглощению или секвестра питательных веществ штамма ингибитора ^6.

Сравнение размера зоны ингибирования между различными ингибиторами продуцирующих изолятов против того же конкурента штамм указывает на разницу в любой из следующих: количество противомикробного средства, полученного ингибитором штамм-продуцент; способность ингибитора диффундировать через средства массовой информации; тип ингибитора производства и уровень сопротивления штамма конкурентом ингибиторов вырабатываться. Сравнение размера зоны ингибирования между различными конкурирующими штаммов по сравнению с аналогичным ингибитором штамм-продуцент является показателем уровней сопротивления конкурента штаммов к ингибитору вырабатываться.

Результаты будут варьироваться в зависимости от тормозного используемого штамма и штамма конкурента, используемого. Повторы, используя тот же тормозящее и конкурент штамм в идеале должен иметь тот же счет ясности (описанный в разделе 8.2), это указывает на хороший метод был использован во всем.

Если непоследовательное применение бактерий произошло пластины не должны использоваться. Например, если тест конкурент культура является слишком разведенным зона ингибирования будет казаться больше , и с менее четко определенной краю , чем обычно наблюдается (рис 2А); это может привести к снижению надежности любых сравнительных измерений зон. Если ингибитор продуцирующих пятна штамм не был полностью высушен перед инкубации в течение ночи, штамм ингибитора, вероятно, распространится и не образуют четко определенную точку (рис 2б), как правило , влияет на измерения зоны , но также может повлиять на ясность скоринг. Если штамм конкурентне распыляется равномерно это может привести к неравномерному распространению бактерий (фиг.2с). Если штамм конкурент слишком сконцентрирована, возможно , что штамм конкурент может расти на вершине штамма ингибитора (фиг.2С), в крайнем случае это может привести к некоторой инверсии конкурента / ингибитор ролей деформации.

Рисунок 1:. Диапазон качественных и количественных результатов , которые могут быть получены из отложенного анализа ингибирования роста Результаты для ингибирования роста может колебаться от (А) полного торможения (оценка 0), (B) частичное ингибирование (оценка 1) , (C) , частичное ингибирование (2 балла) до (D) никакого ингибирования (4 балла). Этикетки указывают края роста штаммов ингибитора (Y) и самый верхний край торможениязоны (Х). Размер зоны ингибирования диапазоне от 0 мм до более чем 10 мм, как показано в формуле (Е), который показывает результаты измерений для пластин , сфотографированных в A, B, C и D. Результаты показаны на последних стафилококковых изолятов (A , C) или обычной лаборатории стафилококковых изолятов S. эпидермидис Tü3298 (ингибитор) и S. эпидермидис Rp62A (конкурент) (B) и С. эпидермидис Rp62A (ингибитор) и S. стафилококк Ньюман (конкурент) (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Примеры противоречивых результатов из - за плохой техники Результаты могут отличаться , чем ожидалось , если (A. ) конкурентом штамм был слишком разведенным, (В) штамм ингибитор не был полностью высохнуть перед инкубации / плиты не были сухими или (С) , если штамм конкурент не распылять равномерно и был слишком сосредоточен. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Важным шагом этого бактериального протокола видов конкуренции , что отличает его от других, является инкубация в течение ночи ингибитора изолирует перед добавлением конкурента изолята. Штамм ингибитор требует этот период роста производить ингибирующие соединения. По мере того как штамм конкурент накладывается на той же среде, этот метод позволяет исследователю наблюдать весь потенциал штамма ингибитора препятствовать росту штамма конкурента. В результате, этот анализ отражает то, что происходит с природой; один изолят полностью установлена ​​в нише, а другой должен быть в состоянии противодействовать любым ингибирующие переменные, чтобы иметь возможность успешно вторгаются в нишу.

Есть две части к этому протоколу, которые, скорее всего, привести к ошибочным результатам, если выполняется неправильно. Во-первых, неполная стерилизация испарителем бутылки могут ввести загрязняют бактерии в анализе. INCUbation бульона, используемого для ополаскивания бутылки распылительного на этапе 3.6 в стерильный сосуд можно использовать для подтверждения бутылки были полностью стерилизовать. Дополнительные смывки в дезинфицирующих растворов, таких как Virkon, могут быть использованы до промывки в поверхностно-активным чистящее средство, которое, описанного в пункте 3.2, если требуется дополнительной стерилизации.

Второй шаг, который может привести к ошибочным результатам является разбавление штамма конкурента (этап 6.1). Если разбавление не является оптимальным, четкие измерения ингибирования может не быть легко определена. Этот анализ был оптимизирован с помощью различных назальных изолятов в качестве ингибитора штаммы , продуцирующие в широком диапазоне грамположительных и грамотрицательных видов по сравнению с S. стафилококк SH1000 как конкурент штамма ^7,8. Впоследствии она была протестирована с использованием различных коагулазонегативные и коагулазную-положительных стафилококков в качестве конкурента и ингибитора штаммов, продуцирующих. При тестировании, кроме описанных выше, в качестве конкурента родовШтамм, некоторые оптимизации разбавления для посевного материала может быть необходимым.

Если ясность оценки существенно различаются между повторами, это может быть необходимо, чтобы стандартизировать конкурент штамма инокулята, установив его к определенной оптической плотности. Тем не менее, это приведет к увеличению времени анализ требуется, чтобы установить, и, вероятно, сократить число штаммов, можно обрабатывать на эксперимент. Визуально регулируя культуру к соответствующему OD с использованием стандарта McFarland может обеспечить быструю альтернативу.

Одним из недостатков этого метода является то, что оно может быть применено только к культивируемых бактерий. Именно поэтому многие исследования используют 16S рРНК последовательности для прогнозирования конкурентного исключения взаимодействий ^3,4,13. Тем не менее, генетические и метагеномной методы могут только различать членов сообщества на уровне видов, и / или не учитывают конкретной внутривидовой изменчивости признака. Можно экран для ассоциации с particulген , который кодирует А.Р. черта с наличием или отсутствием видов бактерий ^5, однако это требует предварительного знания гена , вероятно, связано с исключением вида.

Безопасна рассмотрение этого метода состоит в том, что, из-за образования аэрозолей бактерий, он может быть использован только в лабораторных условиях с кабинетом безопасности 2, или с подобными мерами безопасности. Есть альтернативные методы тестирования для конкуренции между изолятов, которые составляют внутривидовой изменчивости признака и не производят аэрозоли бактерий. Одним из таких способов является одновременное анализ антагонизма ^2. В этом методе, инокулят одного изолята высевали на чашки с агаром, и второй изолят инокулят пятнистый или кололи на вершине, как только первый высох. Это будет производить среду, в которой штаммы находятся в прямой конкуренции (одновременное антагонизм), как конкурирующие с получением ингибирующих соединений и роются питательные вещества, в первую очередь. advantagе отложенного анализа ингибирования роста по сравнению с одновременным анализом антагонизм является то, что ингибитор изолят всегда должен иметь конкурентное преимущество, чтобы быть полностью установлена ​​до вторжения конкурента изолята. Это больше отражает то , что будет происходить в окружающей среде, так как в большинстве ниш, один изолят будет установлен прежде , чем другой штамм добавляется, а не два изолята добавляется в то же время ^8.

Другая альтернатива, чтобы избежать аэрозольную поколение бактерий было бы добавить конкурента изолирование верхнего агара, который можно было вылить, а не распыляют над ингибитором изолята. Тем не менее, объем верхнего агара добавляют необходимо будет приблизительно 3 мл, чтобы обеспечить равномерное покрытие пластины. В пределах этого объема, конкурент изолят не будет расти на тех же средствах массовой информации в качестве ингибитора изолята, так что не будет страдать от снижения питательных веществ. Спортсмен также не находиться в непосредственном контакте с любыми тормозными соединениями ЕНТиль они диффундируют в верхнюю агара. Такой анализ не может быть описана как отсроченный ингибирования или одновременного антагонизма.

Аналогичный метод ранее использовался для оценки уровней сопротивления бацитрацинового среди клинических S. стафилококка изолирует ^10. Основное различие между протоколом , описанным здесь и который описан ^10, является последним только одного объявления конкурента штаммы как чувствительные (полный inhibition- ясность 0 баллов) или устойчивые (частично , чтобы не inhibition- ясности оценка 1-5). Отложенный анализ ингибирования роста также может поэтому быть использован для скрининга уровней сопротивления производителям отдельных противомикробных, или даже для поиска новых антибактериальных препаратов, активных в отношении резистентных патогенов множественной лекарственной устойчивостью.

Было высказано предположение о том , что хост - микрофлора можно манипулировать , чтобы устранить нежелательные члены бактериального сообщества ^9. Применение коринебактерий или Staphylococcus эпидермидис уже было показано , чтобы устранить S. стафилококк колонизация в ноздрями в значительной части населения ^11,12. Поэтому исследования в конкретных штаммов, которые могут конкурентно исключающих нежелательных членов принимающей флоры, с помощью таких методов, как описана здесь, может привести к будущим терапии.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion broth	Lab M	lab049	rich general purpose media
agar-agar	Merck Milipore	101614
Petri dishes	Sarstedt	82.1473.001
Plastic perfume vaporizer	not known	-	10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket
Universal bottles		no longer in production, alternative SLS BOT5006	28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap
Decon 90	Decon		surface active cleaning agent