Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize

Özet

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Özet

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

Giriş

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients ⁶. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community ⁶.

Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing ^3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another ¹. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community ⁷.

The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion ⁷.

Protokol

Aşağıdaki yöntem önleyicisi üreten suşlar ile rakip suşları test etmek için ^7,8 uyarlanmıştır.

NOT: Bu protokol, bakteri kültürleri ile aerosol nesil içerir. Bu, sadece lokal onaylı güvenlik konuları uygulanması ile kapalı bir alanda gerçekleştirilebilir. Bir seviye 2 güvenlik kabini içinde agar plakaları üzerine kültür Püskürtme agar plakaları kirlenmesini ve çevresini en aza indirecektir. Bu aynı zamanda püskürtülen bakterilerin aerosol inhalasyon gelen araştırmacı koruyacak, bu araştırmacı çevreleme seviyesi 2 organizmaların kullanıldığı takdirde önemli bir husustur. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir. petri çevresi en atılabilir emici dokusu ile kaplıdır. UV ışığı kullanarak post-sprey dekontaminasyon tavsiye edilir.

1. Agar Plakaları hazırlanması

1. manu uygun olarak beyin kalp infüzyon (BHI) agar hazırlayınfacturer talimatları.
2. sterilize etmek için, 121 ° C, otoklav, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak 15 ila 20 dakika boyunca psi, ya da BHI agar otoklava.
3. Steril petri kutularının içine sterilize BHI agar 15 ml hacimde dökün ve ayarlamanızı sağlar.
   Not: Deney agar aynı stok kaynaklı olan her agar kullanılmak üzere olun ve her plaktaki agar aynı miktarda olduğu. Bu mevcut besin ve karşılaştırılabilirlik sağlayan plakalar arasındaki inhibitör difüzyon değişkenliği sınırlar.

2. Steril Broth hazırlanması

1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, BHI suyu hazırlayın.
2. 28 ml'lik bir cam şişe genel BHI 10 ml alikotları ekleyin.
3. sterilize etmek için, 15 psi, 20 dakika, ya da otoklav üreticinin tavsiyelerine göre 121 ° C'de BHI suyu otoklav.
   NOT: suyu aut aynı partiden kaynaklanan deneyde kullanılan tüm suyu sağlayınsonuçlar varyasyonu neden olabilir besin varyasyonu sınırlamak için, aynı zamanda oclaved.

3. Hazırlanması Steril Vaporizer Şişe (ler)

1. vapourizer şişe sökün.
2. Iç yabancı maddelerin temizlenmesi gece boyunca% 5 bir yüzey aktif temizleme ajanı vapourizer şişe kapağı ve vapourizer emmek için vapourizer ile% 5 yüzey aktif temizlik maddesi püskürtün.
   NOT: Yüzey aktif temizlik maddesi tutarken eldiven ve uygun kişisel koruyucu donanımlar kullanılmalıdır.
3. steril hava akış kaputun altında buharlaştırıcı, kapak ve şişe kurutun.
4. % 70 etanol ile şişeye doldurun, vapourizer yeniden takın ve vapourizer yoluyla etanol bazı sprey.
5. buharlaştırıcı kapağı koymak ve kullanıma kadar iç etanol ile saklayın.
6. aseptik olarak Steril BHI et suyu ile durulayın ve şişe vapourizer yoluyla suyu püskürtmek için hemen önce.
   NOT: Bu etanol aff önlerbölüm 6.3 şişeye ilave inokulum ecting.

Bakteriyel Gece Kültür hazırlanması 4. (ler)

1. Şerit yarışmacı ve suşlar önleyicisi steril BHI agar plakası üzerine yerleştirin ve yaklaşık 18 saat (bir gece) aerobik olarak 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Bu plaka, 4 ° C'de depolandığında aynı hafta içinde birden çok kopya için kullanılabilen bakteri stok üretir.
2. 28 mi, evrensel şişe içinde gerekli rakip bakteri suşunun tek bir koloni ile steril BHI et suyu 10 ml inoküle.
3. orbital çalkalayıcı 250 rpm'de çalkalanarak aerobik olarak gece boyunca 37 ° C de genel şişe inkübe edin.

Önleyici üreten İzolatı 5. Nokta Kültürü

1. 4. bölümde tarif edildiği gibi, gece boyunca kültürün (ler) hazırlayın.
2. Agar plakaları kapağındaki yoğunlaşma olmadan, tamamen kuru olduğundan emin olun, aşılamadan önce (pla kuluçka örneğin37 ° C'de 60 dakika) için TE; Bu aşılama sitesinden plaka üzerinde yayılmasını inokulum engeller.
3. Pipet agar plakaları merkezi üzerine gece boyunca bir kültürü 25 ul. tamamen agar boyunca kültür sprey hava kabarcıklarını önlemek için pipet Medyumu kaçının.
4. kültür yayılmasını sınırlamak için kültür oda sıcaklığında kurumaya bırakın. aerobik bir gece boyunca 37 ° C 'de agar inkübe edin.

6. Hazırlama Testi Rakip Strain Sprey Aşı (lar)

1. Yaklaşık 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1 vermek üzere BHI suyu bölüm 4. SEYRELTİK gecede kültür 10 kat açıklandığı gibi gecede kültür hazırlayın ve OD ₆₀₀ 0.3 ± 0.05 süspansiyonu.
   NOT: 10 kat seyreltme, 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1 tüm bakteri türlerinin vermek 1 x 10 arasında seri dilüsyonları kaplama yayılması gerekli seyreltme faktörünü hesaplamak olmaz -1 -1 x 10 ^-6 kadar.
2. steril plastik parfüm buharlaştırıcı şişeye seyreltilmiş kültür dökün.
   NOT: toplam hacim agar plakaları sayısı püskürtülen için gerekli olandan daha fazla olmalıdır. Yaklaşık plaka başına 250 ul 9 cm çaplı bir petri çanağı için uygundur.

7. Ertelenmiş büyüme inhibisyonu analizi

1. Kültür önceden agar üzerine püskürtme için püskürtme mekanizması yerleştirildiğinden emin olmak için buharlaştırma şişelerin her birinden kültür püskürtülür.
2. agar üzerinde yaklaşık 15 cm'lik bir mesafeden, tüm agar yüzeyi üzerine seyreltilmiş kültür yaklaşık 250 ul (tipik 50 mi buharlaştırıcı 3 spreyler) püskürtülür. aerobik bir gece boyunca 37 ° C 'de agar inkübe edin. spreyler aynı sayıda diğer plakaları için tekrarlayın.

8. Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Sonuçları Yorumlama

1. püskürtülen alanda ülkemizde büyüme inhibisyon zonu ölçüntor suşu (Şekil 1A - C, "X", "X" için) (- C, "Y" ile "Y" Şekil 1A) inhibitörü yapımcısı merkez nokta çapı çıkarılarak milimetre.
   NOT: Şekil 1E bu veriler sunulabilir nasıl gösterir
2. inhibisyon bölgeleri için netlik puan kaydedin.
   Not: Bu görülen inhibisyon derecesi gösterir. Örnekler Şekil 1A gösterilmiştir - D, standardizasyon için kullanılabilir suşları temsilcisi sonuçları bölümünde önerilmektedir. Aşağıdaki ölçek, berraklığı puanlama için kullanılabilir: 0 bir berraklığı mı rakip suşun büyüme önlemesine bir bölge tanımlamak için. 1 puan temizleme bölümü içinde mevcut olan, sadece tek tek koloniler ile büyüme hemen hemen tam inhibisyon bölgesini tanımlamak için. 2 puan azaltılmış bir büyüme görülebilir bölge tanımlamak için, bu bölge içinde büyüme conakıcı veya yapışık yakın ama>% 50 oranında yoğunluk azalır. 3 puan çok az büyüme azaltma açıklamak için, büyüme birleşen ve daha az% 50 oranında azaltılır, bir bölge hala görünür ve ölçülebilir. 4 puan, büyüme görünür bir inhibisyon ortaya koymaktır. 5 puan ise rakip suşunun büyüme testi önleyicisi üreten soyun yakın artış olduğunu ortaya koymaktır. Örnekler için Şekil 1'e bakınız. Bu puanlar deneyci için subjektiftir.

9. çoğaltır

1. Biyolojik en az üç kez tekrar deneyler elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini belirlenmesi.
   NOT: çoğaltır farklı günlerde yapılması durumunda, ölçüm yapmak ve 4 ° C'de, daha sonra inkübasyon çıkarıldıktan hemen sonra ya mağaza plakaları plakaları puan veya onları atmadan önce plakaların yüksek kaliteli fotoğraflar çekmek. Depolama veya plakaların fotoğrafları farklı günlerde arasındaki sonuçların kolay karşılaştırma sağlar, tonun gün / deneyler arasında tekrarlanabilir puanlama teyit için özellikle önemlidir. plakaların depolama sonuçlarını değiştirme potansiyeline sahip olduğunu unutmayın.
   NOT: net fotoğraflar yer plakaları için dik dağınık ışık bir alanda mat siyah arka plan üzerine kapaksız, yakın objektif (makro modu) nesneler üzerinde odaklama yeteneğine sahip yüksek çözünürlüklü bir kamera (≥8 MP) kullanın. Alternatif olarak, beyaz ışığa ayarlanır trans-ışığı ile bazı jel görüntüleme cihazları, yüksek kalite, yüksek tekrarlanabilir görüntüler üretebilir.

Sonuçlar

Deney sonuçları, merkezi benekli önleyicisi üreten bir suş (Şekil 1) yakınındaki Kaplanmış rakip suşu bir fark olarak gözlemlenebilir olmalıdır. Bu farklılıklar, tam inhibisyon (Şekil 1A), kısmi inhibisyonu (Şekil 1B ve 1C), herhangi bir inhibisyonu (Şekil 1D) veya pozitif bir birlik olarak yorumlanabilir. Yaygın olarak kullanılan laboratuvar S. suşları epidermidis Tü3298 ve S. epidermidis Rp62A, ve S. epidermidis Rp62A ve S. aureus Newman sırasıyla Şekil 1b ve 1d kullanılmıştır. Biz bu suşlar bu protokolü test etmek için kullanılır olabileceğini düşündürmektedir.

Test edilen türler bağlı olarak, tam inhibisyon ve kısmi inhibisyon muhtemelen antimikrobiyal peptitler, antibiyotiklere veya diğer yayılabilir bir büyüme inhibitör sonucudurinhibitör üreten bir suş tarafından üretilen rs. Kısmi inhibisyon da inhibitör suşu ⁶ ile rakip alımı nedeniyle gerginlik ya da besin ayrımı için azaltılmış besin durumu ile bağlantılı olmuştur.

Aynı rakip suşuna karşı test edilen farklı inhibitör üreten suşlar arasında inhibisyon zonunun boyutu karşılaştırılması aşağıdakilerden herhangi farklılıkları gösterir: inhibitörü üreten bir suş tarafından üretilen antimikrobiyal miktarı; ortam içinden difüze inhibitörün özelliği; inhibitör tip üretilen ve inhibitörleri ile rakip suşu direnç seviyesi üretilmektedir. Aynı önleyicisi üreten suşuna karşı test edilen farklı rakip suşları arasında inhibisyon bölgesinin boyutu karşılaştırması önleyicisi üretilen için rakip karşı direnç seviyelerinin göstergesidir.

Sonuçlar kullanılan inhibitör zorlanma ve kullanılan rakip gerginlik bağlı olarak değişecektir. Aynı inhibitör ve rakip suşu kullanılarak tekrarlar ideal aynı netlik puanı (bölüm 8.2'de açıklanan) olması gerekir, bu iyi bir teknik boyunca kullanılan olmuştur gösterir.

Bakterilerin eksik uygulanması oluştu plakları kullanılmamalıdır. Örneğin test rakip kültürden ise inhibisyon bölgesinin daha büyük görünür ve tipik olarak (Şekil 2A) görülmektedir daha az belirgin bir kenar olacak seyreltilmiş; Bu herhangi bir karşılaştırmalı bölge ölçümlerinin güvenilirliğini etkileyecektir. Inhibitör üreten suş nokta tam bir gecede inkübasyon önce kuru değil ise, inhibitör zorlanma yaymak ve tipik bölge ölçümleri etkiler ama aynı zamanda netlik puanlama etkileyebilir açıkça tanımlanmış nokta (Şekil 2B), oluşturmayacak muhtemeldir. rakip suşu iseeşit biçimde, bu bakterilerin düzgün olmayan bir yayılma (Şekil 2C) yol açabilir püskürtülür. Rakip suşu çok konsantre olursa bu rakip suşu inhibitörü suşu (Şekil 2C) üstünde büyümeye olasıdır, aşırı durumlarda bu yarışmacı / inhibitör gerilme rolleri bazı ters yol açabilir.

Şekil 1:. Büyüme inhibisyonuna ertelenmiş büyüme inhibisyonu analizi elde edilebilir niteliksel ve niceliksel sonuçların aralığı Sonuçlar (A) 'tam inhibisyon aralığında olabilir (0 puan), (B), kısmi inhibisyonu (1 puan) (D) hiçbir inhibisyon (4 puan) ile (C) kısmi engelleme (2 puan). Etiketler (Y) inhibitörü soylarının büyüme kenarları ve inhibisyon en dış kenarı gösterirbölgeleri (X). A fotoğraflandı levhalar için ölçümlerini göstermektedir, (E) 'de gösterildiği gibi 0 mm ilâ 10 mm'den fazla inhibisyon aralığında alanın boyutu, A, B, C ve D Sonuçlar Son stafilokok izolatı (A ile gösterilmiştir C) ya da ortak laboratuar stafilokok S. izolatlarının epidermidis Tü3298 (önleyici) ve S. epidermidis Rp62A (rakip) (B), ve S. epidermidis Rp62A (önleyici) ve S. aureus Newman (rakip) (D). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: zayıf tekniğine tutarsız sonuçlar örnekleri Sonuçları eğer beklenenden farklı görünebilir (A. ) rakip suşu çok seyreltik olduğu, (B) inhibitörü suşu inkübasyon / plakaları önce tamamen kuru değildi kuru veya (C) değildi. büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.

Tartışmalar

Diğerlerinden ayıran, bu bakteri türleri rekabet protokolünün kritik bir safha, inhibitörün bir gece boyunca inkübasyon rakip izolatı eklenmesinden önce izole olduğu. Önleyicisi soyu önleyici bileşikleri üretmek için bu büyüme dönemi gerektirir. rakip suşu aynı ortamda üstüne bindirilmiş gibi, bu yöntem tam potansiyelini gözlemlemek için araştırmacı izin verir önleyicisi soyunun rakip suşunun büyüme müdahale etmek. Bunun bir sonucu olarak, bu deney, doğa ile ne yansıtmaktadır; bir izole tamamen niş yılında kurulmuş, ve diğer başarılı niş işgal edebilmek için herhangi bir inhibitör değişkenleri karşı gerekir.

Yanlış yapıldığı takdirde hatalı sonuçlara neden büyük olasılıkla bu protokol iki bölümü vardır. Birincisi, buharlaştırıcı şişe eksik sterilizasyon tahlil içine bakteri kirlenmesine neden tanıtabilirsiniz. incusteril bir kap içinde aşama 3.6 buharlaştırıcı şişe yıkamak için kullanılan broth Bation tamamen sterilize edildi şişe teyit etmek için kullanılabilir. Ek sterilizasyon gerekli ise, örneğin, Virkon® dezenfekte edici çözeltiler Ek yıkama, aşama 3.2'de tanımlanan yüzey etkili temizleme maddesinin yıkama, önce kullanılabilir.

hatalı sonuçlara neden olabilir ikinci aşama rakip suşu (adım 6.1) seyreltme olduğunu. Seyreltme uygun değilse, inhibisyon net ölçümler kolayca tespit edilemez. Bu deney, önleyici üreten S. karşı Gram-pozitif ve Gram-negatif türler geniş bir yelpazesinde suşları gibi çeşitli nazal izolatları kullanılarak optimize edildi rakip suşu ^7,8 olarak aureus SH1000. Bu daha sonra rakip ve inhibitörü üreten suşlar gibi çeşitli-koagülaz negatif ve koagulaz pozitif stafilokok kullanılarak test edilmiştir. rakip olarak yukarıda tarif edilenler dışındaki cins test ederkensuşu, inokulum için seyreltme bazı optimizasyon gerekli olabilir.

berraklık puanları tekrarlar arasında anlamlı farklılık varsa, belirli bir optik yoğunluk olarak ayarlayarak rakip gerilme inokulum standardize etmek gerekli olabilir. Bununla birlikte, bu deney ayarlamak için gereken ve deney için işlem mümkündür suşları sayısının azaltılması olası zaman artar. Görme hızlı bir alternatif sağlayabilir bir McFarland standardı kullanılarak uygun bir OD kültürünü ayarlayarak.

Bu tekniğin bir sınırlama sadece kültürlenebilir bakterilerin uygulanabilir bunun olmasıdır. Birçok çalışmada rekabet dışlama etkileşimleri ^3,4,13 tahmin 16S rRNA sıralamasını kullanmak nedeni budur. Ancak, genetik ve metagenomic teknikler sadece tür düzeyinde topluluk üyelerini ayırt edebilir ve / veya belirli bir tür içi özellik varyasyonu için hesaba katmıyor. Bir özelde, dernek taranması mümkünBir bakteri türlerinin ⁵ varlığında ya da yokluğunda bir özelliği kodlamaktadır ar geni, ancak bu tür hariç ile bağlantılı olması muhtemel bir genin ön bilgi gerektirir.

Bu tekniğin bir güvenlik dikkate bakterilerin aerosol üretimi nedeniyle, sadece bir seviye 2 güvenlik kabini ile laboratuarlarda kullanılan ya da benzer güvenlik önlemleri ile olabilir olmasıdır. intraspecific özellik değişimi için hesap ve bakteri aerosollerin üretemeyen izolatlar arasındaki rekabet test etmek için alternatif teknikler vardır. Böyle bir yöntem, aynı anda antagonizma deney ^{2 'dir.} Bu yöntemde, bir izolatın, bir aşı, bir agar plakası üzerine yayılır, ve birinci kuruduktan sonra, ikinci bir izole aşı En lekeli veya yaralanmıştır. Bu, hem inhibitör bileşikler üretirler ve ilk besin temizlemek için yarışan, suşlar doğrudan rekabet (eşzamanlı antagonizma) olarak bir ortam üretecektir. advantageşzamanlı antagonizma tahlil üzerinden ertelenmiş büyüme inhibisyonu testinin e inhibitörü izolatı her zaman tam rakip izolatı işgalinden önce kurulmakta olan rekabet avantajına sahip olmasıdır. Başka bir suş yerine iki izolat aynı anda ⁸ ilave olmaktan çok, ilave edilmeden önce, bir izolatın kurulacak çoğu niş olarak bu, çevrede ne olacağını daha yansıtıcı olduğunu.

Başka bir alternatif döktü ziyade önleyici izolatı üzerinde püskürtülür olabilir üst agar izole rakibi eklemek olacaktır bakterilerin aerosol oluşumunu engellemek için. Bununla birlikte, üst agar eklenmiş hacmi plaka da kapsama sağlamak için yaklaşık olarak 3 ml olması gerekir. Bu hacim içinde, rakip izolat inhibitörü izolatı aynı ortam üzerinde büyüyen olmaz, bu yüzden azalmış besin muzdarip olmaz. Yarışmacı, aynı zamanda UNT bir önleyici bileşikler ile doğrudan temas halinde olmazil onlar üst agar içine yayılmış. Böyle bir deney, ertelenmiş inhibisyonu veya aynı anda antagonizmi olarak tarif edilememiştir.

Benzer bir yöntem, daha önce klinik S. arasında basitrasin direnci düzeylerini değerlendirmek için kullanılmıştır aureus ¹⁰ ayırır. ¹⁰ tarif burada tarif edilen protokol ve arasındaki temel fark, duyarlı (0 puan inhibisyon netlik tamamlamak) ya da dirençli ikinci sadece gizli rakip suşları (hiçbir inhibisyon netlik kısmi skor 1-5). Ertelenmiş bir büyüme önleme deneyi Bu yüzden, aynı zamanda, çok ilaca dirençli patojenlere karşı aktif yeni antimikrobiyal aramak için daha özel bir antimikrobiyal, veya üretici direnç seviyeleri taranması için kullanılabilir.

Ev sahibi mikroflora bakteriyel eden ⁹ istenmeyen temsilcilerinin ortadan kaldırmak için manipüle edilebilir olduğu ileri sürülmüştür. Corynebacterium türü ya Staph Uygulamaylococcus epidermidis önce S. ortadan kaldırmak için gösterilmiştir Nüfusun ^11,12 önemli bir oranda burun içinde aureus kolonizasyonu. rekabetçi, burada anlatılan gibi teknikler vasıtasıyla ev sahibi bitki istenmeyen temsilcilerinin, dahil belirli suşlarından içine çalışmalar bu nedenle gelecekteki terapötik yol olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion broth	Lab M	lab049	rich general purpose media
agar-agar	Merck Milipore	101614
Petri dishes	Sarstedt	82.1473.001
Plastic perfume vaporizer	not known	-	10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket
Universal bottles		no longer in production, alternative SLS BOT5006	28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap
Decon 90	Decon		surface active cleaning agent