Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Abstract

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Introduction

הגבלה של טיפולי HIV-1 הנוכחיים היא שהם צריכים להתנהל באופן כרוני כדי למנוע התקדמות מחלה. להשתלות של HIV-1 עמיד לימפוציטים T, או תאי גזע hematopoietic, יש את הפוטנציאל לספק בקרה לטווח ארוך של שכפול HIV-1 בהעדר טיפול תרופתי 1,2 ויכול גם להיות גישה יעילה להשיג תרופה HIV-1 3. דרך אחת להפוך תאים עמידים שכפול HIV-1 היא להכניס גנים אחד או יותר קידוד עבור אנטי HIV-1 RNAs או פפטידים לתוך התאים של אדם שנדבק במהלך השתלה עצמית 4. כמה המועמד גנים אנטי HIV-1 עוצבו עם כמה ניסויים קליניים נכנסים שילובים של שני 5 או שלוש 6, כדי למנוע התפתחות של עמידות HIV-1 לכל גן יחיד.

RNAs-1 נגד HIV הוא בין המועמדים הבולטים עבור ריפוי גנטי שילוב בשל הפוטנציאל הנמוך שלהם לעורר תגובה חיסונית ובגלל שהםמשועתק מתוך רצפי גנים מאוד קצרים. חלק RNAs נגד HIV-1 עוצב למקד כניסה ושילוב ויראלי. עם זאת, רוב RNAs נגד HIV-1 למקד צעדים שלאחר אינטגרציה במחזור החיים של הנגיף (איור 1). מעכבי פוסט אינטגרציה כוללים RNAs דמה, מיקוד חלבונים רגולטוריים HIV-1 טאט או Rev 1, ו RNAs מבוססי antisense, מיקוד אתרים שונים HIV-1 RNA, כגון ribozymes 7, shRNAs 8 ו U1i 9 RNAs. שיטות שנוצלו כדי להשוות את היעילות של RNAs נגד HIV-1 כוללות ניטור שכפולה נגיפית בתאי transduced עם גני מקודדי RNAs מועמד למדידת ייצור נגיפי בתאי transfected זמני עם פלסמידים להביע RNAs מועמד פלסמיד ביטוי HIV-1 10 -13. השתמשנו בעבר assay ייצור HIV-1 להקרין HIV-1 RNA עבור אתרי היעד ribozyme חדש 13-15. שיטות אלה שוכללו מאז כדי לייעל את הפורמט של RNAמולקולת פרעות הביעה מ- DNA פלסמיד כקובץ shRNA או נמסרה בתור siRNA סינטטי 16. את assay מודד את הייצור של וירוסים בוגרים מן הכליות עובריות אנושיים (HEK) תאי 293T, וניתן להשתמש בו כדי להשוות את ההשפעות של מעכבים כי למקד צעדים שלאחר אינטגרציה במחזור שהכפול HIV-1 (איור 1). עבור מעכבים כי למקד צעדים מראש אינטגרציה, מבחנים חלופיים כגון assay infectivity תא TZM-bl 17 נדרשים להעריך יעילות אנטי.

חששות בטיחות סרן עבור המשלוח של אנטי HIV-1 RNAs במרפאת כוללים השפעות חוץ-היעד פוטנציאליות על RNAs אדם או חלבונים, והפעלה של חיישני חיסון מולדים. כדי להעריך את הרעילות של siRNAs נגד HIV-1, השתמשנו assay כדאיות התא שורות תאים שונות 16. כמו כן, אנו נמדדים הפעלה של החיישנים החיסוניים גדילי RNA הכפולים, R פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR) ו אגרה כמו 3 קולטן (TLR3), כמו גם לשעברpression של אינטרפרון מגורה גן, p150 ADAR1. מבחנים אלה יכולים לשמש כדי לאשר את היעילות של RNAs נגד HIV-1 הוא לא בשל השפעות עקיפות על כדאיויות תא או הפעלת חיישן חיסונית. הם גם שימושי למעט RNAs מועמד עם רעילות פוטנציאל להתפתח הלאה.

ב הפרוטוקולים הבאים, נהלים לזהות RNAs הטיפולית חדשות ולבצע אופטימיזציה של הפורמט של התנחלויות קיימות מתואר. השיטות שימושיות מעכבי אינטגרציה שלאחר מבוסס RNA הקרנת שכפול HIV-1 יכולות להיות מותאמות למסך מעכבים שלאחר אינטגרציה אחרות, כגון מולקולות קטנות מיקוד יצוא Rev בתיווך של רנ"א הנגיפי 18 או CRISPR / מערכות קאש שנועדו למקד משולבות HIV-1 DNA 19.

Protocol

1. תאי transfections

  1. תרבות תאי HEK 293T במדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. כן השעית 2 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום תרבית תאים. הוספת 500, 100 ו -1,000 μl של השעיה התא היטב כל 24 גם, 96-היטב צלחות 12-היטב, לייצור ויראלי, כדאיות התא מבחני ההפעלה החיסונית, בהתאמה (איור 2 א).
  2. מערבולת בעדינות את הצלחות דגירה אותם O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לגדל תאים כדי 50-70% confluency.
  3. על פי תוכנית transfection, להכין דילולים של RNAs מבחן ובקרות שלהם ב 1.5 צינורות מיקרו מ"ל (דוגמה, איור 2B).
    1. עבור assay הייצור ויראלי, להכין 10 ng / דילול μl של פלסמיד ביטוי HIV-1 ולהוסיף 10 μl על צינור אחד. הבא להכין 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הניסיוני RN בקרה שליליא להוסיף 2.5 או 10 μl של כל RNA מבחן ודילול בקרה שלילי על הצינורות המקביל עבור 25 או 100 ריכוזים סופיים ננומטר.
    2. עבור assay כדאיות התא, להכין 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הבדיקה דילול 10 מ"ג / מ"ל ​​של RNA בקרה חיובית, משקל מולקולרי נמוך אני פוליפוני: C. הוסף 2 μl של רנ"א בדיקה או דילולי RNA הבקרה חיוביים על הצינורות המתאימים עבור 100 ננומטר או 200 ריכוזים סופיים מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה.
    3. עבור assay ההפעלה החיסוני, להוסיף 20 μl של רנ"א בדיקה או דילולי RNA בקרה חיוביים מוכנים בשלב 1.3.2. אל הצינורות המתאימים עבור 100 ננומטר או 200 מיקרוגרם / ריכוזיים סופי מיליליטר, בהתאמה.
      הערה: פלסמידים ביטוי RNA בדיקות, להכין 10 ng / דילולים μl במקום של 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הבדיקה, מתן הסכומים הסופיים של 25 ו -100 ng עבור צעד 1.3.1. ו -100 ng לצעדים 1.3.2. ו 1.3.3.
  4. הוסף 50, 25 או 75 μl של DMEM על צינור אחד transfection למוצרים ויראליuction, כדאיות התא מבחני ההפעלה החיסונית, בהתאמה. מבחני ההפקה ויראלי, להביא תאים וצינורות transfection מוכן מעבדה ביו בטיחות ברמה 3 (BSL3) לפני השלב הבא.
  5. הוסף 2 μl של ברצף מגיב transfection אל צינורות transfection דגירה 15 עד 20 דקות, כדי לאפשר מתחמי הטופס. ראה הטבלה של חומרים עבור מגיב transfection הספציפי כדי לשמש.
  6. מוסיפים את תערובת transfection כולו מהצינור כל מיקרו-חכם ירידה לעמדות המקביל צלחות תרבית תאים. מערבולת בעדינות דגירה הצלחות במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  7. מדוד ייצור HIV-1 (סעיף 2), כדאיות התא (סעיף 3) והפעלה החיסונית (סעיף 4) ב צלחות תרבית תאים (איור 2 ג).

2. Assay הפקה ויראלי

  1. הסר את צלחות תרבית תאי 24 גם מן החממה בעדינות מערבולת הצלחות בתוך תרבית תאי BSL3מכסה מנוע. עבר 150 μl של supernatant מכל טוב על תואמים היטב צלחת תחתית שטוחה 96-היטב, אשר תשמש לכמת ייצור HIV-1.
    הערה: מבחני כימות ויראלי נפוצות כוללות מדידת ביטוי של חלבון קפסיד HIV-1 (p24) על ידי assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 20, לכימות רנ"א נגיפי על ידי RT-PCR (RT-PCR) 21 ומדידת פעילות של האנזים RT HIV-1. צעדים 2.2 ל 2.5 להסביר שיטות לכמת HIV-1 RT פעילות 13,15,16.
  2. העברה 5 μl של supernatant כדי מקביל בארות בצלחת 96-היטב, המכיל 25 μl של קוקטייל שיבוש ויראלי 15 (טבלה 1). דגירה את התערובת במשך 5 דקות ב RT ולהעביר את הצלחת לתחנת עבודת רדיואקטיביות.
    הערה: שלב 2.2. יש צורך רק אם לא זמינה עבודת רדיואקטיביות היא במעבדת BSL3. אם הצלחות לא צריכות תיוסרנהמעבדת BSL3, המשך לשלב 2.3. ולהוסיף 50 μl של קוקטייל שיבוש רדיואקטיביים / ויראלי (טבלה 1) במקום 25 μl של קוקטייל רדיואקטיבי.
  3. כן רדיואקטיבי קוקטייל 15 (1 טבלה), ולהוסיף 25 μl היטב כל supernatant ויראלי קוקטייל הפרעה. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  4. ספוט 5 μl של תערובת התגובה על ריבועים מקבילים סיבי זכוכית Di אתיל אמינו אתיל (DEAE) נייר filtermat ולאפשר הכתמים להתייבש במשך 10 דקות. ספוט את תערובת התגובה על כל ריבוע אחר כך ששתי אין דגימות ישירות דייר אחד אחרת. זה עוזר למנוע מעל הכלאה בין דגימות בעת קביעת ספירת לדקה (CPM) בשלב 2.6.
  5. שטפו את העיתונים 5x במשך 5 דקות עם חיץ נתרן ציטרט מלוחים 2x (SSC) (טבלה 1), ואחריו שני שוטף 1 דקות עם אתנול 95%. אפשר בעיתונים להתייבש ולאטום אותם בשקיות מדגמות.
  6. שיתוף שקיות מדגם קליפntaining נייר filtermat לתוך קלטת והכניס את הקלטת לתוך מונה נצנץ microplate. הגדר הדלפק לקרוא לדקה עבור 32 P עם התאריכים להשוואה סיפק עבור אצוות של [32 P] dTTP השתמשו בניסוי. בחר בו שימוש בדגימות לקרוא באמצעות מפת צלחת ולהתחיל הדלפק.
  7. בכל שיטת כימות ויראלי, לחלק את הערכים שהתקבלו עבור כל RNA בדיקה על ידי הביקורת השלילית הסמוכה להכפיל ערך זה על ידי 100 כדי לקבל את עיכוב אחוז הייצור HIV-1 עבור כל לשכפל של RNAs הבדיקה. דוגמה לתוצאות השוואת RNAs מבדקים שונים בריכוזים שונים מסופק באיור 3.

Assay כדאיות התא 3.

  1. הסר את 96-גם הצלחות מן החממה ולהוסיף 20 μl של 5 מ"ג / מ"ל ​​MTT (3- [4.5-דימתיל-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium ברומיד) מדולל בופר פוספט של Dulbecco ( DPBS) זה טוב. דגירת צלחות fאו 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. להוסיף 150 μl של isopropanol acidified עם חומר ניקוי (1% NP-40, 4 מ"מ HCl ב isopropanol) זה טוב דגירה צלחות במשך שעה 2 ב RT.
  3. קבע את הספיגה ב 570 ננומטר ב ספקטרופוטומטר microplate.
  4. חשב את חילוף חומרי MTT ביחס לכל RNA מלא בדיקה חיובי על ידי חלוקת הערך המתקבל עבור כל דגימה על ידי שליטת transfection הסמוכה לה. דוגמא לתוצאות השוואת RNAs מבחן שונה כביקורת חיובית מסופקת באיור 4.

4. Assay ההפעלה החיסונית

  1. הסר את 12 גם הצלחות מן החממה לשאוב את התקשורת והתרבות. לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם DPBS ולהוסיף 70 μl של חיץ תמוגה קר 22 (כולל מעכבי פרוטאז ו phosphatase, טבלה 1) זה טוב. דגירת הצלחות עבור 10 דקות על קרח.
  2. עבר lysates תא צינורות המייקר ומהר להקפיא אותם על ידי טבילהצינורות בחנקן נוזלי. אפשר הדגימות להפשיר וחזרו על 2 יותר מחזור הפשרת הקפאה עבור סכום כולל של 3.
  3. צנטריפוגה lysates במשך 15 דקות ב 4 ° C, 15,700 XG, כדי גלולה פסולת התא. מעבירים את supernatant צינורות מיקרו חדש ולקבוע את ריכוז החלבון באמצעות כחול Coomassie (ברדפורד) שיטה 23,24.
  4. פתור 75 מיקרוגרם של חלבון מכל מדגם ב ג'ל polyacrylamide denaturing 10% ולהעביר אל קרום nitrocellulose כפי שתואר לעיל 25,26.
  5. בעקבות אלקטרופורזה ולהעביר קרום, לחשוף להקות חלבון על ידי דוגרי קרום Ponceau S (לוח 1) 1 דקות ואחריו כביסה במים מזוקקים פעמים. השתמש להקות סולם חלבון כמדריך לחתוך את הממברנה 80 ו -55 kDa.
    הערה: בשלב 4.4 דגימות ניתן להריץ על 16 x 18 ס"מ 2 ג'לים עד 34 kDa, כך שזה קל לחתוך את הקרום על העמדות שצוינו ולא לחתוך דרךלהקות של עניין. לחלופין, כמה ג'לים ניתן להפיק דגימות אותו כדי למנוע חיתוך הממברנה.
  6. יש לשטוף היטב את מכתים Ponceau S עם מי מלח שנאגרו טריס המכיל 0.05% Tween 20 (TBST, טבלה 1). להוסיף TBST עם 5% חלב דל שומן על מנת לכסות את הקרום לחלוטין. דגירה ממברנות ב RT עם תסיסה במשך שעה 1.
  7. דגירה ממברנות O / N ב TBST עם אלבומין בסרום שור 3% (BSA) ונוגדנים מדולל ל -1 מכל 1,000 נגד ADAR1 (110 ו -150 KDA), phospho-PKR (62 KDA), ו phospho-IRF3 (47 KDA), עבור החלקים העליונים, אמצעיים ותחתונים של הממברנה, בהתאמה.
  8. שטפו את ממברנות 5x במשך 5 דקות עם TBST ו דגירה ב TBST עם חלב 5% דל שומן ו נוגדנים משני נגד ארנב עז שכותרתו peroxidase (מדולל ל 1 ב 5000) במשך שעה 1.
  9. שטוף את 5x ממברנות במשך 5 דקות עם TBST ולהחיל electrochemiluminescence פתרון (ECL) כדי להמחיש את הלהקות על סרטים על פי הוראות היצרן.
  10. לאחר לדמיין את להקות חלבון על סרטים, לשטוף את החלקים באמצע ההר ובתחתית הממברנה במשך 10 דקות עם פתרון הפשטת נוגדן. הדגירה ממברנות O / N ב TBST עם 3% BSA ונוגדנים נגד PKR הכולל (ב 1 ב 500) ו IRF3 (ב -1 מכל 1,000), עבור באמצע והחתיכות תחתונות, בהתאמה. חזור על שלבים 4.8. ו -4.9. באמצעות העכבר אנטי-עז שכותרתו peroxidase במקום של נוגדנים משני נגד ארנב עבור קרום PKR (באמצע).
  11. שטוף את הפיסה התחתונה של 5x הקרום למשך 5 דקות עם TBST ו דגירת הממברנה ב TBST עם BSA 3% במשך שעה 1 עם נוגדן נגד אקטין (מדולל ל 1 ב 5000). חזור על שלבים 4.8. ו -4.9. באמצעות עכבר אנטי-עז שכותרתו peroxidase במקום של נוגדנים משני נגד הארנב. דוגמא לתוצאות השוואת RNAs מבחן שונה כביקורת חיובית מסופקת באיור 5. ראה הטבלה של חומרים עבור הנוגדנים הספציפיים כדי לשמש.

תוצאות

סכימטי הכללי של הנהלים מוצג באיור 2 עם תכנית transfection לדוגמה עבור שלושה RNAs ניסיוניים RNA מלא מסופק באיור 2B. עבור מבחני כדאיות התא ייצור ויראליות, מחוץ לקרוא לכל מבנה המבחן מנורמל כביקורת שלילית. משכפל הם transfected בסטים, כך שכל RNA המבחן מנו...

Discussion

את assay ייצור HIV-1 תיאר בוצעה באמצעות תאים HEK293T (איור 2), והוא דומה מבחני לשמש מסך HIV-1 RNA עבור ribozyme שנכנס לתוקף ב -13, shRNA 10,29, siRNA 30, ו U1i RNA 11,31 אתרי היעד. באמצעות שיטות שונות כדי לכמת ייצור HIV-1, רוב המחקרים מדדו ייצור ויראלי 48 שעות לאחר שיתוף transfecti...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה המוצגת כאן נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (מעניק DCB-120,266, PPP-133,377 ו HBF-348,967 ל AG).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicillin/Streptomycin GibcoThermo Fisher15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.Corning353075, 353047, 353043
Micro tubes AxygenCorning311-08-051
Low molecular weight Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1MirusMIR 2300transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA template Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primerThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat paper Perkin Elmer1450-522
Microplate scintillation counterPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Microplate spectrophotometerBio-rad1706930
Lysis buffer tabletsRoche4693159001, 4906837001protease and phosphatase inhibitors
MicrocentrifugeEppendorf5415R
Bradford reagentBio-rad500-0006
Gel running chamberHoeferSE600
Semi-dry transfer cellBio-rad1703940
Protein ladder EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Nitrocellulose membraneBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Antibody stripping solutionMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher PI32106
ADAR1 antibodyfrom Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibodyAbcamab32036
phospho-S396-IRF3 antibodyCell Signaling4947
PKR antibodyfrom Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibodyCell Signaling11904
Actin antibodyMilliporeMAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbitKPL474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouseKPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5

References

  1. Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
  2. Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
  3. Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
  4. DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
  5. Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
  6. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
  7. Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
  8. Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
  9. Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
  10. McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
  11. Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
  12. Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
  13. Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
  14. Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
  15. Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
  16. Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
  17. Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
  18. Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
  19. Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
  20. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  21. Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
  22. Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  25. Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
  26. Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
  27. Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
  28. Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
  29. ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
  30. Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
  31. Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
  32. Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
  33. Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
  34. Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
  35. Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
  36. Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
  37. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
  38. Riss, T. L., et al., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual. , (2004).
  39. Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
  40. Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115HIV 1RNAMTTPKRADAR1TLR3IRF3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved