Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Resumo

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Resumo

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Introdução

Uma limitação dos actuais tratamentos do HIV-1 é que eles devem ser cronicamente administrado para prevenir a progressão da doença. Transplantação de VIH-1 resistente a linfócitos T, ou células-tronco hematopoiéticas, tem o potencial para proporcionar um controlo de longa duração de replicação do HIV-1 na ausência do tratamento medicamentoso ^1,2 e pode também ser uma abordagem eficaz para atingir uma cura de HIV-1 ^3. Uma maneira de tornar as células resistentes ao HIV-1 é a replicação para inserir um ou mais genes que codificam para anti-HIV-1 RNA ou péptidos em células de um indivíduo infectado durante um transplante autólogo ^4. Vários genes candidatos anti-VIH-1 foram concebidos com alguns estudos clínicos que entram em combinações de dois ou três ^{5 6,} para prevenir o desenvolvimento de resistência do HIV-1 para um único gene.

Anti-HIV-1 RNA estão entre os principais candidatos para a terapia de combinação de genes devido ao seu baixo potencial para provocar respostas imunes e porquesão transcritas a partir de sequências de genes muito curtos. Alguns-HIV-1 anti RNAs foram projetados para direcionar entrada e de integração viral. No entanto, a maioria dos ARNs anti-HIV-1 como alvo passos pós-integração no ciclo de vida viral (Figura 1). Inibidores pós-integração incluem RNAs de engodo, tendo como alvo os HIV-1 proteínas reguladoras Tat ou Rev ^1, e RNAs à base de anti-senso, tendo como alvo locais diferentes em HIV-1 RNA, como as ribozimas ^{7, 8} e shRNAs U1i RNAs ^9. Os métodos que foram utilizados para comparar a eficácia dos anti-HIV-1-RNA incluem a monitorização de replicação virai nas células transduzidas com genes que codificam para os ARN candidatas e medindo a produção virai em células transitoriamente transfectadas com plasmídeos que expressam os ARN candidatas e um plasmídeo de expressão de HIV-1 ^{10 -13.} Nós já usou um ensaio de produção HIV-1 para a tela HIV-1 RNA para sites de destino nova ribozimas ^13-15. Estes métodos já foram refinados para optimizar o formato de um ARNmolécula de interferência expressa a partir de DNA de plasmídeo como um shRNA ou entregue como um siARN sintética ^16. O ensaio mede a produção de vírus maduras a partir de células 293T de rim embrionário humano (HEK), e pode ser usado para comparar os efeitos dos inibidores que têm como alvo as etapas de pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1 (Figura 1). Para os inibidores que têm como alvo as etapas de pré-integração, ensaios alternativos, tais como um ensaio de infecciosidade de células TZM ^BL-17 são necessários para avaliar a eficácia antiviral.

As principais preocupações de segurança para a entrega de anti-HIV-1 RNA na clínica incluem potenciais efeitos fora do alvo em RNAs humanos ou proteínas, e ativação de sensores imune inata. Para avaliar a toxicidade do anti-HIV-1 siRNAs, utilizou-se um ensaio de viabilidade celular em diferentes linhas celulares ^16. Nós também medido activação dos sensores imunes ARN de cadeia dupla, ARN activada proteína quinase R (PKR) e Toll like receptor 3 (TLR3), bem como expressão do gene de interferão estimulada, p150 ADAR1. Estes ensaios podem ser utilizados para confirmar que a eficácia do anti-HIV-1 RNA não é devido aos efeitos indirectos sobre a viabilidade celular ou a activação do sensor imune. Eles são também úteis na exclusão com RNAs candidatos potenciais toxicidades de desenvolvimento posterior.

Nos seguintes protocolos, os procedimentos para identificar novos RNAs terapêuticos e optimizar o formato das existentes são descritos. Os métodos são úteis para inibidores pós-integração baseadas em ARN rastreio de HIV-1 da replicação e pode ser adaptado para o rastreio de outros inibidores pós-integração, tais como pequenas moléculas de direccionamento Rev exportação mediada por ARN viral ¹⁸ ou CRISPR / sistemas Cas concebidos para direccionar integrada HIV-1 DNA ^19.

Protocolo

1. Células e transfecções

1. Culturas de células HEK 293T em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Prepara-se uma suspensão de 2 x 10 ⁵ células / mL no meio de cultura celular. Adicionar 500, 100 e 1.000 mL da suspensão de células a cada poço de 24 poços, 96 poços e 12 poços placas, para a produção virai, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente (Figura 2A).
2. Agite suavemente as placas e incubar O / N a 37 ° C com 5% de CO _2. Cultivar células a 50-70% de confluência.
3. De acordo com um plano de transfecção, preparar diluições de ARN de teste e os controlos em tubos de 1,5 ml (micro exemplo, a Figura 2B).
   1. Para o ensaio de produção viral, preparar uma diluição de 10 ng / ul de um plasmídeo de expressão de HIV-1 e adicionar 10 uL a cada tubo. Próximo preparar 5 uM diluições de ARN de teste e um controlo negativo RNA. Adicionar 2,5 ou 10 ul de cada diluição de ARN de teste e de controlo negativo aos tubos correspondentes para 25 ou 100 nM de concentração final.
   2. Para o ensaio de viabilidade de células, preparar 5 uM diluições de ARN e um teste de 10 mg / ml de diluição do ARN de controlo positivo, de baixo peso molecular, poli I: C. Adicionar 2 mL de ARN de teste, ou de diluições de ARN controlo positivo para os correspondentes tubos de 100 nM ou 200 ug / ml de concentração final, respectivamente.
   3. Para o ensaio de activação imunitária, adicionar 20 ul de ARN de teste, ou de diluições de ARN de controlo positivo, preparado no passo 1.3.2. aos tubos correspondentes para 100 nm ou 200 ug / ml de concentração final, respectivamente.
      Nota: Para os plasmídeos de expressão de ARN de teste, preparar diluições de 10 ng / ul em vez dos 5 uM diluições de ARN de teste, dando quantidades finais de 25 e 100 ng para o passo 1.3.1. e 100 ng para etapas 1.3.2. e 1.3.3.
4. Adicionam-se 50, 25 ou 75 ul de DMEM a cada tubo de transfecção para prod viralução, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente. Para os ensaios de produção virais, trazem células e tubos de transfecção preparados para a 3 (BSL3) laboratório nível bio-segurança antes da próxima etapa.
5. Adicionar 2 ml da sequencialmente reagente de transfecção para os tubos de transfecção e incubar 15 min a 20 para permitir que os complexos de modo a formar. Ver a Tabela de Materiais para o reagente de transfecção específico a ser utilizado.
6. Adicionar toda a mistura de transfecção de cada gota a gota, para as posições correspondentes nas placas de cultura de células micro tubo. Agite suavemente e incuba-se as placas durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO _2.
7. Meça HIV-1 de produção (seção 2), a viabilidade celular (seção 3) e ativação imune (secção 4) nas placas de cultura de células (Figura 2C).

2. Ensaio de produção virai

1. Remover as placas de cultura celular de 24 poços da incubadora e agitar suavemente as placas no interior da cultura de células BSL3capuz. Transferir 150 ul de sobrenadante de cada poço para um poço correspondente de uma placa de 96 poços de fundo plano, que vai ser utilizado para quantificar a produção de HIV-1.
   Nota: Os ensaios de quantificação virais mais comuns incluem a medição da expressão da proteína da cãpside de HIV-1 (p24) pelo ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) ^20, a quantificação de ARN viral por transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) ²¹ e medindo a actividade da enzima RT HIV-1. Passos 2.2 a 2.5 explicar métodos para quantificar HIV-1 actividade RT ^13,15,16.
2. Transferência de 5 ul de sobrenadante para poços correspondentes de uma placa de 96 poços, contendo 25 ul de uma perturbação viral cocktail ¹⁵ (Tabela 1). Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente e transferir a placa para uma estação de trabalho radioactividade.
   Nota: Passo 2.2. só é necessário se uma estação de trabalho de radioactividade que não está disponível no laboratório BSL3. Se as placas não precisam de ser removidos dolaboratório BSL3, vá para o passo 2.3. e adicionar 50 ul de radioactivos / viral cocktail ruptura (Tabela 1) em lugar dos 25 ul de coquetel radioactivos.
3. Prepara-se uma radioactivos cocktail ¹⁵ (Tabela 1), e adicionar 25 ul a cada poço de sobrenadante viral e cocktail de interrupção. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 h.
4. Ponto 5 uL da mistura de reacção sobre quadrados correspondentes de uma fibra de vidro Di Etil amino-etil (DEAE) de papel filtermat e deixar que as gotas para secar durante 10 min. Manchar a mistura de reacção em todos os outros quadrados de modo que não há duas amostras Boarder diretamente um ao outro. Isto ajuda a evitar o cruzamento entre amostras para determinar as contagens por minuto (cpm) no passo 2.6.
5. Lavar os papéis 5x durante 5 min com tampão de 2x citrato de sódio salino (SSC) (Tabela 1), seguido por duas lavagens com um mínimo de 95% de etanol. Permitir que os papéis para secar e selá-los em sacos de amostras.
6. Clip sacos de amostras containing do papel filtermat em uma fita e insira a cassete em um contador de cintilação de microplacas. Definir o contador para ler cpm de ³² P com a data de referência prevista para o lote de ^[32 P] dTTP utilizado na experiência. Selecionar quais amostras de ler usando o mapa da placa e iniciar o contador.
7. Para qualquer método de quantificação viral, dividir os valores obtidos para cada teste de ARN pelo controlo negativo adjacente e multiplicar este valor por 100 para obter a percentagem de inibição da produção do VIH-1 para cada repetição dos ARN de teste. Um exemplo dos resultados que comparam diferentes RNAs de teste em diferentes concentrações é fornecido na Figura 3.

3. ensaio de viabilidade celular

1. Remover as placas de 96 poços a partir da incubadora e adicionar 20 uL de 5 mg / ml de MTT (brometo de 3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazólio), diluído em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco ( DPBS) a cada poço. Incubar as placas de fou 3 horas a 37 ° C.
2. Adicionar 150 uL de isopropanol, acidificado com detergente (1% de NP-40, de HCl 4 mM em isopropanol) a cada poço e incuba-se as placas durante 2 horas à temperatura ambiente.
3. Determinar a absorvância a 570 nm num espectrofotómetro de microplacas.
4. Calcular o metabolismo de MTT relativo para cada ARN de controlo e de teste positivo, dividindo o valor obtido para cada amostra pelo seu controlo de transfecção adjacente. Um exemplo dos resultados que comparam diferentes RNAs de teste e um controlo positivo é fornecida na Figura 4.

4. Activação Ensaio Imunológico

1. Remover as placas de 12 poços a partir da incubadora e aspirar o meio de cultura. Lavar suavemente as células duas vezes com DPBS e adicionar 70 ul de tampão de lise frio ^{de 22} (incluindo os inibidores de protease e fosfatase, quadro 1) a cada poço. Incubar as placas durante 10 min em gelo.
2. Transferir os lisados ​​celulares para micro tubos e rápido congelá-los por imersão dotubos em azoto líquido. Permitir que as amostras para descongelar e repetir por mais 2 ciclos de congelação descongelação para um total de 3.
3. Centrifugar os lisados ​​durante 15 minutos a 4 ° C, 15700 x g, para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante para novos tubos de micro e determinar a concentração de proteína usando o método de azul de Coomassie (Bradford) ^23,24.
4. Resolver 75 ug de proteína de cada amostra num gel de poliacrilamida desnaturante a 10% e transferir para uma membrana de nitrocelulose como anteriormente descrito ^25,26.
5. Após electroforese e transferência para uma membrana, revelam bandas de proteína por incubação da membrana em Ponceau S (Tabela 1) durante 1 min seguido de lavagem em água destilada duas vezes. Use as bandas e escada proteína como um guia para cortar a membrana em 80 e 55 kDa.
   Nota: No passo 4.4 amostras pode ser executado em 16 x 18 cm ² géis para baixo a 34 kDa, de modo que é fácil de cortar a membrana nas posições especificadas e não cortar através dabandas de interesse. Alternativamente, vários géis podem ser executados com as mesmas amostras para evitar o corte da membrana.
6. Lavar a coloração de Ponceau S com solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween 20 (TBST, Tabela 1). Adicionar TBST com leite não gordo a 5% para cobrir completamente as membranas. Incubam-se as membranas à temperatura ambiente com agitação durante 1 h.
7. Incubam-se as membranas de O / N em TBST, com 3% de albumina de soro bovino (BSA) e anticorpos diluídos a 1: 1000 contra ADAR1 (110 e 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), e fosfo-IRF3 (47 kDa), para as peças de topo, meio e inferior da membrana, respectivamente.
8. Lavam-se as membranas 5x durante 5 min com TBST e incubar em TBST com 5% de leite sem gordura e os anticorpos secundários anti-coelho de cabra marcado com peroxidase (diluído a 1: 5000) durante 1 h.
9. Lava-se a membranas de 5x durante 5 min com TBST e aplicar a solução de electroquimioluminescência (ECL) para visualizar as bandas em películas de acordo as instruções do fabricante.
10. Depois de visualizar as bandas de proteína sobre os filmes, lavar as peças do meio e inferior da membrana durante 10 minutos com uma solução de anticorpo de extracção. Incubam-se as membranas de o / n em TBST, com 3% de BSA e anticorpos contra PKR total de (a 1 em 500) e IRF3 (a 1 em 1000), para o meio e pedaços de fundo, respectivamente. Repita os passos 4.8. e 4,9. usando marcado com peroxidase de cabra anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho para a membrana PKR (meio).
11. Lava-se a peça de fundo da membrana 5x durante 5 min com TBST e incubar a membrana em TBST, com 3% de BSA durante 1 hora com um anticorpo contra actina (diluído a 1: 5000). Repita os passos 4.8. e 4,9. usando marcado com peroxidase de cabra anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho. Um exemplo de resultados comparando diferentes RNAs de teste e um controlo positivo é fornecido na Figura 5. Veja a Tabela de Materiais para os anticorpos específicos a serem utilizados.

Resultados

Um esquema geral dos processos é mostrado na Figura 2, com um plano de transfecção exemplo para três RNAs de teste e um ARN de controlo fornecida na Figura 2B. Para os ensaios de viabilidade celular de produção e virais, a leitura para cada construto de teste é normalizada para um controlo negativo. Os duplicados estão transfectadas em conjuntos, de modo que cada ARN teste é normalizado para o seu controlo negativo adjacente. Isto é feito para ...

Discussão

O ensaio de produção de HIV-1 descrita foi realizada utilizando células HEK293T (Figura 2) e é semelhante para os ensaios utilizados para rastrear ARN de HIV-1 para ribozima eficaz ^13, shRNA ^10,29, ARNsi ^30, e U1i locais de ARN alvo ^11,31. Usando diferentes métodos para quantificar a produção de HIV-1, a maioria dos estudos mediram a produção virai de 48 h após a co-transfecção de um plasmídeo de expressão do VIH-1 com RNAs candidatos. Após a pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HyClone	GE Healthcare	SH30243.01
FBS HyClone	GE Healthcare	SH30396.03
Penicillin/Streptomycin Gibco	Thermo Fisher	15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.	Corning	353075, 353047, 353043
Micro tubes Axygen	Corning	311-08-051
Low molecular weight Poly I:C	InvivoGen	3182-29-6
DharmaFECT-1	Dharmacon	T-2001-01	transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1	Mirus	MIR 2300	transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40)	USB	19628
[32P]dTTP	Perkin Elmer	BLU505H
poly(A) RNA template	Sigma-Aldrich	10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primer	Thermo Fisher	18418-012
DEAE filtermat paper	Perkin Elmer	1450-522
Microplate scintillation counter	Perkin Elmer	1450-024
MTT	Sigma-Aldrich	M-2128
DPBS HyClone	GE Healthcare	SH30028.02
Microplate spectrophotometer	Bio-rad	1706930
Lysis buffer tablets	Roche	4693159001, 4906837001	protease and phosphatase inhibitors
Microcentrifuge	Eppendorf	5415R
Bradford reagent	Bio-rad	500-0006
Gel running chamber	Hoefer	SE600
Semi-dry transfer cell	Bio-rad	1703940
Protein ladder EZ-Run	Thermo Fisher	BP3603-500
Nitrocellulose membrane	Bio-rad	162-0094
BSA	Sigma-Aldrich	A9647-1006
Antibody stripping solution	Millipore	2504
ECL - Pierce	Thermo Fisher	PI32106
ADAR1 antibody			from Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibody	Abcam	ab32036
phospho-S396-IRF3 antibody	Cell Signaling	4947
PKR antibody			from Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibody	Cell Signaling	11904
Actin antibody	Millipore	MAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbit	KPL	474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouse	KPL	474-1806
Ponceau S	Sigma-Aldrich	6226-79-5