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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Abstract

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Introduzione

Una limitazione di corrente trattamenti HIV-1 è che devono essere somministrati cronicamente per prevenire la progressione della malattia. Trapianto di HIV-1 resistenti linfociti T, o cellule staminali ematopoietiche, ha il potenziale per fornire un controllo a lungo termine della replicazione dell'HIV-1 in assenza di terapia farmacologica 1,2 e può anche essere un approccio efficace per raggiungere un HIV-1 cura 3. Un modo per rendere le cellule resistenti alla replicazione dell'HIV-1 è quello di inserire uno o più geni che codificano per anti-HIV-1 RNA o peptidi nelle cellule di un individuo infetto durante un trapianto autologo 4. Diversi candidati-HIV-1 anti-geni sono stati progettati con alcuni studi clinici che entrano in combinazioni di due o tre 5 6, per prevenire lo sviluppo di HIV-1 resistenza a qualsiasi singolo gene.

Anti-HIV-1 RNA sono tra i primi candidati per la terapia genica combinazione a causa del loro basso potenziale per suscitare risposte immunitarie e perchésono trascritti da sequenze geniche molto brevi. Alcuni-HIV-1 anti-RNA sono stati progettati per colpire l'ingresso e l'integrazione virale. Tuttavia, la maggior parte degli RNA anti-HIV-1 Target passaggi post-integrazione nel ciclo di vita virale (Figura 1). Inibitori post-integrazione includono RNA decoy, mira le HIV-1 Tat proteine ​​regolatrici o Rev 1, e RNA antisenso a base, il targeting siti diversi in HIV-1 RNA, come ribozimi 7, 8 e shRNAs U1i RNA 9. I metodi che sono stati utilizzati per confrontare l'efficacia di anti HIV-1-RNA includono il monitoraggio replicazione virale in cellule trasdotte con i geni codificanti per RNA candidati e misurando la produzione virale in cellule trasfettate con plasmidi esprimenti RNA candidati e uno di HIV-1 plasmide di espressione 10 -13. Abbiamo usato in precedenza un test di produzione di HIV-1 per lo screening HIV-1 RNA per il nuovo ribozima siti bersaglio 13-15. Questi metodi sono stati dal raffinato per ottimizzare il formato di un RNAmolecola interferenze espresso dal DNA plasmide come shRNA o consegnato come siRNA sintetico 16. Il test misura la produzione di virus maturi dalle cellule 293T umane embrionali renali (HEK), e può essere utilizzato per confrontare gli effetti degli inibitori che colpiscono fasi post-integrazione nel ciclo di replicazione dell'HIV-1 (Figura 1). Per gli inibitori che colpiscono fasi di pre-integrazione, sono necessari test alternativi come una prova di infettività delle cellule TZM-bl 17 per valutare l'efficacia antivirale.

I principali problemi di sicurezza per la fornitura di anti-HIV-1 RNA nella clinica includono potenziali effetti fuori bersaglio sulla RNA umani o proteine, e l'attivazione dei sensori del sistema immunitario innato. Per valutare la tossicità di anti-HIV-1 siRNA, abbiamo utilizzato un test di vitalità cellulare in diverse linee cellulari 16. Abbiamo anche misurato attivazione dei doppi sensori immuni RNA incagliati, RNA proteina chinasi attivata R (PKR) e Toll like receptor 3 (TLR3), nonché expressione dell'interferone stimolato gene, p150 ADAR1. Questi saggi possono essere usati per confermare che l'efficacia anti-HIV-1 RNA non è dovuto ad effetti indiretti sulla vitalità cellulare o attivazione del sensore immunitaria. Sono anche utili per escludere RNA candidati potenziali tossicità di ulteriore sviluppo.

Nelle seguenti protocolli, le procedure per identificare nuovi RNA terapeutici e ottimizzare il formato di quelli esistenti sono descritti. I metodi sono utili per gli inibitori della post-integrazione a base di screening di RNA di HIV-1 replicazione e potrebbero essere adattati per lo screening altri inibitori post-integrazione, come ad esempio piccole molecole di targeting Rev esportazione mediata di RNA virale 18 o CRISPR / sistemi Cas progettato per indirizzare integrato HIV-1 DNA 19.

Protocollo

1. Cellule e trasfezioni

  1. Culture cellule HEK 293T in terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Preparare una sospensione 2 x 10 5 cellule / ml nel terreno di coltura cellulare. Aggiungere 500, 100 e 1.000 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di 24 pozzetti, 96 e 12 pozzetti, per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria, rispettivamente (Figura 2A).
  2. Mescolare delicatamente i piatti e li incubare O / N a 37 ° C con 5% di CO 2. Crescere le cellule a 50-70% di confluenza.
  3. Secondo un piano di trasfezione, preparare diluizioni di RNA di prova e dei loro controlli in provette da 1,5 ml (micro esempio, la figura 2B).
    1. Per il saggio di produzione virale, preparare un 10 ng / ml di diluizione di HIV-1 plasmide di espressione e aggiungere 10 microlitri in ciascun tubo. Successivo preparare 5 micron diluizioni di RNA di prova e un RN controllo negativoA. Aggiungere 2,5 o 10 ml di ogni RNA di prova e la diluizione di controllo negativo ai corrispondenti tubi per 25 o 100 concentrazioni finali nm.
    2. Per il test di vitalità cellulare, preparare 5 pM diluizioni di RNA di prova e 10 mg / ml di diluizione dell'RNA controllo positivo, a basso peso molecolare Poly I: C. Aggiungere 2 ml di RNA test o diluizioni di controllo RNA positivi ai corrispondenti tubi per 100 nm o concentrazioni finali ml 200 mg /, rispettivamente.
    3. Per il saggio attivazione del sistema immunitario, aggiungere 20 ml di RNA test o diluizioni di RNA di controllo positivo previste al punto 1.3.2. ai corrispondenti tubi di 100 nm o 200 mg / ml concentrazione finale rispettivamente.
      Nota: Per il test di RNA plasmidi di espressione, preparare 10 ng / diluizioni microlitri al posto dei 5 micron diluizioni di RNA di prova, dando importi finali di 25 e 100 ng per passo 1.3.1. e 100 ng per passi 1.3.2. e 1.3.3.
  4. Aggiungere 50, 25 o 75 ml di DMEM ad ogni provetta trasfezione per prod viraleuzione, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario, rispettivamente. Per i saggi di produzione virale, portare le cellule e tubi trasfezione preparati per un 3 (BSL3) laboratorio di livello di bio-sicurezza prima del passaggio successivo.
  5. Aggiungere 2 ml di trasfezione reattivo sequenzialmente i tubi di trasfezione e incubare 15 a 20 minuti per consentire di formare complessi. Vedere la tabella dei materiali per la specifica del reagente di trasfezione da utilizzare.
  6. Aggiungere la miscela di trasfezione da ciascuna goccia a goccia alle posizioni corrispondenti nelle piastre di coltura cellulare tubicino. Agitare delicatamente e incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
  7. Misura HIV-1 di produzione (sezione 2), la vitalità cellulare (sezione 3) e l'attivazione immunitaria (sezione 4) nelle piastre di coltura cellulare (Figura 2C).

2. Assay La produzione virale

  1. Rimuovere le piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti da incubatore e mescolare delicatamente le piastre all'interno della coltura cellulare BSL3cappuccio. Trasferire 150 pl di surnatante da ogni pozzetto ad un corrispondente bene in una piastra inferiore 96 pozzetti piatta, che sarà utilizzato per quantificare HIV-1 di produzione.
    Nota: saggi titolazione virale comuni includono misurando l'espressione della proteina del capside di HIV-1 (p24) by enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) 20, quantificando RNA virale mediante trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) 21 e misurando l'attività di HIV-1 RT enzima. I passaggi da 2.2 a 2.5 spiegare i metodi per quantificare l'HIV-1 RT attività 13,15,16.
  2. Trasferimento 5 ml di surnatante in pozzetti in una piastra a 96 pozzetti, contenente 25 ml di una perturbazione virale cocktail 15 (Tabella 1). Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente e trasferire la piastra ad una workstation radioattività.
    Nota: Step 2.2. è necessaria solo se una workstation radioattività non è disponibile in laboratorio BSL3. Se le piastre non devono essere rimossi dallaboratorio BSL3, procedere al punto 2.3. e aggiungere 50 ml di radioattivi / virale perturbazione cocktail (Tabella 1) al posto dei 25 ml di cocktail radioattivi.
  3. Preparare una radioattivo cocktail 15 (Tabella 1), e aggiungere 25 ml a ciascun pozzetto di surnatante virale e cocktail interruzioni. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 ore.
  4. Spot 5 ml di miscela di reazione su piazze corrispondenti in una fibra di vetro Di Etile Amino etilico (DEAE) carta filtermat e consentire le macchie asciugare per 10 minuti. Spot la miscela di reazione su ogni altro quadrato in modo che non esistono due campioni Boarder direttamente l'un l'altro. Ciò consente di evitare cross-over tra i campioni per determinare i conteggi per minuto (cpm) al punto 2.6.
  5. Lavare le carte 5X per 5 minuti con 2x salina citrato di sodio (SSC) tampone (Tabella 1), seguito da due 1 min lavaggi con etanolo al 95%. Lasciare le carte a secco e sigillarli in sacchetti di campionamento.
  6. Clip portacampionari containing la carta filtermat in una cassetta ed inserire la cassetta in un contatore a scintillazione micropiastra. Impostare il contatore di leggere CPM per 32 P, con la data di riferimento previsto per la partita di [32 P] dTTP utilizzato nell'esperimento. Selezionare quali campioni da letto utilizzando la mappa piatto e avviare il contatore.
  7. Per qualsiasi metodo titolazione virale, dividere i valori ottenuti per ciascun RNA test il controllo negativo adiacente e moltiplicare tale valore per 100 per ottenere la percentuale di inibizione di HIV-1 di produzione per ciascun replicato degli RNA prova. Un esempio dei risultati confrontando i diversi RNA di prova, a diverse concentrazioni è fornita in figura 3.

3. vitalità cellulare Assay

  1. Rimuovere le piastre a 96 pozzetti dall'incubatore e aggiungere 20 ml di 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromide) diluito in tampone fosfato di Dulbecco ( DPBS) in ciascun pozzetto. Incubare le piastre Fo 3 ore a 37 ° C.
  2. Aggiungere 150 ml di isopropanolo acidificato con detergente (1% NP-40, 4 mM HCl in isopropanolo) a ciascun pozzetto ed incubare le piastre per 2 ore a RT.
  3. Determinare l'assorbanza a 570 nm in uno spettrofotometro per micropiastre.
  4. Calcolare il metabolismo MTT relativo per ciascun controllo e test di RNA positivo dividendo il valore ottenuto per ciascun campione per il controllo trasfezione adiacente. Un esempio dei risultati confrontando i diversi RNA di prova e un controllo positivo è fornito in Figura 4.

4. Immune attivazione del test

  1. Rimuovere le piastre da 12 pozzetti da incubatore e aspirare il terreno di coltura. Lavare delicatamente le cellule due volte con DPBS e aggiungere 70 ml di tampone di lisi freddo 22 (tra cui proteasi e fosfatasi inibitori, Tabella 1) in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 10 minuti in ghiaccio.
  2. Trasferimento lisati cellulari per tubi micro e veloce congelarli immergendo iltubi in azoto liquido. Consentire ai campioni di scongelare e ripetere per altri 2 cicli di gelo e disgelo, per un totale di 3.
  3. Centrifugare i lisati per 15 minuti a 4 ° C, 15.700 xg, per far sedimentare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in nuovi tubi micro e determinare la concentrazione di proteine ​​con il metodo 23,24 Coomassie blu (Bradford).
  4. Risoluzione 75 mg di proteine ​​di ogni campione in un gel di poliacrilammide denaturante al 10% e trasferimento su membrana di nitrocellulosa come precedentemente descritto 25,26.
  5. Dopo elettroforesi e trasferimento ad una membrana, rivelare bande proteiche incubando la membrana Ponceau S (Tabella 1) per 1 min seguita da lavaggio con acqua bidistillata. Utilizzare le bande e scaletta proteine ​​come guida per tagliare la membrana 80 e 55 kDa.
    Nota: Nel passo 4.4 campioni possono essere eseguiti su 16 x 18 cm 2 gel scorrimento a 34 kDa, in modo che sia facile da tagliare la membrana nelle posizioni specificate e non tagliare ilbande di interesse. In alternativa, alcuni gel possono essere eseguiti con gli stessi campioni per evitare di tagliare la membrana.
  6. Lavare la colorazione Ponceau S con soluzione salina Tris tamponata contenente 0,05% di Tween 20 (TBST, Tabella 1). Aggiungere TBST con latte non grasso 5% per coprire completamente le membrane. Incubare le membrane a temperatura ambiente con agitazione per 1 ora.
  7. Incubare le membrane O / N in TBST con 3% di albumina sierica bovina (BSA) e anticorpi diluito a 1 su 1.000 contro ADAR1 (110 e 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), e fosfo-IRF3 (47 kDa), per i primi, basso e intermedio pezzi della membrana, rispettivamente.
  8. Lavare le membrane 5X per 5 minuti con TBST e incubare in TBST con latte 5% senza grassi e di capra anti-coniglio anticorpi secondari perossidasi (diluito a 1 su 5.000) per 1 ora.
  9. Lavare il membrane 5x per 5 minuti con TBST e applicare la soluzione elettrochemiluminescenza (ECL) per visualizzare le bande in film, secondo le istruzioni del produttore.
  10. Dopo visualizzare le bande proteiche su film, lavare i pezzi intermedia ea valle della membrana per 10 minuti con una soluzione di anticorpi stripping. Incubare le membrane O / N in TBST con 3% di BSA e anticorpi contro PKR totale (a 1 a 500) e IRF3 (a 1 su 1.000), per la metà e pezzi di fondo, rispettivamente. Ripetere i punti 4.8. e 4.9. utilizzando marcato con perossidasi di capra anti-topo al posto del anticorpo secondario anti-coniglio per la membrana PKR (centro).
  11. Lavare il pezzo inferiore della membrana 5x per 5 minuti con TBST e incubare la membrana in TBST con 3% BSA per 1 ora con un anticorpo contro actina (diluito 1 a 5000). Ripetere i punti 4.8. e 4.9. utilizzando marcato con perossidasi di capra anti-topo al posto del anticorpo secondario anti-coniglio. Un esempio dei risultati che confrontano diversi RNA di prova e un controllo positivo viene fornito nella Figura 5. Vedere la tabella di materiali per i anticorpi specifici da utilizzare.

Risultati

Uno schema generale delle procedure è mostrata in figura 2 con un piano trasfezione esempio per tre RNA di prova e un RNA di controllo fornito in Figura 2B. Per i saggi di produzione e vitalità cellulare virali, la lettura per ciascun costrutto test è normalizzata a un controllo negativo. Replicati vengono trasfettati in serie, in modo che ogni RNA test viene normalizzato al suo controllo negativo adiacente. Questo viene fatto per evitare dati impreci...

Discussione

L'HIV-1 test di produzione, definita è stata effettuata utilizzando cellule HEK293T (Figura 2) ed è simile a dosaggi utilizzati per lo screening HIV-1 RNA per ribozyme efficace 13, shRNA 10,29, siRNA 30, e U1i RNA siti 11,31 bersaglio. Utilizzando diversi metodi per quantificare l'HIV-1 di produzione, la maggior parte degli studi hanno misurato la produzione virale 48 ore dopo la co-trasfezione di HIV-1 RNA plasmide con candidati. Dopo la produzione ...

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

Il lavoro qui presentato è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (concede DCB-120266, PPP-133.377 e 348.967 HBF-a AG).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicillin/Streptomycin GibcoThermo Fisher15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.Corning353075, 353047, 353043
Micro tubes AxygenCorning311-08-051
Low molecular weight Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1MirusMIR 2300transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA template Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primerThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat paper Perkin Elmer1450-522
Microplate scintillation counterPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Microplate spectrophotometerBio-rad1706930
Lysis buffer tabletsRoche4693159001, 4906837001protease and phosphatase inhibitors
MicrocentrifugeEppendorf5415R
Bradford reagentBio-rad500-0006
Gel running chamberHoeferSE600
Semi-dry transfer cellBio-rad1703940
Protein ladder EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Nitrocellulose membraneBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Antibody stripping solutionMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher PI32106
ADAR1 antibodyfrom Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibodyAbcamab32036
phospho-S396-IRF3 antibodyCell Signaling4947
PKR antibodyfrom Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibodyCell Signaling11904
Actin antibodyMilliporeMAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbitKPL474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouseKPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5

Riferimenti

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