JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

האינטראקציה בין ערוצי HCN ו למקטע העזר שלהם זוהה כיעד טיפולי הפרעת דיכאון מג'ורית. כאן, שיטת קרינה מבוססת קיטוב לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של אינטראקציה בין חלבונים זה, מוצגת.

Abstract

ערוצי נוקלאוטיד-מגודר מחזוריים מופעל hyperpolarization (HCN) באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף בכל רחבי המוח, שם הם מתפקדים להסדיר את הרגישות של נוירונים. חלוקת subcellular של הערוצים הללו עצב פירמידליים של האזור בהיפוקמפוס CA1 מוסדרת tetratricopeptide חלבון אינטראקציה חוזר המכיל Rab8b (TRIP8b), גידול למקטע עזר. נוקאאוט גנטי של HCN נקבובית להרכיב יחידות משנה או TRIP8b, הוא להוביל לעלייה בהתנהגות נגד דיכאון דמוי, דבר המצביע כי הגבלת הפונקציה של ערוצי HCN עשויה להיות שימושית כטיפול בהפרעת דיכאון מג'ורית (MDD). למרות עניין טיפולי משמעותי, ערוצי HCN באים לידי ביטוי גם בלב, שם הם מווסתים מקצב. כדי לעקוף בעיות מחוץ יעד הקשורים חסימת ערוצי HCN לב, במעבדה שלנו הציעה לאחרונה מיקוד האינטראקציה בין החלבונים בין HCN ו TRIP8b כדי להפריע לפעילות של ערוץ HCN במיוחד במוח.TRIP8b נקשר נקבובי HCN להרכיב יחידות משנה בשני אתרי אינטראקציה מובהקים, אף כאן הדגש הוא על האינטראקציה בין חוזרות tetratricopeptide (TPR) תחומים של TRIP8b ואת זנב C המסוף של HCN1. בפרוטוקול זה, תיאור מורחב של שיטה לטיהור TRIP8b וביצוע מסך תפוקה גבוהה לזהות מעכבי מולקולה קטנה של האינטראקציה בין HCN ו TRIP8b, מתואר. השיטה לסינון תפוקה גבוהה מנצלת קיטוב קרינה (FP) מבוסס assay לפקח על כריכה של שבר TRIP8b גדול על אחת עשר-tagged fluorophore אמינו פפטיד החומצה מתאים זנב מסוף HCN1 C. שיטה זו מאפשרת 'מכה' תרכובות כדי לזהות המבוססת על שינוי הקיטוב של האור הנפלט. מבחני אימות מבוצעים ואז לבטח 'מכה' תרכובות אינן artifactual.

Introduction

ערוצי נוקלאוטיד-מגודר מחזוריים מופעל hyperpolarization (HCN) באים לידי ביטוי על הלב ועל מערכת עצבים מרכזית, שם הם ממלאים תפקיד חשוב בויסות קרום רגישות 1. ערוצי HCN היו מעורבים בפתוגנזה של הפרעת דיכאון מג'ורי (MDD) 2, אשר הובילה מספר קבוצות להציע כי הגבלת פרמקולוגית פונקצית ערוץ HCN עשויה להיות יעילה כמו טיפול חדשני MDD 3. עם זאת, מיקוד HCN ערוצים ישירות אינו בת קיימא בגלל התפקיד החשוב שלהם פוטנציאל הפעולה של לב 4. Ivabradine, ה- FDA אישר רק אנטגוניסט ערוץ HCN, משמש לטיפול באי ספיקת לב לייצר אפקט bradycardic 5. ככזה, יש צורך הסוכנים תרופתיים המגבילים פונקצית ערוץ HCN בלעדי במערכת העצבים המרכזית.

Tetratricopeptide לחזור המכילים חלבון אינטראקציה Rab8b (TRIP8b) הוא ספציפי במוחFIC למקטע עזר של ערוצי HCN שולט ביטוי המשטח והלוקליזציה של ערוצי HCN 6,7. נוקאאוט גנטי של TRIP8b גורמת לירידה של ערוצי המוח HCN 7 מבלי להשפיע ביטוי HCN בלב 8. מעניין, עכברים בנוקאאוט TRIP8b להשקיע פחות נייחי זמן על משימת לשחות בכפיית השעית זנב המשימה 7, שתי בדיקות סינון נפוצות עבור יעילות נגד דיכאון 9-11. תוצאות אלו מצביעות כי במקום ישירות מיקוד ערוצי HCN עם אנטגוניסט מולקולה קטן של פונקצית ערוץ HCN, לשבש את יחסי הגומלין בין TRIP8b ו HCN עשוי להיות מספיק כדי לייצר התנהגות נוגדת דיכאון דמוי.

TRIP8b נקשר HCN בשני אתרים מחייב ברורים. תחום המחייב המחזורי נוקלאוטיד (CNBD) של HCN אינטראקציה עם תחום שימור של מסוף TRIP8b ממוקם N אל תחומי TPR של 12,13 TRIP8b. למרות השאריות של CNBD כי הם מעורבים זהאינטראקציה מופתה 14, באזור של TRIP8b כי הוא מעורב לא הצטמצם מעבר AN-80-אמינו שבר חומצה 13. אינטראקציה שנייה מתרחשת בין חוזרות tetratricopeptide (TPR) התחומים של TRIP8b ואת tripeptide מסוף C של HCN ( "SNL" ב HCN1, HCN2, ו HCN4, אבל 'ANM' ב HCN3) 3,12. המבנה הגבישי נפתר לאחרונה 15 אינטראקצית זנב C זה חשף דמיון מבני מהותי באינטראקציה בין הקולטן יבוא peroxisomal, peroxin 5 (PEX5), ועל אינטראקצית שותפים, המכילה סוג 1 רצפי מיקוד peroxisomal (PTS1) 16.

למרות ששני אתרי האינטראקציה נדרשים לתפקוד ערוץ HCN, האינטראקציה בין תחומי TPR של TRIP8b ואת tripeptide מסוף C של HCN1 משמשת אתר הקישור הדומיננטי מסדיר ביטוי משטח HCN. לכן, אינטראקציה זו נבחרה כאתר המיקוד במחקר זה.במשך שארית של כתב היד, כאשר הפניה נעשית כדי האינטראקציה בין TRIP8b ו HCN, זה אינטראקציה זו שאליה מתייחס אליהם. אינטראקציה זו הוא סכם מרסיס מסיס מאוד של TRIP8b המתאים מסוף C המשומר שלה המכיל את תחומי TPR הנדרשים מחייב זנב C המסוף של HCN (שאריות 241-602 של 1a-4 isoforms של TRIP8b) 3.

על מנת לפתח מסך תפוקה גבוה לזהות מולקולות קטנות מסוגלות לשבש את האינטראקציה הזאת, קיטוב קרינה (FP) מבוסס assay הועסק 17. קיטוב הקרינה מבוסס על עירור של ליגנד מתויג fluorophore עם אור מקוטב, ומדידת מידת הקיטוב של הקרינה הנפלטת 18. בנוכחות שותף מחייב, התנועה הסיבובית של ליגנד הניאון מוגבלת ואור מקוטב נפלט 19. בהיעדר שותף מחייב, tהוא תנועה סיבובית של ליגנד מוביל פליטת אור depolarized.

בפרוטוקול המצורף, שיטה לטיהור מתויג מסוף N (6xHis) TRIP8b (241-602) באמצעות חומצה ניקל-nitrilotriacetic (Ni-נ.ת.ע) חרוזים מוצג. פרוטוקול דומה הועסק לטהר את גלוטתיון-S-transferase (GST) -tagged C מסוף 40 חומצות אמינו של HCN1 (C40 HCN1) המשמש בשלב 7 של הפרוטוקול. משיקולי שטח, תיאור מפורט של ההליך שהושמט.

בשנת צעדים 2 עד 7 של הפרוטוקול, עבודת הקרנת תפוקה גבוהה מוצגת (ראה איור 1). אינטראקציות בין חלבונים הן מטרה קשה לשמצה לסינון תפוקה גבוהה וקוראים מומלצים לחפש משאבים נוספים בנושא 20.

שלבי 2 ו -3 לפקודת הפרוצדורה לאפיין את הזיקה במבחנה של TRIP8b המטוהר (241-602) לבנות FOra isothiocyanate והעמסת (FITC) -tagged עשרה פפטיד החומצות האמיניות המתאים הזנב מסוף C של HCN1 (HCN1 FITC). בהתבסס על המבנה הגבישי של TRIP8b-HCN 15 מורכבות, רצף חומצות האמינו עשר זה מספיק כדי לייצר מחייב עם TRIP8b (241-602). בשלב 2, ד K של האינטראקציה נמדדת על ידי titrating TRIP8b (241-602) לתוך ריכוז קבוע של HCN1 FITC. בשלב 3, גרסה ללא תווית של הפפטיד HCN בשימוש בשלב 2 הוא טיטרציה לתוך ריכוז קבוע של שני TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC לבחון אם תג FITC מפריע מחייב. ניסויים אלה חיוניים בחירת הריכוזים המתאימים של TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC המשמשים במסך קצב העברת נתונים הגבוה.

נחת היסוד של מסך התפוקה הגבוהה היא מולקולה קטנה מסוגלת לשבש את יחסי הגומלין בין TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC יפיק דצמברrease לאור מקוטב. בשלב 4, הגורם Z של assay מחושב 21 עבור ריכוז נתון של TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC כדי להבטיח כי assay מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (שלב 5). שלבי 6 ו -7 הם מבחני אימות כדי לאשר כי הנפילות במסך התפוקה הגבוהה העיקרי פועלות ע"י שיבוש האינטראקציה בין TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC ולא באמצעות מנגנון ספציפי. בשלב 6, carboxytetramethylrhodamine (טמרה) -labeled HCN1 פפטיד (HCN1 טמרה) משמש ב assay קיטוב הקרינה זהה אחרת לסנן תרכובות פלורסנט שמסכנת את assay FP שימוש בתג FITC. שלב 7 מנצל שבר מסוף HCN1 C גדול (HCN1 C40) ומעסיק assay קרב מבוסס חרוז, אשר מבוססת על "מינהור" של חמצן גופייה מן חרוז תורמות חרוז acceptor הביא קרובים אחד לשני על ידי אינטראקצית חלבונים 22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

טיהור 1. TRIP8b (241-602) חלבון

  1. להפוך את פלסמיד המכיל TRIP8b (241-602) ב pGS21 וקטור ביטוי חלבון חיידקי 3 לתוך E. המוסמכת coli עבור ביטוי החלבון על פי הוראות היצרן. פלייט 300 μl של התרבות על לוריא מרק (LB) -agar עם 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Chloramphenicol ו אמפיצילין. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
  2. למחרת, פיק מושבה אחת לחסן 50 מ"ל LB עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Chloramphenicol ו אמפיצילין. דגירת התרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות (עם רעד).
  3. הוסף תרבות 50 מ"ל עד 1 ליטר של LB עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אמפיצילין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
  4. לאחר התרבות הגיעה קריאה OD 600 של 0.8-1.2, לשנות את הטמפרטורה של החממה עד 18 מעלות צלזיוס ומוסיפים IPTG (איזופרופיל-Beta-D-Thiogalactoside) לריכוז סופי של 1 מ"מ. אפשר ביטוי חלבון להמשיך במשך 16 שעות.
  5. ספין למטה E. coli ב 6,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C עד גלול חיידקים. לאחר הסרת הצינורות מן צנטריפוגות, לשמור על חיידקים על קרח למשך הנותרים של ההליך. Resuspend החיידקים 36 מ"ל של חיץ עם 0.25 מ"מ של פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF).
  6. Sonicate חיידקים resuspended על הקרח באמצעות בורג שטוח למשך 5-10 דקות, לסירוגין בין 30 שניות 'על' ו -30 'off' שניות בהספק גבוה.
  7. צנטריפוגה XG ב 12,000 במשך 15 דקות ב 4 °. צנטריפוגה עבור 15 דקות נוספות אם supernatant לא ברור עדיין.
  8. החל את supernatant לעמודה של 2 מ"ל חרוזים Ni-נת"ע. דגירה של 60 דקות ב 4 ° C עם נדנדה עדינה.
  9. אפשר החומר מאוגד לזרום דרך העמודה ולשטוף עם 500 מ"ל של הצפת א
  10. לשטוף את העמודה עם 250 מ"ל של הצפת B.
  11. לשטוף את העמודה עם 125 מ"ל של חיץ בתוספת imidazole 5 מ"מ.
  12. Elute החלבון הלוך ושובמ 'בעמודה עם 20 מ"ל הצפת elution.
  13. מוסיפים את החלבון eluted על (הפסקת משקל מולקולרי - 10 KDA) קלטת דיאליזה באמצעות מזרק. Dialyze חלבון למשך 60 דקות ב 4 ליטר של קר בופר פוספט (PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
  14. הזז את קלטת דיאליזה לדלי 4 L חדשה של PBS קר. Dialyze חלבון במשך 16 שעות ב 4 o C.
  15. למחרת בבוקר, לבדוק את ריכוז החלבון באמצעות ערכת assay חלבון Coomassie, בעקבות הוראות היצרן. לרכז את החלבון באמצעות concentrator חלבון, בעקבות הוראות היצרן, אם כמות נמוכה מ -40 מיקרומטר הוא ציין. Aliquot ולהקפיא ב -80 ° C לאחסון.

2. Small Scale קרינת Assay הקיטוב לאפיין את האינטראקציה של שני שברי החלבון

  1. להפשיר 200 μl של 40 מיקרומטר TRIP8b (241-602) ולהוסיף אותו צינור 1.5 מ"ל. הוספת 100 μl של PBS על 11 צינורות נוספים 1.5 מ"ל.
  2. בצע דילולים סדרו על ידי העברת 100 μl של TRIP8b (241-602) מהצינור המקורי אל הצינור הבא בסדרה, pipetting למעלה ולמטה, ולחזור על התהליך. זה יהיה לייצר סדרה של 12 נקודות של דילולים של פי 2 של TRIP8b (241-602) החל 0.01-40 מיקרומטר.
  3. הכינו תערובת אמן 650 μl של 0.1 מיקרומטר HCN1 FITC (6.5 μl של aliquot 10 מיקרומטר) ו -2 מ"מ Dithiothreitol (DTT) ב- PBS.
    הערה: מיקס מאסטר הוא 2x.
  4. גדר 12 1.5 מיליליטר צינורות חדשים. הוסף 50 μl של מיקס מאסטר המכיל HCN1 FITC על צינור אחד, ולאחר מכן להוסיף 50 μl מכל אחד 12 דילולים סדרתי.
    הערה: זה יפיק 12 צינורות, שכל אחת מהן מכילה 0.05 מיקרומטר HCN1 FITC וחצי של ריכוז TRIP8b (241-602) מן דילול סדרתי המקורי.
  5. מוסיפים את סדרת דילול צלחת assay, 30 μl לכל טוב, בשלושה עותקים. השתמש בצלחת 384 גם שחור נמוכה מחייב מוצקה.
  6. ספין הצלחת fאו 2 דקות ב 900 XG ב RT.
  7. קרא את הצלחת באמצעות קורא microplate, בעקבות הוראות היצרן. מדוד קיטוב הקרינה באמצעות הפרמטרים המדידה הבאים: 485 עירור ננומטר, 530 פליטה ננומטר, 505 מראה dichroic ננומטר, 100 זמן אינטגרציה msec.
  8. מגרש את ערכי קיטוב (MP) מול TRIP8b (241-602) ריכוז על סולם לוגריתמים. להתאים את הנתונים עם משוואת היל כדי לקבוע את (ד K) זיקה של TRIP8b (241-602) לייצור הפפטיד HCN1 שכותרתו.
    הערה: להכנת דילולים סדרתי, צלחת רב גם יכול לשמש גם במקום צינורות.

3. לבדוק את קשרי גומלין החלבונים באמצעות בקרה חיובית

  1. הוסף 200 μl של פפטיד HCN1 ללא תווית (200 מיקרומטר) לצינור 1.5 מ"ל. הוספת 100 μl של PBS על 11 צינורות נוספים 1.5 מ"ל. בצע דילולים סדרו על ידי העברת 100 μl מהצינור המכיל 200 μl של הפפטיד אל הצינור הראשוןשל 100 μl PBS. חזור על התהליך על מנת ליצור 12 צינורות עם 2 דילולים לקפל של פפטיד HCN1 ללא תווית.
  2. הכינו תערובת אמן 650 μl של 0.2 מיקרומטר HCN1 FITC ו -4 מיקרומטר TRIP8b (241-602).
    הערה: זהו פתרון 2x.
  3. הוסף 50 μl של מיקס מאסטר 12 1.5 מ"ל צינורות חדשים.
  4. הוסף 50 μl של כל דילול סדרתי לצינור 1.5 מ"ל.
  5. טען את הצלחת microtiter 384 גם שחור בשלושה עותקים, הוספת 30 μl לכל טוב.
  6. צנטריפוגה את הצלחת למשך 2 דקות ב 900 XG ב RT.
  7. קרא את הצלחת באמצעות קורא microplate מסוגל FP. השתמש באותן הגדרות כמתוארות בשלב 2.7.
  8. חשב את הזיקה של הפפטיד ללא תווית עבור TRIP8b (241-602) באמצעות המשוואה Cheng-Prusoff: K ד 1 = IC 50 / (1 + [L] / K ד 2), כאשר K ד 1 מייצג את הזיקה של תווית פפטיד עבור TRIP8b (241-602), 50 IC נקבע בשלב הקודםומייצג את היכולת של ליגנד ללא תווית לעקור ליגנד שכותרתו, [יב] הוא ריכוז ליגנד שכותרתו בשלב 3.2, ו- K d 2 הזיקה של TRIPb (241-602) עבור ליגנד שכותרתו.

4. הערכת ביצועי Assay (פקטור Z חישוב)

  1. הכינו תערובת אמן על ידי ביצוע 12 מ"ל פתרון של חיץ FP עם 2 מיקרומטר TRIP8b (241-602), 50 ננומטר HCN1 FITC, ו 1 מ"מ DTT חוצץ FP.
    הערה: זה ידרוש 60 μl של 40 מיקרומטר TRIP8b (241-602), 60 μl של 10 מיקרומטר HCN1 FITC, ו 1,080 μl של הצפת FP.
  2. הוסף 30 μl של מיקס מאסטר היטב בכל צלחת microtiter שחור 384 גם.
  3. הוסף 1 μl של 1 מ"מ פפטיד HCN1 ללא תווית 192 בארות לשמש כביקורת חיובית.
  4. הוסף 1 μl של חיץ FP 192 בארות לשמש כביקורת שלילית.
  5. צנטריפוגה את הצלחת למשך 2 דקות ב 900 XG ב RT.
  6. קראו את הצלחת באמצעות מיילקורא croplate.
  7. חשב את גורם Z עבור assay באמצעות הנוסחה הבאה: Z = 1 - 3 * (σ pos -σ נג) / (μ נג -μ pos) שם קופה σ ו נג σ הם סטיות התקן של בארות שליטה חיוביות ושליליות קופה, ו μ ו נג μ לייצג את האותות הממוצע בארות שליטה חיוביות ושליליות.

5. מסך תפוקה גבוהה

  1. להפשיר aliquots של TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC ולשמור אותם על הקרח.
  2. הכן 10 מ"ל של TRIP8b (2 מיקרומטר) HCN1 FITC (50 ננומטר) במאגר FP.
  3. לוותר 25 μl של התערובת לתוך באר כל לשפל מחייב 384 גם צלחת microtiter שחורה בעזרת פיפטה.
  4. להקרנת ספרייה, להוסיף תרכובות לבאר כל בעמודות 3 22 (40 מיקרומטר ריכוז סופי לכל אחד) באמצעות מטפל נוזל אקוסטית.
    הערה: בשל relativelאחוזי ההצלחה y נצפים נמוכים עם assay זה, שני מתחמים שונים היו נקוו לבאר יחיד. שתיים מהן הוכח מבאר כל פעיל לאחר מכן נבדקו בנפרד לזהות אילו העניק את הפעילות.
  5. הוספת 100 nl של sulfoxide דימתיל (DMSO) לבאר כל עמודות 1 ו -23 של כל צלחת כפי שולטת שלילית.
  6. הוספת הפפטיד HCN1 ללא תווית לבאר כל עמודות 2 ו -24 של כל צלחת שולטת חיובית.
  7. דגירת הצלחות ב RT עבור 2 שעות. קראו צלחות או דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות לפני הקריאה.
  8. מדוד קיטוב קרינה על קורא צלחת. השתמש באותן הגדרות כמתוארות בשלב 2.7.
  9. חישוב עיכוב אחוז על ידי נרמול אותות באמצעות בקרות חיוביות ושליליות הממוצעת מכל צלחת כמו 100%. השתמש במשוואה XN = 100% * ((X נג - X) / (X נג - X POS)) כאשר X N הוא עיכוב אחוז מנורמל המתאים האות X, pos X הוא האות הממוצע מבאר בקרה החיובית, ו- X נג הוא אות מבארות הבקרה השליליות.

6. אישור של להיטי שימוש מתויג טמרה פפטיד HCN

  1. אמת פוגעת עם למעלה מ -50% עיכוב באמצעות טמרה שכותרתו פפטיד HCN1 (HCN1 טמרה).
    1. להכין תערובת מאסטר של 12 מ"ל של 2 מיקרומטר TRIP8b (241-602) ו -50 ננומטר HCN1 טמרה FP חיץ.
    2. לוותר 25 μl של מיקס מאסטר לבאר כל צלחת microtiter שחור 384 גם.
    3. עבר דילולים סידוריים של כל תרכובות פעילות לתוך הבארות בהתאמה. הפוך שני דילולים לקפל כך הריכוז של כל התאמה נעה בין 0.2 מיקרומטר עד 200 מיקרומטר.
    4. לקבלת התגובות השליטות השליליות, להעביר 100 nl של DMSO לבאר כל אחד. לקבלת השליטה החיובית להוסיף 100 nl של פפטיד HCN1 ללא תווית בדילול סדר עם ריכוז סופי החל 200μM כדי 0.1μM.
    5. דגירה את הצלחת ב RTעבור 2 שעות. קראו צלחות או דגירה במשך 16 שעות ב 4 ° C לפני הקריאה.
    6. מדוד קיטוב הקרינה (MP) באמצעות פרמטרים המדידה הבאים: עירור ננומטר 535; 580 פליטה ננומטר; 535 מראה dichroic ננומטר, 20 זמן אינטגרציה msec.
    7. חישוב ערכי 50 IC ידי התאמת הנתונים התלויים FP ריכוז של כל מתחם באמצעות מודל רגרסיה ליניארית ארבעה פרמטר 23.

7. אימות מנה-תגובה של Assay הסמיכה מבוססת חרוז

  1. להפשיר 1 aliquot של שלו מתויג TRIP8b (241-602) (-TRIP8b שלו) ו HCN1 מתויג-GST חלבונים היתוך (GST- HCN1 C40) ולשמור אותם על הקרח.
  2. שלב-TRIP8b שלו עם GST-HCN1 C40 חיץ assay בריכוזים של 400 ננומטר-TRIP8b שלו ו -40 ננומטר GST HCN1 C40. כן 300 μl של התערובת לכל מתחם להיבדק.
    הערה: תרכובות מנוהלות בשלושה עותקים ב -11 ריכוזים שונים בתוספת DMוקונטרול (אין מתחם).
  3. עבור בארות שליטה, להכין 30 μl של TRIP8b שלו (200 ננומטר) ללא GST-HCN1C40 ולאחר מכן בנפרד להכין 30 μl של GST-HCN1C40 (20 ננומטר) ללא-TRIP8b שלו במאגר assay.
  4. עבור כל המתחם להיבדק, להוסיף 7 μl של שלו-TRIP8b: תערובת GST-HCN1 C40 (מוכן בשלב 7.2 לעיל) ל -36 בארות צלחת בעזרת פיפטה 16 ערוצים. לבדיקת תרכובת אחת, לארגן 12 הריכוזים השונים בשורות AL והשלושה המשכפל בטורי 1-3. להוסיף 7 μl של הפתרון שלו-TRIP8b (שהוכנו 7.3) לעמודות 1-3 מתוך שורה M ו- 7 μl של פתרון GST-HCN1 C40 (שהוכנו 7.3) לעמודות 1-3 של נ בשורה צנטריפוגות בקצרה את הצלחת להבטיח את הנוזלים נמצאים בתחתית של כל טוב כדי להסיר בועות.
  5. מחלקים את תרכובות להיט להיבדק לתוך צלחת כזו כי ריכוז כל התאמה נע בין 200 מיקרומטר (ברצף) עד 0.1 מיקרומטר (בשורה K). לוותר על נפחDMSO ב LN שורות התואמת את כמות מתחם לוותר בשורות AK.
  6. לנער את הצלחת למשך 2 דקות ו דגירה של 2.5 שעות ב RT.
  7. לדלל את החרוזים אנטי GST המקבל 01:50 עם חיץ assay.
  8. להוסיף 3.5 μl של חרוזים המקבל מדולל היטב בכל צלחת עם טפטפת 16 ערוצים ומערבבים ידי pipetting בעדינות כדי למנוע יצירת בועות.
  9. הדגירה הצליחה במשך שעה 1 ב RT בחושך.
  10. לדלל את החרוזים התורמים ניקל Chelate 01:50 עם חיץ assay. אין לחשוף את התערובת אל האור.
  11. להוסיף 3.5 μl של חרוזים התורם מדולל היטב בכל צלחת עם טפטפת 16 ערוצים ומערבבים ידי pipetting בעדינות כדי למנוע יצירת בועות.
  12. הדגירה הצליחה במשך 1.5 שעות ב RT בחושך.
  13. קראו על קורא צלחת. שימוש בקורא צלחת עם פרמטרי המדידה הבאות: 40 msec עירור זמן, 100 זמן פליטת msec, גובה זיהוי 0.1 מ"מ.
  14. חישוב ערכי 50 IC ידי נתונים מתאימים EACh מתחם באמצעות מודל רגרסיה ליניארית ארבעה פרמטר 23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי למנוע בעיות זכויות יוצרים עם בפרסום הקודם שלנו, בדיקה מתויגת-טמרה HCN1 טמרה הייתה השתמשה כדי ליצור איורים 2 ו -3. שים לב החלפה זה לא עשתה הבדל ניכר בתוצאות, והפרוטוקולים זהים לאלה שתוארו לעיל עם HCN1 FITC. כדי להעריך את האינ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בגלל הפוטנציאל שלה כיעד טיפולי ב MDD 24, חלה התעניינות רבה בגישות תרופתיות כי להרגיז פונקצית ערוץ HCN במערכת העצבים המרכזית 4. עם זאת, מאמצים אלה היו עוכבו על ידי התפקיד החשוב של ערוצי HCN ב pacemaking לב ואת הסיכון של הפרעות קצב 25. סברנו כי לשבש את יחסי הגומלין ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ni-NTA agarose Qiagen30210
Dialysis cassette ThermoFisher66456
Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside Sigma-AldrichI5502 - 1 gr
384-Well Black plate Corning3820
Proxiplate Perkin-Elmer 6008289
Anti-GST Acceptor beads Perkin-Elmer 6760603C
NiChelatePerkin-Elmer AS101D
pGS21-aGenscriptSD0121
PMSFSigma-Aldrich10837091001
Coomassie KitThermoFisher23200
Protein concentratorThermoFisher88527
Perkin Elmer Enspire Multimode Plate readerPerkin-Elmer #2300-001M
BL21 (DE3) Competent CellsAgilent200131

References

  1. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
  2. Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (244), pe44(2012).
  3. Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
  4. Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
  5. Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
  6. Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
  7. Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
  8. Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
  9. Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
  10. Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
  11. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  12. Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
  13. Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
  14. Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
  15. Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
  16. Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
  17. Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
  18. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  19. Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).
  20. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
  23. Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. , Worth Publishers. New York. (2000).
  24. Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
  25. Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
  26. DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
  27. Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
  28. Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
  29. Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  30. Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
  31. Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -W. Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
  32. McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
  33. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  34. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

117HCNTRIP8b

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved