Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Zusammenfassung

Die Wechselwirkung zwischen HCN-Kanäle und deren Hilfsuntereinheit als ein therapeutisches Ziel in der Major Depressive Disorder identifiziert worden. Hier wird eine Fluoreszenzpolarisationsgestütztes Verfahren zur Identifizierung von Kleinmolekül-Inhibitoren dieser Protein-Protein-Interaktion, dargestellt.

Zusammenfassung

Hyperpolarisations-aktivierte cyclische Nukleotid-gesteuerten (HCN) Kanäle ubiquitär im Gehirn exprimiert wird, wo sie dazu dienen, die Erregbarkeit von Neuronen zu regulieren. Die subzelluläre Verteilung dieser Kanäle in Pyramidenneuronen des Hippocampus CA1 wird von Tetratricopeptid repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), eine Hilfsuntereinheit geregelt. Genetische Knockout von HCN porenbildenden Untereinheiten oder TRIP8b, beide führen zu einem Anstieg der Antidepressiva-ähnliche Verhalten, was darauf hindeutet, dass die Funktion der HCN-Kanäle zu begrenzen als Behandlung nützlich sein können für Major Depressive Disorder (MDD). Trotz erheblicher therapeutischen Interesse sind HCN-Kanäle auch im Herz, wo sie Rhythmik regulieren. off-target Probleme mit blockierenden kardialen HCN Kanälen unserem Labor wurde das Targeting Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN und TRIP8b um kürzlich assoziiert zu umgehen vorgeschlagen, um spezifisch HCN Kanalfunktion im Gehirn stören.TRIP8b bindet an HCN Porenuntereinheiten an zwei verschiedene Wechselwirkungsstellen bilden, wobei hier die Konzentration auf die Wechselwirkung zwischen dem tetratricopeptide repeat (TPR) Domänen von TRIP8b und dem C-terminalen Schwanz von HCN1 ist. In diesem Protokoll eine erweiterte Beschreibung eines Verfahrens zur Reinigung von TRIP8b und einen hohen Durchsatz Bildschirm zu identifizieren niedermolekularen Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen HCN und TRIP8b Ausführung beschrieben. Das Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening verwendet eine Fluoreszenzpolarisation (FP) -basierte Assay die Bindung eines großen TRIP8b Fragment mit einem Fluorophor-markierten elf Aminosäuren langes Peptid entsprechend dem C HCN1 terminalen Schwanz zu überwachen. Diese Methode erlaubt "Treffer" Verbindungen in der Polarisation des emittierten Lichts identifiziert basierend auf der Änderung werden. Validierungstests werden dann vorgenommen, um sicherzustellen, dass "Hit" Verbindungen sind nicht artifactual.

Einleitung

Hyperpolarisation-aktivierte zyklische Nukleotid-gesteuerten (HCN) Kanäle werden im Herzen und im zentralen Nervensystem exprimiert , wo sie bei der Regulierung der Membran Erregbarkeit ¹ eine wichtige Rolle spielen. HCN - Kanäle wurden in der Pathogenese von Major Depressive Disorder (MDD) ^2, verwickelt , die mehrere Gruppen geführt hat, vorzuschlagen , dass HCN Kanalfunktion pharmakologisch Begrenzung für MDD ³ als neuartige Behandlung wirksam sein kann. Jedoch ist HCN - Kanäle direkt Targeting nicht lebensfähig aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei der kardialen Aktionspotentials ^4. Ivabradin, die einzige FDA HCN Kanalantagonist genehmigt, ist für die Behandlung von Herzinsuffizienz und ⁵ eine Bradykardie - Effekt zu erzeugen. Als solches besteht ein Bedarf für pharmakologische Mittel, die HCN-Kanal Funktion ausschließlich im Zentralnervensystem zu begrenzen.

Tetratricopeptid wiederholen haltigen Rab8b interacting protein (TRIP8b) ist ein Gehirn spezifischeFic Hilfsuntereinheit von HCN - Kanäle, die die Oberflächenexpression und Lokalisierung von HCN - Kanäle ^6,7 steuert. Genetische Knockout von TRIP8b führt zu einer Verringerung der Gehirn HCN - Kanäle ⁷ ohne ⁸ HCN - Expression im Herzen zu beeinflussen. Interessanterweise verbringen TRIP8b Knockout - Mäuse weniger Zeit unbeweglich auf der Forced Swim Aufgabe und Schwanz Suspension Aufgabe ^7, zwei häufig verwendete Screening - Tests für antidepressive Wirksamkeit ^11.09. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nicht direkt HCN-Kanäle mit einem kleinen Molekül-Antagonisten von HCN Kanalfunktion Targeting, Störung der Wechselwirkung zwischen TRIP8b und HCN kann ausreichend sein, Antidepressiva-ähnliche Verhalten zu erzeugen.

TRIP8b bindet an zwei verschiedene Bindungsstellen zu HCN. Die zyklische Nukleotid - Bindungsdomäne (CNBD) von HCN in Wechselwirkung mit einer konservierten Domäne von TRIP8b befindet sich N - terminal zu den TPR - Domänen von TRIP8b ^12,13. Obwohl die Rückstände des CNBD, die daran beteiligt sind,Interaktion ¹⁴ zugeordnet wurden, die Region TRIP8b, die beteiligt ist hat sich über eine-80-Aminosäurefragment verengt ¹³ nicht. Eine zweite Wechselwirkung tritt zwischen den tetratricopeptide Repeat (TPR) Domänen von TRIP8b und dem C - terminalen Tripeptid von HCN ( 'SNL' in HCN1-, HCN2 und HCN4, aber "ANM" in HCN3) ^3,12. Die vor kurzem gelöst Kristallstruktur ¹⁵ dieser C Schwanz Interaktion ergab erhebliche strukturelle Ähnlichkeit mit der Wechselwirkung zwischen dem peroxisomale Importrezeptor, Peroxin 5 (PEX5) und ihren Partnern interagieren, Typ - 1 - peroxisomale Targeting - Sequenzen (PTS1) ¹⁶ enthält.

Obwohl beide Wechselwirkungsstellen für HCN Kanalfunktion erforderlich sind, dient die Wechselwirkung zwischen den TPR-Domänen von TRIP8b und dem C-terminalen Tripeptid von HCN1 als dominante Bindungsstelle und reguliert HCN Oberflächenexpression. Daher wurde diese Wechselwirkung als Targeting Stelle in diese Studie ausgewählt.Für den Rest des Manuskripts, als ein Hinweis auf die Wechselwirkung zwischen TRIP8b und HCN hergestellt wird, ist es diese Wechselwirkung, auf die verwiesen wird. Diese Interaktion wird durch ein hoch lösliches Fragment von TRIP8b entsprechend seiner konservierten C - Terminus mit den TPR - Domänen für die Bindung des C - terminalen Schwanz von HCN (Reste 241-602 der 1a-4 - Isoformen von TRIP8b) ³ erforderlich rekapituliert.

Um einen hohen Durchsatz Bildschirm zu identifizieren , kleine Moleküle zu stören diese Interaktion fähig zu entwickeln, eine Fluoreszenzpolarisation (FP) -basierte Assay ¹⁷ eingesetzt wurde. Fluoreszenzpolarisation basieren auf der Anregung eines Fluorophors-markierten Liganden mit polarisiertem Licht und Messen der Polarisationsgrad des emittierten Fluoreszenz ^18. In Gegenwart eines Bindungspartners wird die Drehbewegung des fluoreszierenden Liganden beschränkt und polarisiertes Licht ¹⁹ emittiert. In Abwesenheit eines Bindungspartners, ter eine Drehbewegung des Liganden führt zur Emission von depolarisierten Lichts.

In dem beigefügten Protokoll wird ein Verfahren zur Reinigung von N-Terminal-markierten (6xHis) TRIP8b (241-602) unter Verwendung von Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA) -Perlen dargestellt. Ein ähnliches Protokoll wurde verwendet , um die Glutathione-S-Transferase (GST) -markierte C - terminalen 40 Aminosäuren von HCN1 (HCN1 _c40) in Schritt 7 des verwendeten Protokolls zu reinigen. Aus Platzgründen wurde eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens verzichtet.

In den Schritten 2 bis 7 des Protokolls, ein Screening mit hohem Durchsatz Workflow dargestellt (siehe Abbildung 1). Protein-Protein - Wechselwirkungen sind ein notorisch schwieriges Ziel für Hochdurchsatz - Screening und Leser wird empfohlen, auf dem ²⁰ Thema zusätzliche Ressourcen zu suchen.

Die Schritte 2 und 3 des Verfahrens charakterisieren die in - vitro - Affinität des gereinigten TRIP8b (241-602) konstruieren fora Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markierten elf Aminosäuren langes Peptid an das C entsprechenden terminalen Schwanz von HCN1 (HCN1 _FITC). Auf der Basis der Kristallstruktur des TRIP8b-HCN - Komplex ^15, diese elf Aminosäuresegment ist ausreichend mit TRIP8b (241-602) zu erzeugen , zu binden. In Schritt 2 wird die K _d der Wechselwirkung , gemessen durch TRIP8b (241-602) in einer festen Konzentration von HCN1 _FITC titrieren. In Schritt 3 verwendet eine unbeschriftete Version des HCN - Peptid in Schritt 2 in einer festen Konzentration von sowohl TRIP8b (241-602) und HCN1- _FITC titriert , um zu untersuchen , ob die FITC - Tag mit Bindung stört. Diese Versuche sind wesentlich , um die entsprechenden Konzentrationen von TRIP8b Auswählen (241-602) und HCN1 _FITC im Hochdurchsatz - Screening verwendet.

Die Prämisse des Hochdurchsatz - Screening ist , dass ein kleines Molekül, das die Wechselwirkung zwischen TRIP8b stören (241-602) und HCN1- _FITC einen Dezember produzierenrease im polarisierten Licht. In Schritt 4 wird der Z - Faktor des Assays ²¹ für eine gegebene Konzentration von TRIP8b (241-602) und HCN1 _FITC sicherzustellen berechnet , dass der Assay für die Hochdurchsatz - Screening (Schritt 5) geeignet ist. Schritte 6 und 7 Validierungstests zu bestätigen sind , dass die in der primären Hochdurchsatz - Screening identifizierten Hits wirken durch die Wechselwirkung zwischen TRIP8b stören (241-602) und HCN1- _FITC und nicht über einen unspezifischen Mechanismus. In Schritt 6 Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) -markierten HCN1 Peptid (HCN1 _TAMRA) ist in einer ansonsten identischen Fluoreszenzpolarisationsassay verwendet , um fluoreszierende Verbindungen Filter, der die FP - Assay unter Verwendung des FITC - Tag kompromittieren. Schritt 7 verwendet einen größeren HCN1 C terminales Fragment (HCN1 _C40) und verwendet einen bead-based Proximity Assay, der auf der "Tunneling" eines Singulett - Sauerstoff von einem Spender bead auf einen Akzeptor bead nahe Proteine miteinander in Wechselwirkung gebracht basiert ²².

Protokoll

1. Reinigung von TRIP8b (241-602) Protein

1. Verwandeln Sie das Plasmid TRIP8b (241-602) in der bakteriellen Proteinexpressionsvektor pGS21 ³ in kompetente E. enthält coli für die Proteinexpression nach den Anweisungen des Herstellers. Platte 300 ul der Kultur auf Luria Broth (LB) mit 5 ug / ml Chloramphenicol und Ampicillin -Agar. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 16 h.
2. Am nächsten Tag, wählen Sie eine einzelne Kolonie 50 ml LB zu inokulieren mit 50 ug / ml Chloramphenicol und Ampicillin. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C für 16 Stunden (unter Schütteln).
3. 50 ml Kultur zu 1 l LB mit 50 & mgr; g / ml Ampicillin. bei 37 ° C inkubieren unter Schütteln.
4. Sobald die Kultur eine OD ₆₀₀ von 0,8-1,2 Lese erreicht hat, ändern , um die Temperatur des Inkubators auf 18 ° C und IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactosid) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzuzufügen. Lassen Sie die Proteinexpression für 16 Stunden, um fortzufahren.
5. Spin down die E. coli bei 6.000 xg für 15 min bei 4 ° C , um die Bakterien zu pelletieren. Nachdem die Röhrchen aus der Zentrifuge entfernt wird, halten die Bakterien auf Eis für den Rest des Verfahrens. Resuspendieren der Bakterien in 36 ml Puffer A mit 0,25 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF).
6. Beschallen die resuspendierten Bakterien auf Eis einen Flachbolzen für 5-10 min mit, im Wechsel zwischen 30 sec 'auf' und 30 sec 'off' bei hoher Leistung.
7. Zentrifuge bei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Zentrifuge für weitere 15 Minuten, wenn der Überstand noch nicht klar.
8. Wenden Sie den Überstand auf eine Säule mit 2 ml Ni-NTA-Kügelchen. Inkubieren für 60 Minuten bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
9. Lassen Sie das ungebundene Material durch die Säule zu fließen und wäscht mit 500 ml Puffer A
10. Die Säule wird mit 250 ml Puffer B
11. Die Säule wird mit 125 ml Puffer A mit 5 mM Imidazol ergänzt.
12. Eluieren des Proteins herm die Säule mit 20 ml Elutionspuffer.
13. Fügen Sie das eluierte Protein zu einer Dialysekassette (Molekulargewichtsgrenze - 10 kDa) mit einer Spritze. Dialysieren das Protein für 60 min in 4 l kaltem Phosphate Buffered Saline (PBS) bei 4 ° C.
14. Bewegen Sie die Dialysekassette in eine neue 4 L Eimer mit kaltem PBS. Dialysieren Protein für 16 Stunden bei 4 ^o C.
15. Am nächsten Morgen, überprüfen Sie die Proteinkonzentration ein Coomassie-Protein-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Konzentriere das Protein ein Protein-Konzentrator unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers, wenn eine Konzentration von unter 40 & mgr; M beobachtet wird. Aliquot und gefrier bei -80 ° C zur Lagerung.

2. Small Scale Fluoreszenz-Polarisations-Assay die Wechselwirkung der beiden Proteinfragmente zu Charakterisieren

1. Auftauen 200 & mgr; l von 40 & mgr; M TRIP8b (241-602), und fügen Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen. 100 l PBS bis 11 zusätzliche 1,5-ml-Röhrchen.
2. Führen Reihenverdünnungen durch Transferieren 100 ul TRIP8b (241-602) aus dem ursprünglichen Rohr zum nächsten Rohr in der Reihe, Auf- und Abpipettieren und den Prozess zu wiederholen. Dies wird eine 12-Punkte-Serie von 2-fachen Verdünnungen von TRIP8b (241-602) im Bereich von 0,01 bis 40 & mgr; m herzustellen.
3. Bereiten Sie einen 650 & mgr; l Master - Mix von 0,1 uM HCN1- _FITC (6,5 ul einer 10 uM aliquoten) und 2 mM Dithiothreitol (DTT) in PBS.
   Hinweis: Der Master-Mix 2x ist.
4. Richten Sie 12 neue 1,5-ml-Röhrchen. In 50 ul des Master - Mix enthält HCN1- _FITC zu jedem Röhrchen, und fügen Sie dann 50 & mgr; l von jedem der 12 Reihenverdünnungen.
   Anmerkung: Diese Rohre 12 erzeugen wird, die jeweils 0,05 uM HCN1 _FITC und die Hälfte der Konzentration von TRIP8b (241-602) von der Originalreihenverdünnung.
5. Fügen Sie die Verdünnungsreihe zu einer Testplatte, 30 & mgr; l pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung. Verwenden Sie eine niedrige Bindungs ​​feste schwarze 384-Well-Platte.
6. Drehen Sie die Platte foder 2 min bei 900 × g bei RT.
7. Lesen Sie die Platte mit einem Mikroplatten-Reader verwenden, nach den Anweisungen des Herstellers. Messen der Fluoreszenzpolarisation unter Verwendung der folgenden Messgrößen: 485 nm Anregung, 530 nm Emission 505 nm dichroitischen Spiegel, 100 ms Integrationszeit.
8. Zeichnen Sie die Polarisation (mp) Werte im Vergleich zu den TRIP8b (241-602) Konzentration auf einer logarithmischen Skala. Montieren Sie die Daten mit der Hill - Gleichung , die Affinität (K _d) von TRIP8b (241-602) für das markierte HCN1- Peptid zu bestimmen.
   Hinweis: Für die Reihenverdünnungen Vorbereitung, eine Multi-Well-Platte auch anstelle von Rohren verwendet werden kann.

3. Überprüfen Sie die Protein-Protein-Wechselwirkung eine Positivkontrolle verwenden

1. Mit 200 ul unmarkiertem HCN1-Peptid (200 & mgr; M) in ein 1,5 ml Röhrchen. 100 l PBS bis 11 zusätzliche 1,5-ml-Röhrchen. Führen Reihenverdünnungen von 100 & mgr; l aus dem Röhrchen übertragen 200 ul Peptid an der ersten Röhre enthält,von 100 & mgr; l PBS. Wiederholen Sie den Vorgang 12 Röhrchen mit 2-fach-Verdünnungen von unmarkierten HCN1- Peptid zu erzeugen.
2. Bereiten Sie einen 650 & mgr; l Master - Mix von 0,2 uM HCN1- _FITC und 4 uM TRIP8b (241-602).
   Hinweis: Dies ist eine 2x Lösung.
3. In 50 ul Master-Mix auf 12 neue 1,5-ml-Röhrchen.
4. In 50 ul jeder seriellen Verdünnung in ein 1,5-ml-Röhrchen.
5. Laden Sie die schwarzen 384-Well-Mikrotiterplatte in dreifacher Ausfertigung, Zugabe von 30 & mgr; l pro Vertiefung.
6. Zentrifugieren Sie die Platte für 2 Minuten bei 900 × g bei RT.
7. Lesen Sie die Platte mit einem Mikroplattenleser der Lage FP verwenden. Verwenden Sie die gleichen Einstellungen wie in Schritt 2.7 beschrieben.
8. Berechne die Affinität des unmarkierten Peptids für TRIP8b (241-602) unter Verwendung der Cheng-Prusoff - Gleichung: K _d ¹ = IC ₅₀ / (1 + [L] / K _d ^2), wobei K _d ¹ die Affinität des unmarkierten Peptid für TRIP8b (241-602), IC ₅₀ ist in dem vorhergehenden Schritt bestimmtund stellt die Fähigkeit des unmarkierten Liganden den markierten Liganden, [L] die Konzentration des markierten Liganden in Schritt 3.2, und K _d ² ist die Affinität von TRIPb (241-602) für den markierten Liganden zu verdrängen.

4. Bewerten Testleistung (berechnen Z-Faktor)

1. Bereiten Sie einen Master - Mix , indem sie eine 12 - ml - Lösung von FP - Puffer mit 2 uM TRIP8b (241-602), 50 nM HCN1- _FITC und 1 mM DTT in FP - Puffer.
   Hinweis: Diese 60 & mgr; l von 40 & mgr; M TRIP8b erfordern (241-602), 60 ul 10 uM HCN1- _FITC und 1.080 & mgr; l von FP - Puffer.
2. Werden 30 & mgr; l der Mastermischung in jede Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Mikrotiterplatte.
3. 1 ul 1 mM unmarkiertem HCN1- Peptid zu 192 Brunnen als positive Kontrolle zu dienen.
4. 1 & mgr; l von FP-Puffer auf 192 Brunnen als negative Kontrolle dienen.
5. Zentrifugieren Sie die Platte für 2 Minuten bei 900 × g bei RT.
6. Lesen Sie die Platte mit einem microplate Leser.
7. Berechnen Sie den Z - Faktor für den Test mit der folgenden Formel: Z = 1-3 * (σ _pos & sgr; _neg) / (μ _neg -μ _pos) , wo σ _pos und σ _neg sind die Standardabweichungen der positiven und negativen Kontrollvertiefungen und μ _pos und μ _neg repräsentieren die Mittelwertsignale in den positiven und negativen Kontrollvertiefungen.

5. Hochdurchsatz-Screening

1. Auftauen Aliquots von TRIP8b (241-602) und HCN1- _FITC und halten sie auf dem Eis.
2. Bereiten Sie 10 ml TRIP8b (2 uM) und HCN1- _FITC (50 nM) in FP - Puffer.
3. Dispense 25 ul des Gemischs in jede Vertiefung einer geringen Bindung 384-Well-schwarzen Mikrotiterplatte mit einer Pipette.
4. Für Bibliotheks-Screening, fügen Sie Verbindungen in jede Vertiefung der Spalten 3 bis 22 (40 & mgr; M Endkonzentration für jedes) eine akustische Liquid Handler verwenden.
   Hinweis: Aufgrund der relatively niedrige Trefferrate mit diesem Test beobachtet, zwei verschiedene Verbindungen wurden in einem einzigen gut gebündelt. Die beiden Verbindungen von jedem aktiven und wurden anschließend einzeln zu identifizieren getestet, die die Aktivität verliehen.
5. Je 100 nl Dimethylsulfoxid (DMSO) in jede Vertiefung der Spalten 1 und 23 jeder Platte als negative Kontrollen.
6. Hinzufügen unmarkierten HCN1 Peptid in jede Vertiefung der Spalten 2 und 24 jeder Platte als positive Kontrollen.
7. Inkubiere die Platten bei RT für 2 h. Lesen Sie Platten oder bei 4 ° C inkubieren für 16 Stunden vor dem Lesen.
8. Messen der Fluoreszenzpolarisation auf einem Plattenlesegerät. Verwenden Sie die gleichen Einstellungen wie in Schritt 2.7 beschrieben.
9. Berechnen prozentuale Hemmung durch die Signale Normalisierung der durchschnittlichen positiven und negativen Kontrollen von jeder Platte als 100% verwendet wird. Verwenden Sie die Gleichung XN = 100% * ((X _neg - X) / (X _neg - X _pos)) , wobei X _N ist die normierte prozentuale Hemmung auf das Signal X entspricht, X - _Pos Die durchschnittliche Signal von den positiven Kontrollvertiefungen und X _neg ist das Signal von den negativen Kontrollvertiefungen.

6. Bestätigung der Treffer Mit TAMRA-markierten HCN Peptid

1. Validate - Hits mit über 50% ige Hemmung TAMRA-markierten HCN1- Peptid (HCN1- _TAMRA) verwendet wird .
   1. Bereiten Sie einen Master - Mix aus 12 ml 2 uM TRIP8b (241-602) und 50 nM HCN1- _TAMRA in FP - Puffer.
   2. Dispense 25 ul des Master-Mix in jede Vertiefung einer schwarzen 384-well-Mikrotiterplatte.
   3. Übertragen Reihenverdünnungen von jeder aktiven Verbindungen in die entsprechenden Wells. Bilden zwei fachen Verdünnungen, so daß die Konzentration jeder im Bereich von 0,2 uM bis 200 uM getroffen.
   4. Für die negativen Kontrollreaktionen, dann 100 nl von DMSO in jede Vertiefung. Für die Positivkontrolle mit 100 nl von seriell verdünnten unmarkierten HCN1- Peptid mit einer Endkonzentration von 200 uM bis 0,1 uM reichen.
   5. Die Platte bei RT2 Std. Lesen Platten oder Inkubation für 16 h bei 4 ° C vor dem Lesen.
   6. Messen der Fluoreszenzpolarisation (mP) unter Verwendung der folgenden Messgrößen: 535 nm Anregung; 580 nm Emission; 535 nm dichroitischen Spiegel, 20 ms Integrationszeit.
   7. Berechnen IC ₅₀ Werte durch die konzentrationsabhängigen FP Daten jeder Verbindung Armatur ²³ einen Vier-Parameter nicht - lineare Regressionsmodell.

7. Dosis-Wirkungs-Validierung von Bead-basierten Proximity Assay

1. Auftauen 1 aliquote Menge von His-Tag TRIP8b (241-602) (His-TRIP8b) und GST-getaggten HCN1- (GST- HCN1- _C40) Fusionsproteine und halten sie auf dem Eis.
2. Kombinieren Sie His-TRIP8b mit GST-HCN1- _C40 in Testpuffer bei Konzentrationen von 400 nM His-TRIP8b und 40 nM GST HCN1- _C40. Bereiten 300 & mgr; l der Mischung für jede Verbindung getestet werden.
   Hinweis: Die Verbindungen werden in dreifacher Ausfertigung in 11 verschiedenen Konzentrationen plus DM laufenSO Kontrolle (keine Verbindung).
3. Für Kontrollvertiefungen, Herstellung von 30 & mgr; l von His-TRIP8b (200 nM) ohne GST-HCN1C40 und dann separat Herstellung von 30 & mgr; l GST-HCN1C40 (20 nM) ohne His-TRIP8b in Testpuffer.
4. Für jede Verbindung , die getestet werden, fügen 7 ul des His-TRIP8b: GST-HCN1 _C40 - Mischung (hergestellt in Schritt 7.2 oben) auf 36 Kavitäten einer Platte mit einem 16-Kanal - Pipette. Für eine einzelne Verbindung zu testen, ordnen Sie die 12 verschiedenen Konzentrationen in Reihen AL und die drei Replikaten in Spalten 1-3. In 7 ul der His-TRIP8b Lösung (hergestellt in 7.3) zu den Spalten 1-3 der Reihe M und 7 ul GST-HCN1- _C40 - Lösung (hergestellt in 7.3) zu den Spalten 1-3 der Reihe N. Zentrifuge kurz auf die Platte sicherzustellen, dass die Flüssigkeiten am Boden jeder Vertiefung sind und alle Blasen zu entfernen.
5. Dispense die Treffer Verbindungen werden in die Platte getestet, so dass die Konzentration von jedem Treffer im Bereich von 200 & mgr; M (in der Reihe A) bis zu 0,1 & mgr; M (in der Reihe K). Dispense ein Volumen vonDMSO in Reihen LN, die die Menge der Verbindung, die in Reihen AK entfallen einstimmt.
6. Schütteln Sie die Platte für 2 min und Inkubation für 2,5 h bei RT.
7. Verdünnen Sie die anti-GST-Acceptor Perlen 1:50 mit Assay-Puffer.
8. In 3,5 ul der verdünnten Acceptor Perlen in jede Vertiefung der Platte mit einem 16-Kanal-Pipette und mischen durch vorsichtiges Blasen zu vermeiden Pipettieren zu schaffen.
9. Inkubieren der Platte für 1 h bei RT im Dunkeln.
10. Verdünnen Sie die Nickel-Chelat-Donorbeads 1:50 mit Assay-Puffer. Nicht die Mischung auf Licht aussetzen.
11. In 3,5 ul der verdünnten Donorbeads in jede Vertiefung der Platte mit einem 16-Kanal-Pipette und mischen durch vorsichtiges Blasen zu vermeiden Pipettieren zu schaffen.
12. Inkubieren der Platte für 1,5 h bei RT im Dunkeln.
13. Lesen Sie auf einem Plattenleser. Verwenden Sie einen Plattenleser mit folgenden Messparametern: 40 ms Erregungszeit 100 ms Emissionszeit, 0,1 mm Überwachungshöhe.
14. Berechnen IC ₅₀ Werte durch den Einbau von Daten für Bildung und Kulturh Verbindung mit einem Vier-Parameter nicht - linearen Regressionsmodell ^23.

Ergebnisse

Um Copyright - Probleme mit unserer früheren Veröffentlichung, eine TAMRA-markierte Sonde HCN1- _TAMRA wurde vermeiden verwendet , um generieren 2 und 3. Beachten Sie, dass diese Substitution, nicht nennenswerten Unterschied in den Ergebnissen zu machen und die Protokolle sind identisch mit den oben umrissenen mit HCN1 _FITC. Zur Beurteilung der Interaktion mit HCN1 _TAMRA, TRIP8b (241-602) wurde in einer festen Konzentrat...

Diskussion

Wegen ihres Potenzials als ein therapeutisches Ziel in MDD ²⁴ hat es in pharmakologischen Ansätzen beträchtliches Interesse , die HCN - Kanal Funktion im Zentralnervensystem ⁴ antagonisieren. Allerdings haben diese Bemühungen durch die wichtige Rolle der HCN - Kanäle in der Herzschrittmacher und das Risiko einer Arrhythmie ²⁵ installiert. Wir schlussfolgerten , dass die Interaktion zwischen HCN zu stören und sein Gehirn spezifische Hilfsuntereinheit, TRIP8b ^8, ausreichend...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
Dialysis cassette	ThermoFisher	66456
Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502 - 1 gr
384-Well Black plate	Corning	3820
Proxiplate	Perkin-Elmer	6008289
Anti-GST Acceptor beads	Perkin-Elmer	6760603C
NiChelate	Perkin-Elmer	AS101D
pGS21-a	Genscript	SD0121
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Coomassie Kit	ThermoFisher	23200
Protein concentrator	ThermoFisher	88527
Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader	Perkin-Elmer	#2300-001M
BL21 (DE3) Competent Cells	Agilent	200131