תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

Summary

אנו מתארים תפוקה גבוהה, רב מפלסים, ואת הנוזל השדרתי proteomic ממוקד (CSF) assay שפותחה עם פוטנציאל תרגום קליני. הבדיקה יכולה לכמת סמנים פוטנציאל וגורמי סיכון עבור ניווניות של מערכת העצבים, כגון גרסאות E אפוליפופרוטאין (E2, E3 ו E4), ולמדוד ביטוי אללים שלהם.

Abstract

מחלות ניווניות רבות עדיין חסרות טיפולים יעילים. סמנים אמינים זיהוי וסיווג מחלות אלו יהיו חשובים בפיתוח טיפולים חדשניים בעתיד. לעתים קרובות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים לא עושים את זה למרפאה בשל מגבלות בהתפתחותם והוצאות כבדות. עם זאת, פרוטאומיקה ממוקד באמצעות התגובה מרובות ניטור נוזלי כרומטוגרפיה-טנדם / ספקטרומטריית מסה (MRM LC-MS / MS), במיוחד באמצעות ספקטרומטרים המונית quadrupole משולשת, היא אחת השיטות שניתן להשתמש בהם כדי להעריך במהירות ולאמת ביומרקרים לתרגום קליניים לתוך מעבדות אבחון . באופן מסורתי, פלטפורמה זו נעשה שימוש נרחב עבור המדידה של מולקולות קטנות במעבדות קליניות, אבל זה פוטנציאל לנתח חלבונים, זה עושה את זה חלופה אטרקטיבית כדי ELISA (Enzyme-linked Immunosorהכפוף Assay) מבוסס שיטות. אנו מתארים כאן איך ממוקדות פרוטאומיקה ניתן להשתמש כדי למדוד סמנים מרובב של דמנציה, כולל איתור quantitation של גורם סיכון ידוע אפוליפופרוטאין E איזופורם 4 (ApoE4).

על מנת להפוך את assay מתאים תרגום, הוא נועד להיות מהיר, פשוט, מאוד ספציפי וחסכוני. כדי להשיג זאת, כל שלב בהתפתחות של assay חייב להיות מותאם עבור חלבונים בודדים ורקמות הם מנותחים. שיטה זו מתארת ​​תהליך עבודה טיפוסי כולל טיפים שונים וטריקים כדי לפתח MRM פרוטאומיקה ממוקד LC-MS / MS לתרגום .

פיתוח שיטה מותאמת באמצעות גרסאות מסונתז מנהג פפטידים quantotypic tryptic, אשר לכייל את MS לגילוי ואז זינק לתוך CSF כדי לקבוע זיהוי נכון של הפפטיד האנדוגניים ההפרדה chromatographic לפני ניתוח של MS. כדי להשיג absoluquantitation te, שכותרתו איזוטופ יציב גרסאות תקן פנימי של פפטידים עם תגי רצף החומצות האמיניות קצר המכיל אתר מחשוף טריפסין, כלולים ב- assay.

Introduction

את ההשפעה ההולכת וגוברת של מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, דמנציה Lewy גוף ומחלת פרקינסון, הוא הופך לנושא החברתי-כלכלי במדינות רבות ^1. יש צורך ב ביומרקרים נוספים שניתן להשתמש בהם כדי לזהות ולסווג לחולים בשלבים המוקדמים של המחלה, וכדי לפקח על כל טיפולים חדשים פוטנציאליים. המטרה הכללית של שיטה זו היא ליצור צבר המוצרים הגנריים דרך יעילה, כלכלית מהירה יותר של אימות סמנים CSF פוטנציאל מוחיים. הרציונל הוא להשתמש פרוטאומיקה ממוקד או הפפטיד MRM LC-MS / MS כשיטת amendable בקלות להעריך סמנים ביולוגיים חלבון פוטנציאל מרובים מניסויים גילוי. אלה יכולים להיות מרובבים נוספים על פירוד chromatographic מהיר (<10 דקות) והערכתי. בתוך מסך זמני זו עבור סמנים ביולוגיים ניווניות, כללנו את איזופורם אפוליפופרוטאין גורם סיכון לדמנציה הידוע E4 (ApoE4) כך אנו CAn לקבוע את מעמדה זמנית ורמת הביטוי, על ידי זה ביטול הצורך בדיקות גנוטיפ נפרד ^2. LC MS / MS משמש באופן שגרתי כמו שיטת הבחירה של quantitating מולקולות קטנות במדויק על פני שיטות אחרות כגון ELISA או radioimmunoassay (RIA). שינוי זה השימוש בטכנולוגית MS לחלבונים לניתוח, כבר מונע בעיקר על ידי בעיות עם הטכנולוגיות מבוססות החיסוניות. אלה כוללים צולבות סגוליות, תצווה כדי וריאציה יצווה, חיי מדף מוגבלים, ועלות גבוהה. לכן, פרוטאומיקה ממוקד הופך במהירות אלטרנטיבה גוברת שיטות המבוססות נוגדנים כגון סופג, RIA ו ELISA המערבי. עם זאת, היכולת לבצע ריבוב סמנים רבים לתוך assay אחד הוא היתרון העיקרי של שיטה זו על פני שיטות מבוססות חיסוניות ^3. הטכניקה ישימה ברקמות רבות ויש בו נעשה שימוש כאסטרטגיה אימות ללימודי פרוטאומיקה רבים, כולל פלזמה ⁴ ושתן ^5,6.

טהchnique יכול להיות מיושם על כל מעבדה שיש לו גישה ומומחיות באמצעות ספקטרומטרים מונית quadrupole משולשות. עיצוב פפטיד הוא פשוט יחסית עם השימוש ההולך והגדל של מסדי נתוני קוד פתוחים. בשוק התחרותי של סינתזת פפטידים המותאם אישית עושה אותם הרבה יותר זול. פפטידים כבדים, עם זאת, הם יקרים ולכן הסמנים יש לבחון במדגם קטן לפני שעברתי בקנה מידה גדול יותר. קיים פוטנציאל הולך וגדל על הטכניקה כדי לשמש בהגדרות האבחון הקליניות, עם רוב בתי חולים הגדולים שיש פלטפורמות מבוססות quadrupole משולשות אשר ניתן להתאים בקלות להפעיל מבחני proteomic ממוקדים. אחד צרכימים האלה של השיטה, מה שהופך אותו לתוך הגדרת האבחון השגרתית, הוא היישום האחרון שלה כדי הקרנה כתם דם יילוד עבור חרמשי אנמיה ^7.

Protocol

הערה:. סכמטי של הפרוטוקול הכולל המתואר כאן ניתן בתרשים 1 כל דגימות המשמשות לפיתוח של שיטה זו הן עודפות דגימות אבחון קליניות ויש אישור אתי מועדת אתיקת לונדון בלומסברי.

באיור 1. סכמטי המדגים את התהליך הכולל של יצירת LC-MS MRM CSF ממוקד / MS Assay. פפטידים סמן מועמד להערכה נבחרו מתוך מטרות חלבון. באמצעות שימוש פפטידים מסונתזים מותאם אישית, שיטה זמנית ממוקדת LC-MS / MS נוצרה. לאחר הערכה, assay יכול לשמש כדי להעריך את היעילות של סמנים פוטנציאל מוחיים.

1. בחירת פפטיד ועיצוב

הערה: קריטריוני פפטיד סמן הוא שזה חייב להיות ייחודי (proteotypic ) וייצוג שפע כמותית של החלבון (quantotypic). כדי לקבוע אם פפטיד הוא ייחודי או לא, בכלי החיפוש 'הפיצוץ' באתר Uniprot (http://www.uniprot.org/blast/) יכול לשמש.

1. גדר רשימה של חלבוני יעד (סמנים), כלומר, ApoE (ראה טבלה 2).
   הערה: אם את הסמן זוהה מניסויי פרופיל proteomic הקודמים ^8, ולאחר מכן בחר את הפפטיד שנותן את המענה הטוב ביותר מזה סט נתונים.
2. אם מידע זה אינו זמין, השתמש אתרי קוד פתוח, כגון לעיכול טריפסין סיליקון של חלבונים היעד, באמצעות כלי תוכנה כגון MS-Digest.
3. בחר את הפפטיד שהוא tryptic ולא רגיש לפרסם שינויי translational.
   הערה: מידע זה ניתן לבדוק באתר Uniprot www.uniprot.org. הימנע פפטידים נוטים שינוי כימי במהלך הכנת מדגם LC-MS.
4. להורות על הסינתזה האישית של פפטידים הנבחרים.
   הערה: פפטידים מרקר יכול להיות מסונתז מותאם אישית על ידי חברות מסחריות שונות. לקבלת ApoE הפפטיד quantotypic המשמש למדידת רמות הכוללות ApoE היה נחוש בדעתו להיות AATVGSLAGQPLQER. רצפים פפטיד proteotypic המשמשים לקביעת גרסאות E2 ו- E4 הם פפטידים tryptic לתפקיד 158 (RLAVYQAGAR ו CLAVYQAGAR) ומצבה 112 (LGADMEDVCGR ו LGADMEDVR), בהתאמה.

2. הכנת פפטידים רגיל

הערה: כדי לבחור את מעברי כמותיים הטובים ביותר, זיהוי של מטריקס (CSF) צריך להיות מותאמת. הדרך היעילה ביותר של אופטימיזציה פפטידים מרובב היא ליצור ברכות של פפטידים בריכוזים ידועים. בריכות אלה לאחר מכן ניתן להשתמש עבור פיתוח שיטת עקומות סטנדרטיות.

1. Resuspend פפטידים סינתטיים (פרטים פפטיד ניתנות בטבלה 2) עד 1 מ"ג / מ"ל המניותריכוז על פי הוראות מייצרות. כברירת מחדל, אם ההוראות אינן זמינות, פפטידים resuspend ב 50:50 (v / v) אצטוניטריל (ACN) / H ₂ O.
2. הכן את דילולי 1:10 של הפפטיד מריכוז מניות pmol ברכת 1,000 של כל פפטיד לתוך צינור microcentrifuge מחייב נמוך. יבש מטה concentrator המהירה-VAC לברכת החנות האחרונות ב -20 ° C. הכן כמה בריכות לשימוש עתידי.
3. Aliquot 100 μl של CSF לתוך צינורות מחייב נמוכים. Freeze-לייבש את CSF.
4. Resuspend aliquot של פפטידים 1,000 pmol נקווה חיץ העיכול (100 מ"מ טריס HCl, pH 7.8, 6 M אוריאה, 2 M Thiourea, 2% ASB14) להשיג ריכוזים של 10 ו 1 pmol / μl.
5. ספייק פפטידים ונקווה לתוך aliquots μl 100 מיובש בהקפאה של CSF ב 0, 1, 2, 5, 10 ו -15 ריכוזי PM. הוסף 20 ng של חלבון שלם שאינם קשורים כגון אנולאז שמרים לפעול כתקן ובקרה פנימיים עבור יעילות העיכול של TRypsin.
6. הדף את aliquots CSF עם לעכל חיץ לסכום סופי של 20 μl. מְעַרבּוֹלֶת.
7. הוסף 1.5 μl של dithiothreitol (30 מ"ג 1 מ"ל של 100 מ"מ טריס HCl, pH 7.8) ולנער בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
8. הוסף 3 μl של iodoacetamide (35 מ"ג 1 מ"ל של 100 מ"מ טריס HCl, pH 7.8) ולנער בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות בחושך.
9. להוסיף 165 μl של DDH ₂ O.
10. הוסף 10 μl של 0.1 מיקרוגרם / μl פתרון טריפסין רצף שונה כיתה resuspended ב 50 חיץ ביקרבונט מ"מ אמוניום, pH 7.8. דגירה באמבט מים ב 37 ° CO / N ולעצור את מערכת העיכול על ידי הקפאת דגימות. חנות מעכלת ב -20 ° C עד מוכן לנתח.

אופטימיזציה 3. איתור פפטיד MS

1. העתק והדבק את הרצף הפפטיד להיות מותאם, לתוך תוכנה מתאימה, למשל, קו רקיע ^9. הקישו על רצף הפפטיד כדי להשיג את המידעשל יוני מסת מוצר מבשר יון צפוי.
2. לדלל את פפטידים מריכוז המניה (ראה סעיף 2.1) נוספת ל -1 ng / ml ריכוז לפיתוח שיטה MS.
3. ישירות להשרות את הפפטידים ספקטרומטר מסה בקצב הזרימה אופטימיזציה (בדרך כלל 0.1 - 0.8 מ"ל / דקה) ועם 5 - 0% אנרגיה התנגשות.
4. רוכש ספקטרום MS כדי לזהות את היונים המבשרים ניסיוני להכפיל טעונת ^8. בחר יון מבשר (m / z) שנותן את עוצמת ביותר (doubly- או יונים מבשר טעונה ובשילוש מומלץ).
5. Reinfuse הפפטיד ולהחיל אנרגית התנגשות לפצל הפפטיד ידי התנגשות מושרת-דיסוציאציה (CID). מטב את האנרגיות חרוטות התנגשות להשיג דפוס הפיצול הטוב ביותר (היונים שברי ביחידים או כפליים טעונים, והמסה של יון שבר רצוי יותר גדול יון הורה, מומלצים).
6. ודא כי המעברים שהושגו בניסוי התאמת מעברים שנוצרו סיליקון </ Em> (כמתואר בשלב 3.1). שמור את רשימת המעבר בקובץ שיטת MRM באמצעות 2 לפחות מעברים האינטנסיביים ביותר לכל יון מבשר. כלול 2 מעברים: 1 כדי לכמת ו -1 אישור assay הסופי.
   הערה: חלק מיצרני MS יש פונקציה (כלומר, ווטרס Intellistart) עבור MRM אוטומטית או ניתוח SRM אופטימיזציה. אם אפשר להחדיר פפטידים עם שלבים ניידים משולבים ב 50 - 70% ACN עם 0.1% FA.

4. פיתוח שיטות LC-MRM

הערה: לנתח את התערובת של פפטידים סינתטיים ידי ביצועי Ultra נוזלי כרומטוגרפיה (UPLC) מערכת מצמידים את ספקטרומטר מסה quadrupole משולשת. ודא המקור הוא נקי. ממס הוא DDH ₂ 0 עם 0.1% FA; B הממס הוא ACN עם 0.1% FA.

1. השתמש במערכת LC-MS מצוידת טור UPLC עמוס שלב C-18 (1.6 מיקרומטר קוטר, 90 נקבוביים A, 2.1 מ"מ x 50 מ"מ אורך) ומצורף טור-מראש של אותו השלב.
2. הפשרה מעכל CSF על הקרח, צנטריפוגות ב 16,000 גרם במשך 10 דקות והעברת 60 μl לתוך צלוחיות הכנס זכוכית 300 μl ולאחסן את המשענת ב -20 ^o C.
3. להזריק את הריכוז הגבוה ביותר מנקודה עקומת סטנדרט באמצעות 10 דקות 1 - 40% שיפוע ליניארית ACN (ראה לוח 1 עבור הגדרות שיפוע)
4. פתח את זמן הכרומתוגרמה ושימור הפתק שהתקבל העליון שני מעברים האינטנסיביים ביותר (כמוני) לכל פפטיד עם כל המעברים שנוצרו בשלב 3.
5. בהתבסס על מידע זה, לעדכן שיטת MRM 10 דקות (שנוצרה בשלב 3.6) עם ערוצי מתוזמן למדוד פפטידים (ראה איור 2 למשל). כדי לשמור על רגישות, לשמור כל ערוץ עם נק 'שיא גדול מ -8 וישב זמן רב יותר מאשר 0.01 שניות לפחות מעבר אחד לכל פפטיד.
6. כלול "עיכובים ממסים 'בשיטת MRM: אחת בתחילה עד 10 שניות לפני elution השיא הראשוןעוד בסוף השיטה, 20 שניות לאחר elution השיא האחרון. עושה זאת על ידי בחירה "עיכובים ממסים" באירועי שיטה בקובץ שיטת MS.
7. הפעל את עקומת סטנדרט באמצעות שיטת MRM מתוזמן ולהבטיח אין פסגות ספציפי מפריעה מעברים (שנוצר בשלב 3.6) על ידי בדיקת ליניאריות.
8. לקבוע אם פפטידים ניתנים לזיהוי על ידי הפעלת שליטה תקווה הלא ממוסמרת ומחלות CSF דרך השיטה.
9. הסר את פפטידים כי הם מתחת לגבול של זיהוי מן assay.

איור 2. דוגמא של שיטת MS Dynamic MRM. מתוזמן ערוצי מעברי פפטיד ניתן לקבץ לפי זמני שמירה הוקמו. הפעלת MRMs להשתלב באופן מתוזמן כמו פפטידים סמן שנבחרו elute מהעמודה כרומטוגרפיה, מצמצם את מספר transitions לאורך תקופת זמן ומגביר את הרגישות של assay. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תוספת 5. תקנים פנימיים

הערה: כפי שתואר קודם לכן ^10, שכותרתו איזוטופ יציב סטנדרטים פנימיים יכולים להיכלל assay. בשל חשבון תקנים אלו, מומלץ תחילה להעריך את פפטידים במטריצה.

1. קבע את פפטידים האידיאלי מותאם לגילוי ב CSF: לבחור פפטידים שהן חוזרות ביותר, עם עוצמת המרבה במחיר וללא פסגות הפרעה.
2. עיצוב המתאים פפטידים לכלול כבד ¹³ C ¹⁵ N תוויות חומצת אמינו להגדיל את המסה של פפטיד על ידי לפחות ביחס Da 6 עד פפטיד אנדוגני. כמו כן, הוסף תג של 4 - 6 חומצות אמינו נוספות גם את N- או C- סופי של העידוד הכבדהגאות לשלוט לעיכול tryptic.
3. לדלל סטנדרטים פנימיים שכותרתו איזוטופ יציב חיץ העיכול (ראה שלב 2.4). לקבוע את כמות אידיאלית של תקן פנימי שכותרתו איזוטופ יציב אשר יהיה ממוסמר ב CSF ידי spiking ברמות שונות בהתאם abundancies שנצפה קודם לכן במהלך הפיתוח. שואפים להשיג כ 1: 1 יחס לסטנדרטים שכותרתו איזוטופ יציב פפטיד אנדוגני.
   הערה: סטנדרטים פנימיים יציבים שכותרתו איזוטופ יכולים להיות מסונתזים על ידי חברות מסחריות שונות.

6. LC-MRM Assay של דגימות החולה CSF

1. ספייק אופטימיזציה כמות סטנדרטים שכותרתו איזוטופ יציב לתוך 100 μl של CSF ולהקפיא-לייבש את התערובת.
2. Resuspend את CSF ב 20 μl של חיץ לעכל ולבצע לעיכול כמתואר נקודות 2.7 - 2.10.
3. ניתוח הדגימות בשיטת LC-MRM שפותחה בשלב 4.
4. לניתוח כמותי, הפעל את עידוד תקןגאות בריכוזים של 0 -15 pmol ב עקום סטנדרט. ראה שלב 2.5 לעריכת עקומת סטנדרט.

ניתוח 7. נתונים

הערה: נתונים כמותי מבוסס על יחס עוצמת הסטנדרטים פנימיים שיא בסיס (פפטידים שכותרתו כבדה). מידע מפורט על ניתוח נתוני SRM / MRM תואר בעבר ^10. נתונים יחס לאחר מכן ניתן להשתמש ב עקום סטנדרט לקבוע רמות מוחלטות או לחשב אותם מהריכוז המוסף של פפטיד כבד שכותרתו.

1. ניתוח נתוני LC-MRM באמצעות התוכנה הסטנדרטית היצרנים ספקטרומטרים ההמוני ^10. לחלופין, להשתמש Skyline תוכנה לניתוח נתונים MRM כמותי ^10.
2. בדוק את הרגישות של הריצה על ידי בדיקת תגובת תקן פנימי כגון אנולאז שמרים ממוסמר או תקן שכותרתו איזוטופ יציב בכל ריצה. ודא כי המקדם השונה (CV) אינו גדול מ25%.
3. סקור ידני את ביאור הנתונים כדי להבטיח דיוק. לנתח כל פפטיד ויחס כדי תקן פנימי שכותרתו איזוטופ יציב המתאים, כלומר, להשתמש בגירסה שכותרתו איזוטופ יציב של הפפטיד אם זמין.
4. כדי להשיג ערכים מוחלטים של pmol ל -100 μl של CSF, הפעל את נתוני יחס באמצעות עקומות סטנדרטיות המתאימות כי נוהלו בעת ובעונה אחת.
5. חשבתי את המקדם השונה (CV). קורות חיים לכל פפטיד צריך להיות מתחת ל -25% ומטה 15% עבור פפטידים גבוה בשפע.
   הערה: pmol בערך מוחלט ל -100 ערכים CSF μl יכול להשתמש בניתוח סטטיסטי במורד שלאחר מכן.

מצב 8. אפוליפופרוטאין E איזופורם

הערה: כדי לקבוע את מעמדם איזופורם ApoE, בנוכחות פפטידים המתאימים יכולה להתבצע על ידי קביעת הנוכחות של כל איזופורם.

1. קחו למשל את ApoE ב 100 μl של סף CSF של> 1,000 אות-כדי לרעש כחיובי עבור פפטיד זה. ראה איור 5 עבור פפטידים נדרש / נעדרים לקבוע מעמד איזופורם של המטופל. קבע את הביטוי אללים ידי חישוב% של כל איזופורם להסתכם ביטוי ApoE.

תוצאות

באמצעות השיטה המתוארת לעיל, assay זמנית גבוהה תפוקה 10 דקות המורכב 74 פפטידים מ -54 חלבונים פותחה, כמו assay עבור סמנים של הפרעות ניווניות מחלת אלצהיימר ו Lewy גוף דמנציה (LBD) ^8. איור 3 מראה הכרומתוגרמה זמנית שפורסם בעבר ⁸ של הסמנים פפטיד המשמ...

Discussion

כמו בכל המבחנים המבוססים MS, השלבים הקריטיים בשיטה הם קביעת הסכומים המתאימים ומדויקים של סטנדרטים פנימיים. אם quantitation המוחלט נמצא בשימוש, אז את הכמויות הנכונות של פפטידים ממוסמרים בעקום התקן הם גם קריטיות.

assay שלנו אינו מחייב את המ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Fisher	A955-1
Formic acid, LC-MS grade,	Fisher	A117-50
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
Hydrochloric acid, 37% w/w	VWR	BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide	Sigma	I1149-5G
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500
Trypsin, sequencing grade, modified	Promega	V5113
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Fisher	A116-50
Urea	Sigma	U0631-500g
Water, LC-MS ULTRA Chromasolv	Fluka	14263
Custom synthesised peptides desalted 1-4mg	Genscript	custom
heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides	Genscript	custom
ASB 14	Merck Millipore	182750-25gm
Thiourea	Sigma	T7875-500G
Tris base	Sigma	T6066
VanGuard precolumn	Waters	186007125
Cortecs UPLC C18+ 1.6um  2.1 x50mm column	Waters	186007114
Yeast Enolase	Sigma	E6126
300ul clear screw top glass vials	Fisher scientific	03-FISV
Y slit screw caps	Fisher scientific	9SCK-(B)-ST1X
Freeze dryer	Edwards Mudulyo	Mudulyo system
Concentrator/Speed vaccum	Eppendof	concentrator  plus 5301
Xevo -TQ-S mass spectrometer	Waters
Acquity UPLC system	Waters