Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Özet

Biz klinik çeviri potansiyeli ile geliştirilen yüksek verim, multipleks ve hedeflenen proteomik beyin omurilik sıvısı (BOS) testi açıklar. Test böyle Apolipoprotein E varyantları (E2, E3 ve E4) olarak nörodejenerasyonun potansiyel belirteçleri ve risk faktörlerini, ölçmek ve onların allelik ifadesini ölçebilirsiniz.

Özet

Birçok nörodejeneratif hastalıklar hala etkili tedaviler eksiktir. belirlenmesi ve bu hastalıkların sınıflandırılması için güvenilir biyobelirteçler gelecek yeni tedavilerin geliştirilmesinde önemli olacaktır. Genellikle potansiyel yeni belirteç nedeniyle gelişim ve yüksek maliyetlerle kısıtlamalar kliniğe yapmazlar. Ancak, Sıvı Kromatografi-tandem İzleme Çoklu Reaksiyon kullanılarak hedeflenen proteomik / Kütle Spektrometre özellikle üçlü dört kutuplu kütle spektrometre kullanılarak (MRM LC-MS / MS), hızla teşhis laboratuvarları içine klinik çeviri için biyobelirteçleri değerlendirmek ve doğrulamak için kullanılabilecek bir yöntemdir . Geleneksel olarak, bu platform, klinik laboratuarlarda küçük moleküllerin ölçümü için yaygın olarak kullanılmıştır, ama o ELISA (enzim bağlantılı Immunosor için cazip bir alternatif yapar, proteinleri analiz etmek için potansiyelbent Deneyi) yöntemlerini tabanlı. Biz, burada E izoformu 4 (ApoE4) apolipoprotein bilinen bir risk faktörü saptanması ve nicelenmesi bunama birden fazla mesaj gösterge, ölçmek için nasıl kullanılabileceğini hedefli proteomik burada açıklanmaktadır.

Çeviri için deney uygun bir hale getirmek için, hızlı, basit, son derece spesifik olabilir ve maliyet etkin şekilde tasarlanmıştır. Bunu başarmak için, tahlilin geliştirilmesi her aşaması, analiz tek tek proteinler ve dokular için optimize edilmelidir. Bu yöntem, çeviri için hedeflenen bir proteomik MRM LC-MS / MS geliştirmek için çeşitli ipuçları ve da dahil olmak üzere, tipik bir iş akışı tarif .

yöntem geliştirme tespiti için MS kalibre triptik quantotypic peptidler, özel olarak sentezlenmiş sürümleri kullanılarak optimize edilmiş ve daha sonra önceki MS analizi kromatografik ayırma endojen peptid doğru tanımlanmasını belirlemek için BOS içine çivili. Absolu elde etmek içinte niceleme, kısa amino asit sekansı etiketler ve tripsin klivaj sahası içeren peptidlerin izotop etiketli dahili standart sürümleri, deneyde yer almaktadır.

Giriş

Alzheimer hastalığı, Lewy Body Demansı ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların artan etkisi pek çok ülkede ¹ bir sosyoekonomik konusu haline gelmektedir. belirlemek ve hastalığın erken aşamalarında hastaları sınıflandırmak ve herhangi bir potansiyel yeni tedavi izlemek için kullanılabilecek ek biyolojik bir ihtiyaç vardır. Bu yöntemin genel amacı, nörodejenerasyon potansiyel BOS belirteçleri doğrulamak bir aerodinamik ekonomik ve daha hızlı bir şekilde için genel bir boru hattı oluşturmaktır. gerekçesi bulma deneyler birden fazla potansiyel protein biyolojik değerlendirmek için kolay amendable yöntem olarak hedeflenen proteomik veya peptit MRM LC-MS / MS kullanmaktır. Bunlar daha hızlı bir kromatografik ayırma (<10 dakika) ve değerlendirilen üzerinde multiplekslenebilmektedir. nörodejeneratif biyomarkerların için bu multipleks ekran içinde, biz bilinen demans risk faktörü apolipoprotein izoformunu E4 (APOE4) dahil ettik bu yüzden can bu ayrı genotipleme testleri ² ihtiyacını ortadan kaldırarak aynı anda durumunu ve ifade seviyesini belirlemek. LC MS / MS rutin doğru örneğin ELISA veya radyoimünoanaliz (RIA) gibi diğer yöntemlere göre küçük molekülleri ölçülmesi için tercih edilen bir yöntem olarak kullanılmaktadır. analiz proteinlere MS teknolojisinin kullanımı bu değişim, bağışıklık tabanlı teknolojiler ile ilgili sorunlar ağırlıklı olarak tahrik edilmiştir. Bu çapraz-özgüllük, toplu toplu varyasyonuna, sınırlı raf ömrü ve yüksek maliyeti dahil. Bu nedenle, hedeflenen proteomik hızla böyle Western blot, RIA ve ELISA antikor bazlı yöntemlere büyüyen bir alternatif haline geliyor. Bununla birlikte, tek bir tahlil çok işaret multipleks yeteneği bağışıklık esaslı yöntemler üzerinde ³ bu tekniğin önemli bir avantajdır. Tekniğin birçok dokuda uygulanabilir ve plazma ⁴ idrar ^5,6 dahil olmak üzere birçok proteomik çalışmalar için bir onaylama stratejisi olarak kullanılmıştır.

technique üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi kullanarak erişim ve uzmanlığa sahip bir laboratuvara uygulanabilir. Peptit tasarımı açık kaynak veritabanlarının artan kullanımı ile oldukça basittir. özel peptidler sentez rekabetçi piyasa onlara çok daha uygun hale getirir. Ağır peptidler, Bununla birlikte, pahalı olan ve bu nedenle belirteçler daha büyük bir ölçekte geçmeden önce küçük bir grup ile değerlendirilmelidir. teknik en büyük hastaneler kolayca hedeflenen proteomik deneyleri çalıştırmak için adapte edilebilir üçlü dört tabanlı platformlar sahip, klinik tanı ortamlarda kullanılmak üzere artan potansiyeli bulunmaktadır. Yöntemin Böyle bir uygulama, rutin tanı ayar içine yapım, orak hücreli anemi ⁷ yenidoğan kan nokta tarama son zamanlarda bir uygulamadır.

Protokol

NOT:. Burada açıklanan genel protokol şematik Fi gure 1'de verilen bu yöntemin geliştirilmesi için kullanılan tüm örnekler fazlasının klinik tanı örnekleri ve Londra Bloomsbury Etik komitesi etik onayı var.

Değerlendirilmesi için hedeflenen CSF MRM LC-MS / MS Deneyi. Aday markör peptidlerin oluşturulması genel bir işlemi gösteren Şekil 1 şematik protein hedefleri seçilir. Özel olarak sentezlenmiş peptitlerin kullanımı sayesinde, bir hedef LC-MS / MS çoklu yöntemi oluşturulur. değerlendirildikten sonra deney nörodejenerasyonun potansiyel belirteçleri etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir.

1. Peptid seçimi ve tasarımı

NOT: Bir işaretleyici peptid Kriterleri benzersiz olmasıdır (Proteotypic ) ve protein (quantotypic) kantitatif bolluğu temsil eder. bir peptid, Unıprot web sitesinde 'patlama' arama aracı benzersiz olup olmadığını belirlemek için (http://www.uniprot.org/blast/) kullanılabilir.

1. Yani hedef proteinlerin (markörler), bir liste tanımlama ApoE (bakınız Tablo 2).
   NOT: işaretleyici önceki proteomik profilleme deneyler ^8'den tespit edilmişse, o veri kümesinden en iyi yanıtı veren peptit seçin.
2. Bu bilgiler mevcut değilse, MS-Digest gibi bir yazılım aracı kullanarak, hedef proteinlerin siliko tripsin sindirim gibi açık kaynak web siteleri, kullanın.
3. Triptik ve çevrim sonrası değişim duyarlı değildir peptit seçin.
   NOT: Bu bilgiler Unıprot web sitesinde www.uniprot.org kontrol edilebilir. LC-MS numune hazırlama esnasında kimyasal modifikasyona eğilimli peptidler kaçının.
4. seçilen peptidler özel sentezi sipariş edin.
   NOT: Marker peptidler özel çeşitli ticari şirketler tarafından sentezlenebilir. ApoE için toplam ApoE seviyelerini ölçmek için kullanılan quantotypic peptid AATVGSLAGQPLQER olduğu belirlenmiştir. E2 ve E4 varyantları belirlemek için kullanılan Proteotypic peptid dizileri, sırasıyla, pozisyon 158 (RLAVYQAGAR ve CLAVYQAGAR) ve konum 112 (LGADMEDVCGR ve LGADMEDVR) için triptik peptidler bulunmaktadır.

Standart Peptidlerin 2. Hazırlık

Not: Tüm sayısal geçişleri seçmek için, matris (CSF) tespiti optimize edilmesi gerekmektedir. çoklanmış peptidler optimize en etkili yolu bilinen konsantrasyonlarda peptitlerin havuzları oluşturmaktır. Bu havuzlar, akabinde yöntem geliştirme ve standart eğriler için kullanılabilir.

1. 1 mg / ml stok (peptit detayları Tablo 2 'de verilmektedir) sentetik peptitler yeniden süspanseuygun konsantrasyonu kullanılarak ve üretici talimatları. Varsayılan olarak, talimatlar mevcut değilse, 50:50 (v / v) asetonitril (ACN) tekrar süspansiyon peptitler / H ₂ O
2. Düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüp içine stok konsantrasyonu ve her peptid havuz 1,000 pmol gelen peptid 01:10 dilüsyonları hazırlayın. Hızlı vac konsantratör içinde -20 ° C'de son havuz ve mağaza kurulayın. ileride kullanmak üzere birkaç havuzları hazırlayın.
3. Kısım düşük bağlayıcı tüpler içine BOS 100 ul. Freeze-kurumaya CSF.
4. 10 ve 1 pmol / ul konsantrasyonlarında elde edilmesi için sindirim tamponu (100 mM Tris HCI, pH 7.8, 6 M üre, 2 M tioüre,% 2 ASB14) havuzlandı 1000 pmol peptidlerin bir kısım yeniden süspanse edin.
5. 0, 1, 2, 5, 10 ve 15 uM konsantrasyonlarında CSF dondurularak kurutulmuş 100 ul alikotlara toplanmış peptidler başak. Bu tr sindirim verimliliği için dahili bir standart ve kontrol olarak hareket etmek için maya enolaz sağlam olmayan protein 20 ng eklemeypsin.
6. 20 ul son miktarda tampon sindirmek ile BOS alikotları kontör. Vortex.
7. ditiyotreitol, 1.5 ul (100 mM Tris HCI, pH 7.8, 1 ml, 30 mg) ilave edilir ve 1 saat süre ile oda sıcaklığında çalkalanır.
8. iyodoasetamit 3 ul (100 mM Tris HCI, pH 7.8, 1 ml, 35 mg) ilave edilir ve karanlıkta 45 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalanır.
9. GKD ₂ O. 165 ul ekleyin
10. 0.1 ug 10 ul ekle / 50 mM amonyum bikarbonat tampon maddesi, pH 7.8 içinde yeniden süspansiyon haline dizileme gradlı modifiye tripsin çözeltisi ul. 37 ° CO / N bir su banyosunda inkübe ve örnekleri dondurarak sindirim durdurun. analiz için hazır olana kadar -20 ° C'de muhafaza de sindirir.

MS Peptit Tespit 3. Optimizasyonu

1. Uygun bir yazılım, örneğin Skyline ⁹ içine kopyalayın ve diziye optimize edilmesi yapıştırın. bilgi almak için peptid sekansı tıklayınbeklenen ön-madde iyon kütle ve ürün iyonları.
2. stok konsantrasyonu peptidler sulandırmak 1 ng / MS yöntemi geliştirilmesi için ml konsantrasyonundan daha (bölüm 2.1).
3. Doğrudan optimum akış oranında kütle spektrometresinde peptidler demlenmeye (genellikle 0,1-0,8 ml / dakika), 0 ile 5 -% çarpışma enerjisi.
4. Deneysel çok yüklü haberci iyonları ⁸ belirlemek amacıyla MS spektrum kazanır. En yoğunluğunu (doubly- veya triply şarjlı habercisi iyonları tavsiye edilir) verir habercisi iyon (m / z) seçin.
5. peptid Reinfuse ve çarpışma kaynaklı-ayrışma (CID) tarafından peptit parçalara çarpma enerjisini uygulayın. En iyi parçalanma desen elde etmek için koni ve çarpışma enerjileri Optimize (ana iyon daha tercihen büyük fragman iyonu tek veya iki şarj fragman iyonları ve kitle tavsiye edilir).
6. Deneysel olarak elde edilen geçişler siliko oluşturulan geçişler eşleştiğini doğrulayın </ Em> (adım 3.1 de tarif edildiği gibi). haberci iyonu başına en az 2 en yoğun geçişler kullanılarak MRM yöntemi dosyasında geçiş listesini kaydedin. Nihai deneyde teyit nicelendirilmesi için 1 ve 1: 2 geçişler içerir.
   NOT: Bazı MS üreticileri bir işlevi vardır (yani, Waters Intellistart) otomatik MRM veya SRM analizi optimizasyonu için. % 0.1 FA ile% 70 ACN - Mümkünse 50 kombine mobil fazlar peptidler demlenmeye.

4. LC-MRM Metot Geliştirme

Not: Ultra Performance üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi bağlanmış Sıvı Kromatografisi (UPLC) sistemi, sentetik peptitlerin bir karışımı analiz edin. Kaynak temiz olduğundan emin olun. Çözücü A% 0.1 FA ile GKD ₂ 0; Çözücü B% 0.1 FA ACN edilir.

1. Aynı fazın bir ön-sütun C-18 fazı (1.6 mikron çapında, 90 boşlukları, 2.1 mm x 50 mm uzunluk) ile dolu ve bağlı UPLC kolonu ile donatılmış olan LC-MS sistemi kullanın.
2. 300 ul cam ekleme şişe içine 10 dakika ve transfer 60 ul 16.000 g buz, santrifüj defrost BOS dijestleri ve C ^o -20 geri kalanını saklamak
3. 10 dakika 1 kullanılarak standart eğri noktasından en yüksek konsantrasyonu enjekte -% 40 ACN doğrusal degrade (gradyan ayarları için bakınız Tablo 1)
4. 3. adımda oluşturulan tüm geçişler ile ortaya çıkan kromatogram ve not tutma süresine ve peptid başına üst iki en yoğun (kantitatif) geçişler açın.
5. Bu bilgilere dayanarak, peptidler (bir örnek için bakınız Şekil 2) ölçmek için zaman aşımına kanallı (adım 3.6 oluşturulan) 10 dk MRM yöntemi güncelleyin. duyarlılığı korumak için, 8'den büyük tepe ortalama puan her kanalı tutmak ve her bir peptit için en az bir geçiş 0.01 saniye değerinden daha büyük bekleme süresi.
6. MRM yöntemi 'çözücü gecikmelere' şunlardır: başında bir 10 birinci tepe elüsyon önce sn kadar veyöntemde, son zirve elüsyon sonra 20 sn sonunda başka. MS yöntemi dosyasındaki yöntem olaylarda "çözücü gecikmeler" seçerek bunu yapın.
7. zamanlanmış MRM yöntemi ile standart eğri çalıştırın ve doğrusallık kontrol ederek (adım 3.6 oluşturulan) geçişler ile hiçbir engel nonspesifik zirveleri olmamasına dikkat edin.
8. peptidler yöntemiyle olmayan çivili havuza kontrol ve hastalık CSF çalıştırarak saptanabilir olup olmadığını belirleyin.
9. tahlilinden saptama sınırının altında olan peptidler çıkarın.

Peptid geçişleri Şekil Dinamik MRM MS Yöntemi 2. örneği. Zamanlı kanallarının kurulması tutma sürelerine göre gruplanabilir. Seçilmiş işaretleyici peptidler kromatografisi sütunundan elute olarak MKYS etkinleştirme bir zamanlı bir şekilde dahil edilmesi için, tra sayısını en aza indirirbir süre içinde nsitions ve testin duyarlılığını artırır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

İç Standartları 5. eklenmesi

NOT: Daha önce tarif edildiği ^{gibi, 10,} izotop etiketli dahili standartlar deneyde dahil edilebilir. Nedeniyle bu standartların gider, ilk matris içinde peptidler değerlendirmek için tavsiye edilir.

1. BOS tespiti için optimize idealdir peptidler belirleyin: En yüksek yoğunlukta ve parazit doruklarına olmadan, çoğu tekrarlayan olan peptidler seçin.
2. Peptidler, ilgili tasarım endojen peptidi en az 6 a bağımlı peptidden kütlesini artırmak ağır ^{13C 15N} amino asit etiketleri dahil etmek. Ağır PEP 6 ek amino asitler, ya N- ya da C-ucu - Ayrıca, 4 etiket eklemekgelgit triptik sindirim kontrol etmek için.
3. sindirim tamponu stabil izotop etiketli dahili standartların seyreltin (adım 2.4). Daha önce gelişimi sırasında gözlemlenen abundancies bağlı olarak çeşitli düzeylerde spike tarafından BOS'ta çivili olacak kararlı izotop işaretli iç standart ideal miktarını belirler. endojen peptid kararlı izotop işaretli standardın: 1 oranını yaklaşık olarak 1 sağlamayı hedefliyoruz.
   NOT: izotop etiketli dahili standartlar çeşitli ticari şirketler tarafından sentezlenebilir.

BOS Hasta Örneklerinin 6. LC-MRM Deneyi

1. Spike CSF 100 ul içine kararlı izotop etiketli standartların miktarı optimize edilmiş ve karışım dondurarak kurutun.
2. tampon sindirmek 20 ul CSF süspanse ve puan 2.7 açıklandığı gibi sindirim gerçekleştirmek - 2.10.
3. 4. adımda geliştirilen LC-MRM yöntemi kullanılarak örnekleri analiz edin.
4. kantitatif analiz için, standart pep çalıştırmakStandart bir eğri 0 -15 pmol konsantrasyonlarda gelgit. Standart eğrinin hazırlanması için adım 2.5 bakınız.

7. Veri analizi

NOT: Nicel veriler temel zirve iç standartları (ağır etiketli peptidler) yoğunluğu oranına dayanmaktadır. SRM / MRM veri analizi ile ilgili detaylı bilgiler önceden ¹⁰ tanımlanmıştır. Oran verileri daha sonra mutlak seviyelerini belirlemek ya da ağır-işaretli peptid ilave konsantrasyonundan hesaplanmalarının standart bir eğri kullanılabilir.

1. Kitle spektrometre üreticilerin standart yazılım ¹⁰ kullanılarak LC-MRM verileri analiz edin. Alternatif olarak, nicel MRM veri ¹⁰ analiz etmek Skyline yazılımı kullanın.
2. Böyle çivili maya enolaz ya da her vadede istikrarlı bir izotop işaretli standart olarak bir iç standart tepkisini kontrol ederek kaçak hassasiyetini kontrol edin. varyasyon (CV) katsayısı daha büyük olmadığından emin olun% 25.
3. El ile doğruluğunu sağlamak için veri bilgi notuna gözden geçirin. Yani uygun bir kararlı izotop etiketli dahili standart her peptid ve oranı analiz varsa peptid kararlı izotop işaretli sürümünü kullanın.
4. CSF 100 ul başına pmol mutlak değerleri elde etmek için, aynı anda çalıştırıldı uygun standart eğriler üzerinden oranı verilerini çalıştırın.
5. varyasyon (CV) katsayısı hesaplayın. Her bir peptidin CV yüksek verimli peptitler için% 25 altında ve% 15'in altında olmalıdır.
   NOT: 100 ul BOS değerleri başına Mutlak değer pmol sonraki aşağı istatistiksel analizde kullanılan olabilir.

8. Apolipoprotein E İzoform Durumu

NOT: ApoE izoformu durumunu belirlemek için, karşılık gelen peptitlerin bulunması, her izoformunu belirlenerek gerçekleştirilebilir.

1. > 1000 sinyalin BOS eşiğinin 100 ul ApoE düşününBu peptid için olumlu Yapılır-gürültü. Hastanın izoform durumunu belirlemek için yok gerekli peptitler / için Şekil 5'e bakınız. ApoE ifadesini toplam her izoform% hesaplayarak alel ifadesini belirleyin.

Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen yöntem kullanılarak, 54 proteinlerden 74 peptidlerin oluşan yüksek verim 10 dakika çoklu deney nörodejeneratif hastalıkların, Alzheimer hastalığı ve Lewy Body Dementia (LBD) ^8. Şekil 3 belirteçleri için bir tahlil olarak, geliştirilmiş yayınlanan çok katlı bir kromatogramı göstermektedir Daha önce ⁸ testte önemli bir peptid belirteçleri. Tahlilinde ve niceliksel geçişler dahil peptitler. Tablo...

Tartışmalar

Tüm MS bazlı deneyler gibi, yöntemde kritik adım iç standart uygun ve doğru miktarlarda tespitidir. Mutlak niceleme kullanılıyorsa, o zaman, standart eğri çivili peptidlerin, doğru miktarlarda kritiktir.

Bizim tahlil CSF veya öncesinde MS analizi temiz yukarı veya tuzsuzlaştırma adımlardan her türlü kullanım yağış gerektirmez - bu tamamen tek kap reaksiyonu yöntemidir. Nedeniyle CSF küçük hacimli ve sınırlı karmaşıklığı (plazmaya kıyasla) için, bu adımlar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Fisher	A955-1
Formic acid, LC-MS grade,	Fisher	A117-50
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
Hydrochloric acid, 37% w/w	VWR	BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide	Sigma	I1149-5G
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500
Trypsin, sequencing grade, modified	Promega	V5113
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Fisher	A116-50
Urea	Sigma	U0631-500g
Water, LC-MS ULTRA Chromasolv	Fluka	14263
Custom synthesised peptides desalted 1-4mg	Genscript	custom
heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides	Genscript	custom
ASB 14	Merck Millipore	182750-25gm
Thiourea	Sigma	T7875-500G
Tris base	Sigma	T6066
VanGuard precolumn	Waters	186007125
Cortecs UPLC C18+ 1.6um  2.1 x50mm column	Waters	186007114
Yeast Enolase	Sigma	E6126
300ul clear screw top glass vials	Fisher scientific	03-FISV
Y slit screw caps	Fisher scientific	9SCK-(B)-ST1X
Freeze dryer	Edwards Mudulyo	Mudulyo system
Concentrator/Speed vaccum	Eppendof	concentrator  plus 5301
Xevo -TQ-S mass spectrometer	Waters
Acquity UPLC system	Waters