מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לחקות קבוצה אנושית B Streptococcus (GBS) קולוניזציה וגינלית במודל בעכברים. שיטה זו עשויה לשמש כדי לחקור תגובות מארחות חיסוניות וגורם חיידקי תורם התמדת נרתיק GBS, כמו גם לבחון אסטרטגיות טיפוליות.

Abstract

סטרפטוקוקוס agalactiae (מהקבוצה B Streptococcus, GBS), הוא למעצמה קולוניאלית גראם חיובי, ללא תסמינים של מערכת העיכול האנושית ודרכי נרתיק של 10 - 30% ממבוגרים. אצל אנשים החיסון נפגעת, בילודים כולל, נשים בהריון, קשישים, GBS עלול לעבור פתוגן פולשנית גרימת אלח דם, דלקת פרקים, דלקת ריאות, דלקת קרום המוח. בגלל GBS הוא הפתוגן חיידקי מובילה של ילודים, מניעה הנוכחית מורכבת ההקרנה הריון מאוחר לגרורות GBS בנרתיק וטיפול אנטיביוטי שלאחר מכן peripartum של אמהות GBS חיובי. נטלו נרתיק GBS כבד הוא גורם סיכון למחלה והתנחלות בילוד. למרבה הצער, מעט מאוד ידוע על המארח וגורם חיידקי מקדמים או להתיר GBS קולוניזציה וגינלית. פרוטוקול זה מתאר טכניקה להקמת קולוניזציה וגינלית GBS המתמשכת באמצעות דגימה אחת β-אסטרדיול טרום טיפול יומי לקבוע לואה חיידקיםד. זה שיטות לפרטים נוספים כדי לנהל סוגי טיפולים נוספים או ריאגנטים עניין לאסוף נוזל שטיפה וגינלית ורקמות במערכת הרבייה. במודל עכבר זה יהיה עוד יותר את ההבנה של יחסי הגומלין GBS-המארח בתוך סביבת הנרתיק, אשר יוביל טיפולית מעניינת פוטנציאל לשלוט קולוניזציה הנרתיק של האם במהלך ההריון כדי למנוע העברת לגבי הילוד פגיע. זה גם יהיה עניין להגדיל את הבנתנו אינטראקציות חיידקי מארח כלליות בדרכי הנרתיק הנשיות.

Introduction

סטרפטוקוקוס agalactiae, מקבוצה B Streptococcus (GBS), הוא חיידק כמוס, גראם חיוביים אשר מבודד לעתים קרובות מהבטן בדרכי המין והשתן של מבוגרים בריאים. בשנות ה -1970, GBS התגלה בתור הסוכן המוביל לתמותה בילוד זיהומיות, עם למעלה מ -7,000 מקרים של המחלה בילוד בשנה ^1. מחלה מוקדמת GBS (סוף יום) מתרחשת בשעות או בימים הראשונים של החיים, נשאלת דלקת ריאות או מצוקה נשימתית, ולעתים קרובות מתפתח אלח דם, ואילו מחלות בגיל מאוחר (לוד) מתפתח לאחר מספר חודשים ומציג עם בקטרמיה, אשר לעתים קרובות ומקדמות דלקת קרום המוח ^2. החל משנת 2002, המרכז לבקרת מחלות ומניעתן ממליץ על בדיקה אוניברסלית עבור קולוניזציה וגינלית GBS ב הריון מאוחר וטיפול מונע אנטיביוטי במהלך הלידה (IAP) כדי GBS חיובי אמהות ^1. למרות הירידה של המחלה מוקדמת בכ -1,000 מקרים בארצות הברית מדי שנה בשל IAP,GBS נשאר הגורם המוביל של אלח דם בילוד מוקדם, ו התרחשות מאוחרת נשארת ¹ מעושה. בין אם ברחם, בזמן הלידה, או אפילו במקרים בגיל מאוחר, חשיפה לידתי עד GBS דורשת הישרדות, משוכל באמצעות מספר סביבות מארחות ומחסומים, התחמקות חיסונית, וכן, במקרה של דלקת קרום מוח, חציית דם הפיקוח ההדוק מוח ^2. Upstream של אינטראקציות הארסיות אלה בתוך הילוד הוא קולוניזציה הראשונית של מערכת הנרתיק האימהית. אימהי שיעורי קולוניזציה וגינלית GBS נעים בין 8-18% במדינות מפותחות ומתפתחות, עם שיעור ממוצע מוערך של 12.7% ^3,4. קולוניזציה GBS בדרך בנרתיק במהלך ההריון יכולה להיות קבועה, לסירוגין, או בעלת אופי ארעי בקרב נשים בודדות ^5. נקודה מעניינת הוא אימהית גיל> 36 שנים קשורות קולוניזציה המתמשכת ^6. גורמי סיכון ביולוגי סוציו אקונומי רבים להתיישבות הנרתיק GBSזוהה. גורמים ביולוגיים כוללים קולוניזציה GBS העיכול והיעדר לקטובצילוס בתוך הבטן. עם זאת, מוצא אתני, השמנת יתר, היגיינה, פעילות מינית גם קושרו עם מרכבת ⁷ נרתיק GBS.

למרות לשמצה בגרימת זיהומים בילוד, GBS גורם גם מגוון של זיהומים אימהיים הוא peripartum ולאחר לידה. מרכבת GBS היא גדלה אצל נשים עם הצגת דלקת נרתיק ⁸ ו, במקרים מסוימים, יכולה להיות אפילו את ישות מחל ^9. בנוסף, התרוממות GBS באיברי הרבייה במהלך ההריון עלולה לגרום זיהום תוך-שפיר או chorioamnionitis ^10. יתר על כן, ב עד 3.5% מכלל ההריונות, GBS מפיצה לשלפוחית השתן לגרום לזיהום בדרכי השתן או בקטרוריה אסימפטומטית ^11. בקטרוריה GBS במהלך ההריון קשורה לסיכון מוגבר של קדחת לידתית, chorioamnionitis, לידה מוקדמת, ואת prematurקרע הדואר של ממברנות ^12. יחדיו, בנוכחות GBS בתוך מערכת הנרתיק קשורה לזיהומים של רקמות מארחים מרובים, ואת היכולת לבטל GBS מן הנישה הזו הוא הכרחי עבור שניהם בריאות האם בילוד.

עד לאחרונה, רוב העבודה בחינת אינטראקציות GBS עם מערכת הצרויקו הוגבל מודלים תא במבחנה ^13-15. ניסויים במבחנה אלה חשפו גורמי חיידקיים שחשובים לדבקות, כוללים חלבוני משטח כזה חוזר פילים ו סרין עשיר ^17,18, כמו גם מערכות רגולטוריות דו רכיבים ^15,19 ותגובת התעתיק העולמית של האפיתל נרתיקית GBS ^19. עם זאת, על מנת להבהיר את מארח חיידק האינטראקציות באופן מלא בתוך מערכת הנרתיק, במודל חיה חזק הכרחי. עבודה מוקדמת הראתה כי GBS ניתן להשבה מתוך בדרכי הנרתיק של עכברים מחוסנים ^20,21 וחולדות ^{22 בשני תנאים בהריון שאינן בהריון. בשנת 2005, קולוניזציה וגינלית GBS לטווח קצר הייתה דגם בעכברים כדי לבחון את היעילות של אנזים ממס הפאג לטיפול GBS בנרתיק פני תקופה של 24 שעות 23. מספר שנים לאחר מכן, במודל של עכברי קולוניזציה וגינלית לטווח ארוך GBS פותח ללמוד גורמים המארח חיידקי מסדירי התמדת GBS. מודל זה זיהה מספר גורמים GBS תורם קולוניזציה, כולל הנספחים משטח 17,18 ומערכות דו רכיבי GBS 19,24. מודל זה תרם לזיהוי מנגנוני התגובה מארח 19,25 ו שימש כדי לבדוק אסטרטגיות טיפוליות שונות, כולל פפטידים אימונו-26 ו פרוביוטיקה 27. פרוטוקול זה נותן את ההדרכה הדרושה כדי לחסן GBS לדרכי עכבר הנרתיק ולאחר מכן לעקוב קולוניזציה ולאסוף דגימות עבור ניתוחים נוספים.}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל העבודה בבעלי החיים אושרה על ידי משרד טיפול בבעלי חי מעבדה בסן דייגו סטייט ועורך תחת סטנדרטי וטרינרים קבלו. עכברים נקבה, גיל 8 - 16 שבועות, שימשו לפיתוח שיטה זו.

1. הזרקת הכנה Intraperitoneal של β-אסטרדיול

1. מדוד את β-אסטרדיול (0.5 מ"ג / עכבר) על לשקול נייר כשהוא לבוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE). זהירות: β-אסטרדיול יכול להיספג דרך העור ומשטחים ריריים.
2. העבר β-אסטרדיול לצינור מערבולת חרוטי 15 מ"ל עד שכל הגושים יוסרו β-אסטרדיול הוא אבקה דקה. צייר את שמן שומשום (100 μl / עכבר) לתוך מזרק 10 מ"ל. מזרק-מסנן שמן שומשום לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל את-אסטרדיול β באמצעות מסנן 0.45-מיקרומטר. וורטקס צינור חרוטי 15 מ"ל עד-אסטרדיול β הוא תרחיף הומוגני בשמן שומשום.
3. צייר את β-esההשעיה tradiol לתוך מזרק 10 מ"ל חדש. עם 18 G, 1-ב. מחט, aliquot 100 μl של ההשעיה לתוך מזרקים טוברקולין 1 מ"ל. הכן מזרק אחד עבור כל עכבר. מניח 26 חדש, הסטרילי G, ½-ב. מחט על מזרק אחד טוברקולין.
4. נהל 0.5 מ"ג של β-אסטרדיול המרחפים 100 μl של שמן שומשום (5 מ"ג / מ"ל) לכל עכבר 24 שעות לפני חיסון חיידקי. להזריק כל עכבר בתוך החלל הצפק, ב רביעי הבטן התחתונים, רק בצד ימין או שמאל של קו האמצע, כפי שתואר לעיל ^28.
   הערה: אין ניקוי או הגזיזה של הזריקה הוא הכרחי.

2. נרתיקי הרכבה עם GBS

1. יום אחד לפני חיסון, לגדל תרבית נוזל לילה 5 מ"ל של זן של עניין GBS, כגון A909 (סרוטיפ Ia), במרק טוד יואיט (THB) על 37 מעלות צלזיוס.
2. תת תרבות GBS הלילה בווליום 01:10 לתוך THB הטרי לדגור על 37 מעלות צלזיוס. לגדל אתחיידקים לשלב יומן אמצע (OD ₆₀₀ = 0.4-0.5). הערה: זה בדרך כלל ייקח 2 - 3 שעות, בהתאם לזן של GBS.
3. מעביר את תת-התרבות על חיידקי צינור גלול חרוטי 15 מיליליטר סטרילי ב 3000 g × למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה חיידקי 200 μl של בופר פוספט סטרילית (PBS).
4. באמצעות הגלולה המושעית, להביא 3 - 5 מיליליטר של PBS (1 מיליליטר לכל 10 עכברים) בדיוק OD ₆₀₀ = 0.4 בתוך שפופרת תרבות של 5 מיליליטר חדשה. זה יהיה ריכוז של ~ 1 × 10 ⁸ יחידות המושבה להרכיב (CFU) / מ"ל. מעבירים צינור חרוטי 15 מ"ל חדש מחדש גלולה החיידקים 3,000 גרם × למשך 5 דקות. לשאוב supernatant.
5. Resuspend גלולה ב PBS ב 1/10 נפח המקורי. לדוגמה, אם 3 מ"ל של OD ₆₀₀ = 0.4 היה pelleted, ואז resuspend אותו 300 μl של PBS. הערה: זהו השעית החיידקים הסופית (~ 1 × 10 ⁹ CFU / ml) המשמשת חיסון בעלי חיים.
6. Reserve 50 μl של השעיה זו דילול סדרתי ציפוי על אגר THB לקבוע את הבידוד מדויק.
7. לחסן כל עכבר עם 10 μl של השעית החיידקים הסופית כך 1 × 10 ⁷ CFU ניתנת כל עכבר.
   1. כדי לחסן, לרסן את העכבר באופן ידני על ידי הבטחת העור הרפוי על בעורפו בין של האגודל ואצבע מורה המטפלים ולאחר מכן לשתק את הזנב, כפי שתואר לעיל ^28.
   2. צייר את 10 μl של GBS מוכן בשלב 2.6 לתוך קצה פיפטה טעינת ג'ל 200 μl. הכנס את קצה 5 עד 10 מ"מ לתוך לומן בנרתיק לוותר על 10 μl של הבידוד.
      הערה: טיפי טעינת ג'ל עדיפים על טיפי 200 μl סטנדרטיים כדי למזער את הסיכון של טראומה או פציעת איברים, במיוחד עכברים צעירים יותר או קטנים יותר.
   3. מייד לאחר חיסון, לשחרר את בעורף ולרומם את הקצה האחורי של העכבר, הרמת העכבר בזנבו walking את רגליו הקדמיות על משטח קשה עבור ~ 1 דק '.
   4. ראייה לבדוק את פתח הנרתיק לכל backflow של בידוד. אם backflow הוא ציין, קצה פיפטה טרי ניתן להשתמש כדי לתפעל או להגדיל את פתח הנרתיק, דבר המקל על ספיגה של הזרימה חוזר לתוך לומן. בנוסף, backflow ניתן aspirated דרך פיפטה מחדש מחוסן.
      הערה: אם מתן סוכנים אקטואליים, אורגניזמים פרוביוטיים, או חלבונים בעלי עניין, בהיקף של עד 20 μl חיץ פיסיולוגי יכול להינתן בדרכי נרתיקית.

3. שטיפת לומן בנרתיק לכמת טען GBS

1. הכן אחד צינור מיקרו צנטריפוגות 1.5 מ"ל לכל עכבר על ידי הוספת 100 μl של PBS. זמן קצר לפני בניקוי, טרום להרטיב את הספוגית ב PBS.
2. לרסן את העכבר כמתואר בשלב 2.7.1 והכנס את ספוגית 10 מ"מ לתוך לומן הנרתיק. בעדינות לסובב את ספוגית 4 פעמים עם כיוון השעון ו -4 פעמים נגד כיוון השעון, הפעלת לחץ קל על קיר הנרתיק.
3. מעבירים את ספוגית אל הצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל עם 100 μl של PBS. לפני הציפוי, מערבולת צינור microcentrifuge עבור ~ 15 שניות כדי לשחרר את חיידקי מהמקלון. סדרתי לדלל מדגם ב PBS צלחת 20 μl של דילולים 1:10 דרך 1: 10,000 על צלחות אגר בינוני ההפרש מוכן לפי הוראות היצרן. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. מושבות GBS יופיעו גם ורוד או סגול בהיר בצבע. פלורה אנדוגני אחרת תהיה עכבות, או תופיע מושבות כחולות, לבנות או אפורות.

4. איסוף נוזלים בנרתיק שטיפה

1. לרסן את העכבר כמתואר בשלב 2.7.1. בעזרת קצה פיפטה טעינת ג'ל 200-μl, pipet 20 μl של PBS לתוך לומן הנרתיק. בעדינות pipet את הווליום כולו ולמטה 4 פעמים בתוך לומן, ולאחר מכן למשוך את כל נפח באותו קצה פיפטה. הערה: אם נוזל השטיפה הוא עבה עם רירי, קצה פיפטה תקן 200 μlניתן להשתמש כדי לאסוף את נוזל השטיפה הסופי.
2. אם חיסכון נוזל שטיפה לניתוח ציטוקינים או כימות CFU, לוותר לתוך צינור microcentrifuge 0.7 מ"ל. אם קביעת השלב של ייחום, לוותר לפחות 5 μl של נוזל שטיפה לשקופית זכוכית ולבחון את התאים בהגדלה 100X על מיקרוסקופ אור. הערה: לקבלת דוגמאות של שלבי הייחום, ראה איור 1.

Dissection רקמות 5. המגון

1. עבור כל עכבר, להכין שלושה צינורות מתברגים 2 מיליליטר (אחד לכל רקמות: נרתיק, צוואר רחם, ורחם). ממלא כל צינור עם מספיק (0.4 - 0.5 גרם) 1.0 מ"מ חרוזי zirconia כדי לכסות את תחתית החרוטים בצורה של הצינור.
2. חיטוי הצינורות המוכנים לפני איסוף רקמות במשך 30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס, במיוחד אם לכימותי עומס חיידקים. הוסף 500 μl של PBS סטרילי כדי צינור אחד. לשקול כל צינור לאחר מעוקר ולהקליט לשימוש עתידי כדי לחשב משקל רקמה התאושש.
3. להקריב את העכבר באמצעות אישרה שיטות מוסדיים כגון מחנק CO ₂ ו נקע בצוואר הרחם. תרסיס לאורך הבטן הגחון עם 70% EtOH. במספריים סטריליות, לפתוח את חלל abdominopelvic, להרים את העור שרירי הגב ועל הבטן, ואת מקומו המעיים כך במערכת הרבייה חשופה.
4. לעקר את המספריים עם 70% EtOH, לנגב לנקות במידת הצורך, והעביר את שני קרני הרחם באורך אמצע בין הגוף הרחם והשחלות. בעזרת מספרי מלקחיים, שומן קרבי נפרד, ממברנות, ואת שלפוחית ​​השתן מן במערכת הרבייה, נע caudally.
5. לעקר מספריים כמתואר בשלב 5.4. רוחבי לחתוך את הנרתיק קרוב הפות ככל האפשר כדי להפריד את מערכת הרבייה מהגוף. הרם והוצא את מערכת הרבייה השלמה ולמקם אותו בצלחת פטרי סטרילית.
6. באמצעות סכין גילוח חדש, להפריד את הרחם מצוואר הרחם ב קיצוץ רוחבי אחד. לעקר את סכין הגילוח עם 70%EtOH, ולאחר מכן להפריד את צוואר הרחם מהנרתיק ב קיצוץ רוחבי אחד. הערה: לא תהיה כמות מינימלית של רקמת הרחם עדיין מחוברת אל צוואר הרחם. תהיה כמות מינימאלית של רקמת נרתיק עדיין מחוברת אל צוואר הרחם.
7. בעזרת מלקחיים סטריליות, להעביר את כל הרקמות לתוך צינורות 2 מ"ל של כל אחד מהם המכיל PBS ו שמאחד חרוזים. נקה את המלקחיים עם 70% EtOH בין טיפול בכל רקמה.
8. לשקול כל צינור כובע בורג 2 מ"ל ולחסר את המשקל המקורי של צינור כדי לקבוע את משקל רקמות. משקולות רקמות בדרך כלל להשתנות בין 20 - 100 מ"ג. בחוזקה לאטום את צינורות כובע בורג homogenize הרקמות עבור 1 דקות במהירות המרבית ב homogenizer רקמות.
9. כדי לכמת עומס חיידקי, סדרתי לדלל 25 μl של homogenate רקמות דילולים צלחת 01:10 דרך 1: 10,000 על צלחות אגר בינוני ההפרש. דגירה צלחות כמתואר בשלב 3.3. כדי לאחסן דגימות כימות ציטוקינים, להקפיא homogenates רקמה על -20 ° C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במהלך הפיתוח של המודל הזה, תצפיות מרובות נעשו לגבי הגורמים המשפיעים על משך קולוניזציה וגינלית GBS. כדי לקבוע כיצד לשלב הייחום בבית משפיע חיסון התמדה חיידקי GBS, עכברים בוימו ביום של חיסון באמצעות נוזל שטיפה וגינלית. איור 1 מדגים את ארבעת השלבי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כדי לקדם את קידום ההבנה של אינטראקציות GBS עם שני מארח חיידקים אחרים בהקשר של המארח, במודל חיה נדרש. עבודה זו מתארת ​​את ההיבטים הטכניים של הקמת קולוניזציה וגינלית GBS בעכברים. פרוטוקול זה משיג> 90% קולוניזציה של עכברים ללא שימוש בהרדמה לחסן חיידקים או לאסוף דגימות ספו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μl gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 ml syringes	BD	309604
1 ml syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Corning	21-031-CV