Un modèle murin du Groupe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonisation

Résumé

Le but de ce protocole est d'imiter groupe humain B Streptococcus (GBS) colonisation vaginale dans un modèle murin. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les réponses immunitaires de l'hôte et des facteurs bactériens qui contribuent à la persistance GBS vaginale, ainsi que pour tester des stratégies thérapeutiques.

Résumé

Streptococcus agalactiae (streptocoque du groupe B, GBS), est une colonisatrice asymptomatique Gram-positif du tractus gastro - intestinal humain et tractus vaginal de 10 - 30% des adultes. Chez les individus immunodéprimés, y compris les nouveau-nés, les femmes enceintes et les personnes âgées, GBS peut passer à un pathogène invasif causant la septicémie, l'arthrite, la pneumonie et la méningite. Parce que GBS est un pathogène bactérien leader des nouveau-nés, la prophylaxie actuelle est composée de dépistage de fin de gestation pour GBS colonisation vaginale et un traitement antibiotique peripartum subséquente des mères GBS-positives. Lourd fardeau GBS vaginal est un facteur de risque pour les maladies néonatales et de la colonisation. Malheureusement, on sait peu sur l'hôte et facteurs bactériens qui favorisent ou permettent GBS colonisation vaginale. Ce protocole décrit une technique pour établir persistante GBS colonisation vaginale à l'aide d'un seul prétraitement de β-oestradiol et l'échantillonnage par jour pour déterminer loa bactérienneré. Il détaille en outre des méthodes pour administrer des thérapies ou des réactifs d'intérêt supplémentaires et pour recueillir les sécrétions vaginales de lavage et les tissus de l'appareil reproducteur. Ce modèle de souris favorisera la compréhension de l'interaction GBS-hôte dans le milieu vaginal, ce qui conduira à des cibles thérapeutiques potentielles pour contrôler la colonisation vaginale de la mère pendant la grossesse et pour prévenir la transmission au nouveau-né vulnérable. Il sera également intéressant d'augmenter notre compréhension des interactions générales bactérienne-hôte dans le tractus vaginal féminin.

Introduction

Streptococcus agalactiae, Streptococcus du groupe B (GBS), est une encapsulé, d'une bactérie à Gram-positif qui est fréquemment isolé à partir de l'intestin et du tractus génito - urinaire chez des adultes sains. Dans les années 1970, l' ABG a émergé comme le principal agent de la mortalité infectieuse néonatale, avec plus de 7.000 cas de maladie néonatale par an ^1. L'apparition précoce de la maladie GBS (NEM) se produit dans les premières heures ou les jours de la vie, se pose comme une pneumonie ou une détresse respiratoire, et souvent se développe en septicémie, alors que la maladie d'apparition tardive (LOD) s'ensuit après plusieurs mois et présente une bactériémie, qui souvent avances à la méningite ^2. En 2002, les Centers for Disease Control and Prevention recommande le dépistage universel de GBS colonisation vaginale à la fin de la gestation et la prophylaxie antibiotique intrapartum (IAP) aux mères GBS-positives ^1. Malgré la réduction des maladies d'apparition précoce d'environ 1000 cas aux États-Unis chaque année en raison de l'IAP,GBS reste la principale cause de septicémie néonatale apparition précoce, et l' apparition d'apparition tardive reste inchangée ^1. Que ce soit in utero, pendant le travail, ou même dans les cas d'apparition tardive, l'exposition néonatale à l'ABG exige la survie, transversale à travers un certain nombre d'environnements et les obstacles hôtes, l'évasion immunitaire et, dans le cas de la méningite, traversée de la encéphalique très réglementé encéphalique ^2. En amont de ces interactions virulentes au sein du nouveau-né est la colonisation initiale de la voie vaginale maternelle. Maternelle GBS taux de colonisation vaginale vont 8-18% dans les pays développés et en développement, avec un taux moyen estimé de 12,7% ^3,4. GBS colonisation du tractus vaginal pendant la grossesse peut être constante, intermittente, ou de nature transitoire chez les femmes individuelles ^5. Fait intéressant, la mère âge> 36 ans est associée à la colonisation persistante ^6. De nombreux facteurs de risque biologiques et socio-économiques de GBS colonisation vaginalea été identifié. Les facteurs biologiques incluent gastro colonisation GBS et l' absence de Lactobacillus dans l'intestin. Cependant, l' origine ethnique, l' obésité, l' hygiène et l' activité sexuelle ont également été associés au SGB portage vaginal ^7.

Bien connu pour causer des infections néonatales, GBS provoque également une variété d'infections maternelles les deux peripartum et post-partum. SGB est augmentée chez les femmes présentant une vaginite ⁸ et, dans certains cas, ils peuvent même être à l'entité pathologique ^9. En outre, l' ABG ascension de l'appareil reproducteur pendant la grossesse peut entraîner une infection intra-amniotique ou chorioamnionitis ^10. En outre, dans un maximum de 3,5% des grossesses, GBS dissémine à la vessie pour provoquer une infection des voies urinaires ou bactériurie asymptomatique ^11. bactériurie à GBS pendant la grossesse est associée à un risque accru de fièvre intrapartum, chorioamniotite, accouchement prématuré, et premature rupture des membranes ^12. Pris ensemble, la présence de GBS dans le tractus vaginal est liée à des infections des tissus hôtes multiples, et la capacité d'éliminer l'ABG de ce créneau est impératif pour la santé maternelle et néonatale.

Jusqu'à récemment, la majorité des travaux d' examen des interactions GBS avec le tractus cervicovaginal a été limitée à des modèles cellulaires in vitro ^13-15. Ces expériences in vitro ont mis en évidence les facteurs bactériens qui sont importants pour l' adhérence, comprenant des protéines de surface comme une serine pili et riche en répétitions ^17,18, ainsi que des systèmes de régulation à deux composants ^15,19 et de la réponse transcriptionnelle globale de l'épithélium vaginal GBS ^19. Toutefois, afin d'élucider totalement les interactions hôte-microbe dans le tractus vaginal d'un modèle animal robuste est nécessaire. Les premiers travaux ont démontré que l' ABG peut être récupéré à partir du tractus vaginal de souris inoculées ^20,21 et rats ^{22 dans les deux conditions enceintes et non enceintes. En 2005, à court terme GBS colonisation vaginale a été modélisée chez la souris pour examiner l'efficacité d'une enzyme phage lytique pour traiter GBS vaginal sur une période de 24 h 23. Quelques années plus tard, un long-terme GBS modèle de souris de la colonisation vaginale a été développé pour étudier l'hôte et bactériennes facteurs régissant l'ABG persistance. Ce modèle a identifié de nombreux facteurs GBS contribuant à la colonisation, y compris les appendices de surface 17,18 et GBS systèmes à deux composants 19,24. Ce modèle a contribué à l'identification des mécanismes de réponse d'accueil 19,25 et a été utilisé pour tester plusieurs stratégies thérapeutiques, y compris les peptides immunomodulateurs 26 et probiotiques 27. Ce protocole donne les indications nécessaires pour inoculer GBS dans le tractus vaginal de la souris et de suivre ensuite la colonisation et de prélever des échantillons pour des analyses ultérieures.}

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Protocole

Tous les travaux des animaux a été approuvé par le Bureau du Lab Animal Care à l'Université d'État de San Diego et mené en vertu des normes vétérinaires acceptées. Des souris femelles, âge 8 - 16 semaines, ont été utilisés pour le développement de cette méthode.

1. Préparation et injection intrapéritonéale de β-estradiol

1. Mesurer β-estradiol (0,5 mg / souris) sur papier peser tout en portant un équipement de protection individuelle (EPI). ATTENTION: β-estradiol peut être absorbé par la peau et les surfaces muqueuses.
2. Transfert β-estradiol à un tube conique de 15 ml et le vortex jusqu'à ce que tous les morceaux sont enlevés et le β-estradiol est une poudre fine. Dresser l'huile de sésame (100 ul / souris) dans une seringue de 10 ml. Seringue filtre l'huile de sésame dans le tube conique de 15 ml contenant la β-estradiol en utilisant un filtre de 0,45 um. Vortexer le tube conique de 15 ml jusqu'à ce que le β-oestradiol est une suspension homogène dans l'huile de sésame.
3. Dressez les ß-estradiol suspension dans un nouveau 10 ml seringue. Avec un 18 G, 1-in. l'aiguille, partie aliquote de 100 ul de la suspension dans des seringues de tuberculine de 1 ml. Préparer une seringue pour chaque souris. Placez une nouvelle, stérile 26 G, ½ po. aiguille sur chaque seringue tuberculine.
4. Administrer 0,5 mg de β-oestradiol mis en suspension dans 100 pi d'huile de sésame (5 mg / ml) à chaque souris 24 heures avant l'inoculation bactérienne. Injecter chaque souris dans la cavité péritonéale, dans les quadrants abdominaux inférieurs, juste à droite ou à gauche de la ligne médiane, comme décrit précédemment ^28.
   NOTE: Pas de nettoyage ou d'écrêtage du site d'injection est nécessaire.

2. Vaginal Inoculation avec GBS

1. Un jour avant l'inoculation, développer une culture liquide pendant la nuit 5 ml d'une souche GBS d'intérêt, tels que les A909 (sérotype Ia), dans un bouillon Todd Hewitt (THB) à 37 ° C.
2. Repiquer la culture de la nuit GBS à un volume 01h10 en THB frais et incuber à 37 ° C. Cultivez labactéries à la phase mi-log (DO ₆₀₀ = 0,4-0,5). NOTE: Cela prend généralement 2 - 3 h, en fonction de la souche de GBS.
3. Transférer la sous-culture à une bactérie stériles tube et à granulés coniques de 15 ml à 3000 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension le culot bactérien dans 200 ul de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
4. En utilisant le culot remis en suspension, apporter 3 - 5 ml de PBS (1 ml par souris) 10 exactement _DO600 = 0,4 dans un nouveau tube de culture de 5 ml. Ce sera une concentration de 1 x 10 ~ ⁸ unités formant des colonies (UFC) / ml. Transfert à un nouveau tube conique de 15 ml et re-sédimenter les bactéries à 3000 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
5. Remettre en suspension le culot dans du PBS à 1/10 du volume initial. Par exemple, si 3 ml de _DO600 = 0,4 a été pastillé, puis remettre en suspension dans 300 pi de PBS. NOTE: Ceci est la suspension finale bactérienne (~ 1 × 10 ⁹ UFC / ml) utilisée pour l' inoculation des animaux.
6. ReServe 50 pi de cette suspension pour la dilution en série et étalement sur gélose THB pour déterminer l'inoculum exacte.
7. Inoculer chaque souris avec 10 pi de la suspension bactérienne finale de telle sorte que 1 × 10 ⁷ UFC est administré à chaque souris.
   1. Pour inoculer, restreindre la souris manuellement en fixant la peau lâche à la peau du cou entre le pouce du gestionnaire et l' index, puis immobilisant la queue, comme décrit précédemment ^28.
   2. Dresser 10 ul du GBS préparé à l'étape 2.6 en une pointe de chargement pipette gel de 200 pi. Insérez le bout de 5 à 10 mm dans la lumière du vagin et de distribuer les 10 ul d'inoculum.
      REMARQUE: Conseils de chargement de gel sont préférés aux standards des conseils de 200 pi pour minimiser le risque de traumatisme des organes ou des blessures, en particulier chez les souris plus jeunes ou plus petites.
   3. Immédiatement après inoculation, relâcher la peau du cou, et d'élever l'extrémité arrière de la souris, en soulevant la souris par la queue et warler les pattes avant sur une surface dure pour ~ 1 min.
   4. Inspecter visuellement l'ouverture vaginale pour tout reflux d'inoculum. Si le reflux est observé, une pointe de pipette fraîche peut être utilisée pour manipuler ou agrandir l'orifice vaginal, ce qui facilite l'absorption du reflux dans la lumière. En outre, le reflux peut être aspiré par l'intermédiaire d'une pipette et ré-inoculée.
      NOTE: Si l'administration d'agents topiques, organismes probiotiques, ou des protéines d'intérêt, un volume jusqu'à 20 ul dans un tampon physiologique peut être donné dans le tractus vaginal.

3. écouvillonnage le Vaginal Lumen à Quantifier GBS charge

1. Préparer un tube de 1,5 ml de micro-centrifugeuse par souris en ajoutant 100 pi de PBS. Juste avant pistonnage, pré-humidifier l'écouvillon dans PBS.
2. Retiens la souris comme décrit dans l'étape 2.7.1 et insérer la tige de 10 mm dans la lumière vaginale. Tournez doucement l'écouvillon 4 fois dans le sens horaire et 4 fois dans le sens antihoraire, en appliquant une légère pression sur la paroi vaginale.
3. Transférer le coton-tige sur le tube de microcentrifugation de 1,5 ml, avec 100 ul de PBS. Avant de placage, vortex le tube de microcentrifugeuse pendant ~ 15 sec pour libérer les bactéries de l'écouvillon. Chaque échantillon dilué en série dans du PBS et de la plaque 20 ul de dilutions 1:10 à 1: 10000 sur des plaques différentielles milieu d'agar-agar préparées selon les instructions du fabricant. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 heures. colonies de GBS apparaissent soit rose vif ou de couleur mauve. Autres flore endogène seront inhibés ou apparaissent sous forme de colonies bleu, blanc ou gris.

4. Collecter le liquide vaginal Lavage

1. Retiens la souris comme décrit à l'étape 2.7.1. En utilisant une pointe de pipette chargement de gel de 200 pi, pipette 20 ul de PBS dans la lumière vaginale. pipeter doucement la totalité du volume de haut en bas 4 fois dans la lumière, puis retirer la totalité du volume de la même pointe de la pipette. NOTE: Si le liquide de lavage est épaisse avec les muqueuses, une pointe de pipette 200 pi normepeut être utilisé pour recueillir le liquide de lavage final.
2. En cas d'enregistrement du liquide de lavage pour l'analyse des cytokines ou UFC quantification distribuer dans un microtube de 0,7 ml. Si la détermination du stade de l'oestrus, distribuer au moins 5 pi de liquide de lavage sur une lame de verre et d'observer les cellules sous grossissement 100X sur un microscope optique. NOTE: Pour des exemples d'étapes œstraux, voir la figure 1.

5. Dissection tissulaire et Homogénéisation

1. Pour chaque souris, préparer trois 2 ml tubes à bouchon à vis (un pour chaque tissu: vagin, col de l'utérus, et de l'utérus). Remplir chaque tube avec de grandes (0,4 à 0,5 g) 1,0 mm perles de zircone pour couvrir le fond de forme conique du tube.
2. Autoclaver les tubes préparés avant la collecte des tissus pendant 30 minutes à 121 ° C, en particulier si la quantification de la charge bactérienne. Ajouter 500 ul de PBS stérile à chaque tube. Peser chaque tube après autoclavage et record pour référence future pour calculer le poids des tissus récupérés.
3. Sacrifiez la souris en utilisant des méthodes institutionnelles approuvées comme le CO ₂ asphyxie et dislocation cervicale. Vaporiser vers le bas de l'abdomen ventral avec 70% EtOH. Avec des ciseaux stériles, ouvrir la cavité abdomino-pelvien, soulever la peau du dos et les muscles abdominaux, et de déplacer les intestins afin que l'appareil reproducteur est exposé.
4. Stériliser les ciseaux avec 70% EtOH, essuyez si nécessaire, et couper les deux cornes utérines à mi-longueur entre le corps de l'utérus et des ovaires. Avec des ciseaux et des pinces, la graisse viscérale séparée, membranes, et la vessie loin de l'appareil reproducteur, le déplacement caudale.
5. Stériliser ciseaux comme décrit à l'étape 5.4. Transversalement couper le vagin aussi près de la vulve que possible de séparer l'appareil reproducteur du corps. Soulevez et retirez l'appareil reproducteur intact et le placer dans une boîte de Pétri stérile.
6. En utilisant une nouvelle lame de rasoir, séparer l'utérus du col dans une coupe transversale. Stériliser la lame de rasoir avec 70%EtOH, puis séparer le col du vagin dans une coupe transversale. NOTE: Il y aura une quantité minimale de tissu utérin encore attaché au col. Il y aura une quantité minimale de tissu vaginal toujours attaché au col.
7. En utilisant des pinces stériles, transférer chacun des tissus dans leurs tubes de 2 ml respectifs contenant du PBS et homogénéisant perles. Nettoyer la pince avec 70% EtOH entre la manipulation de chaque tissu.
8. Peser chaque tube de bouchon à vis de 2 ml et soustraire le poids original du tube pour déterminer le poids de tissu. poids de tissus varient généralement entre 20-100 mg. sceller hermétiquement les tubes à bouchon à vis et à homogénéiser les tissus pendant 1 min à vitesse maximale dans un homogénéisateur de tissus.
9. Pour quantifier la charge bactérienne, diluer en série 25 pi d'homogénat de tissu et des dilutions de plaque 1:10 à 1: 10.000 sur des plaques d'agar de milieu différentiel. Incuber les plaques comme décrit à l'étape 3.3. Pour stocker des échantillons pour cytokine quantification, geler homogénats de tissus à -20 ° C.

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Résultats

Au cours du développement de ce modèle, plusieurs observations ont été faites au sujet des facteurs qui influent sur la durée de GBS colonisation vaginale. Pour déterminer le stade comment estrous les impacts d'inoculation GBS persistance bactérienne, les souris ont été organisées le jour de l'inoculation par le liquide de lavage vaginal. La figure 1 illustre les quatre étapes du cycle oestral de la souris, tel que déterminé par voie humide monter va...

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Discussion

Pour favoriser l'avancement de la compréhension des interactions GBS avec le l'hôte et d'autres microbes dans le contexte de l'hôte, un modèle animal est nécessaire. Ce travail décrit les aspects techniques de l'établissement GBS colonisation vaginale chez la souris. Ce protocole permet d'obtenir> 90% colonisation de souris sans l'utilisation d'anesthésiques pour inoculer les bactéries ou pour prélever des échantillons d'écouvillons, immuno-suppresseurs pour permettre l...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μl gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 ml syringes	BD	309604
1 ml syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Corning	21-031-CV