Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Resumo

O objectivo deste protocolo é imitar grupo humano B Streptococcus (GBS) colonização vaginal num modelo murino. Este método pode ser utilizado para investigar as respostas imunes do hospedeiro e factores que contribuem para GBS bacterianas persistência vaginal, bem como para testar estratégias terapêuticas.

Resumo

Streptococcus agalactiae (Streptococcus do grupo B, o GBS), é uma bactéria Gram-positiva, colonizador assintomática do tracto gastrointestinal humano e tracto vaginal de 10 - 30% dos adultos. Em indivíduos imunocomprometidos, incluindo recém-nascidos, mulheres grávidas e idosos, GBS pode mudar para um patógeno invasiva causando septicemia, artrite, pneumonia e meningite. Porque GBS é um patógeno bacteriano líder de recém-nascidos, a profilaxia atual é composto por triagem de gestação tarde para GBS colonização vaginal e subsequente tratamento com antibióticos periparto das mães GBS-positivos. fardo pesado vaginal GBS é um fator de risco para a doença neonatal e colonização. Infelizmente, pouco se sabe sobre o anfitrião e os fatores bacterianos que promovem ou permitem GBS colonização vaginal. Este protocolo descreve uma técnica para o estabelecimento de colonização vaginal GBS persistente utilizando um β-estradiol único pré-tratamento e de colheitas diárias para determinar loa bacterianad. Acrescenta detalhes métodos para administrar terapias ou reagentes de interesse adicionais e recolher fluido de lavagem vaginal e nos tecidos do trato reprodutivo. Este modelo do rato irá aumentar a compreensão da interação GBS-host dentro do ambiente vaginal, o que levará a potenciais alvos terapêuticos para controlar a colonização vaginal materna durante a gravidez e para prevenir a transmissão ao recém-nascido vulnerável. Também será de interesse para aumentar a nossa compreensão de interações bacterianas-hospedeiro geral no trato vaginal feminino.

Introdução

Streptococcus agalactiae, Streptococcus do grupo B (GBS), é uma bactéria encapsulada, Gram-positiva, que é frequentemente isolada a partir do intestino e do trato genito-urinário de adultos saudáveis. Na década de 1970, GBS emergiu como o principal agente da mortalidade neonatal infecciosa, com mais de 7.000 casos de doença neonatal por ano ^1. De início precoce da doença GBS (EOD) ocorre nas primeiras horas ou dias de vida, surge como pneumonia ou insuficiência respiratória, e muitas vezes se desenvolve em sepse, enquanto a doença de início tardio (LOD) segue-se depois de vários meses e se apresenta com bacteremia, que frequentemente avança para a meningite ^2. A partir de 2002, os Centros de Controle e Prevenção de Doenças recomenda a triagem universal para GBS colonização vaginal na gestação tardia e profilaxia antibiótica intraparto (IAP) para mães GBS-positivos ^1. Apesar da redução da doença de início precoce de aproximadamente 1.000 casos nos Estados Unidos, anualmente devido a IAP,GBS continua a ser a principal causa de sepse neonatal de início precoce e ocorrência de início tardio permanece inalterado ^1. Se no útero, durante o parto, ou até mesmo em casos de início tardio, a exposição neonatal a GBS requer sobrevivência, transversal através de um número de ambientes de host e barreiras, a evasão imune, e, no caso de meningite, travessia do Sangue altamente regulado barreira do cérebro ^2. A montante destas interacções virulentas no recém-nascido é a colonização inicial do tracto vaginal materna. Materna GBS taxas de colonização vaginal variam de 8-18% em países desenvolvidos e em desenvolvimento, com uma taxa média estimada de 12,7% ^3,4. GBS colonização do tracto vaginal durante a gravidez pode ser constante, intermitente, ou de natureza transitória entre as mulheres individuais ^5. Curiosamente, a idade materna> 36 anos está associada à colonização persistente ^6. Inúmeros fatores de risco biológicos e sócio-econômicas para GBS colonização vaginaltem sido identificado. Os factores biológicos incluem a colonização gastrointestinal GBS e ausência de Lactobacillus no intestino. No entanto, a etnia, a obesidade, higiene e atividade sexual também têm sido associados com GBS vaginal ^7.

Embora conhecido por causar infecções neonatais, GBS também causa uma variedade de infecções maternas ambos periparto e pós-parto. GBS é aumentada em mulheres que apresentam vaginite ⁸ e, em alguns casos, pode mesmo ser a entidade de doença ^9. Além disso, o GBS de ascensão do trato reprodutivo durante a gravidez podem resultar em infecção intra-amniótica ou corioamniotite ^10. Além disso, em até 3,5% de gravidezes, GBS difunde para a bexiga urinária para causar uma infecção do tracto urinário ou bacteriúria assintomática ^11. bacteriúria GBS durante a gravidez está associado a um aumento do risco de febre intraparto, corioamnionite, parto prematuro, e premature ruptura de membranas ^12. Tomados em conjunto, a presença de GBS dentro do trato vaginal está associado a infecções de vários tecidos do hospedeiro, e a capacidade de eliminar GBS deste nicho é imperativo para a saúde materna e neonatal.

Até recentemente, a maioria do trabalho examinar interacções de GBS com o tracto genital do foi limitada a modelos celulares in vitro ^13-15. Estas experiências in vitro revelaram factores bacterianos que são importantes para a adesão, incluindo as proteínas de superfície, tais pili e uma rica em serina repetições ^17,18, bem como sistemas reguladores de dois componentes ^15,19 e a resposta de transcrição global do epitélio vaginal para GBS ^19. No entanto, para elucidar totalmente as interacções hospedeiro-micróbio no tracto vaginal, um modelo animal robusta é necessário. Os primeiros trabalhos demonstraram que o GBS podem ser recuperados a partir do tracto vaginal de ratinhos inoculados ratos e ^{20,21 22 em ambas as condições grávidas e não grávidas. Em 2005, a curto prazo GBS colonização vaginal foi modelada em murganhos para examinar a eficácia de uma enzima lítica de fagos para tratar GBS vaginal durante um período de 24 h 23. Vários anos mais tarde, um GBS mouse modelo de colonização vaginal longo prazo foi desenvolvido para estudar hospedeiras e bacterianas fatores que regem GBS persistência. Este modelo identificou vários fatores que contribuem para GBS colonização, incluindo apêndices superficiais 17,18 e GBS sistemas de dois componentes 19,24. Este modelo contribui para a identificação de mecanismos de resposta do hospedeiro 19,25 e foi usado para testar várias estratégias terapêuticas, incluindo péptidos imunomoduladores 26 e 27 probióticos. Este protocolo dá a orientação necessária para inocular GBS para o trato vaginal mouse e para controlar posteriormente colonização e coletar amostras para análises posteriores.}

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Protocolo

Todo o trabalho animal foi aprovada pelo Escritório de Laboratório Animal Care na Universidade Estadual de San Diego, e executada sob normas veterinárias aceites. ratinhos fêmeas, com idade de 8 - 16 semanas, foram utilizados para o desenvolvimento deste método.

1. Preparação e injecção intraperitoneal de β-estradiol

1. Meça β-estradiol (0,5 mg / rato) em pesar papel enquanto usava equipamento de proteção individual (EPI). CUIDADO: β-estradiol pode ser absorvida através da pele e das mucosas.
2. Transferir β-estradiol para um tubo cónico de 15 mL e agitar com vortex até todos os nódulos são removidos e o β-estradiol é um pó fino. Elaborar óleo de gergelim (100 ul / mouse) para uma seringa de 10 ml. óleo de sésamo Seringa-filtro para dentro do tubo cónico de 15 ml que contém a β-estradiol utilizando um filtro de 0,45 mícrons. Vortex do tubo cónico de 15 ml até ao β-estradiol é uma suspensão homogénea do óleo de sésamo.
3. Elaborar os beta-estradiol suspensão para uma nova seringa de 10 ml. Com um 18 G, 1-in. agulha, alíquota de 100 ul da suspensão para seringas de tuberculina de 1 ml. Prepare uma seringa para cada rato. Coloque uma nova, estéril 26 G, ½-in. agulha em cada seringa de tuberculina.
4. Administrar 0,5 mg do β-estradiol, suspendido em 100 ul de óleo de sésamo (5 mg / ml) a cada rato 24 horas antes da inoculação bacteriana. Injectar cada rato no interior da cavidade peritoneal, nos quadrantes abdominais inferiores, apenas para a direita ou para a esquerda da linha média, como previamente descrito ^28.
   NOTA: Sem limpeza ou recorte do local de injecção é necessário.

2. Vaginal inoculação com GBS

1. Um dia antes da inoculação, crescer uma cultura líquida durante a noite de 5 ml de uma estirpe de GBS de interesse, tais como A909 (serótipo Ia), em caldo Todd Hewitt (THB) a 37 ° C.
2. Subcultura a cultura durante a noite de GBS a um volume de 1:10 em THB fresco e incuba-se a 37 ° C. fazer crescer abactérias a fase semi-log _(DO600 = 0,4-0,5). NOTA: Isto irá normalmente levam 2-3 horas, dependendo da estirpe de GBS.
3. Transferir a subcultura de uma solução estéril de 15 ml e pelotas de bactérias do tubo cónico a 3000 × g durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento bacteriano em 200 ul de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
4. Usando o sedimento ressuspenso, trazer 3 - 5 ml de PBS (1 ml por 10 murganhos) para exactamente OD ₆₀₀ = 0,4 em um novo tubo de cultura de 5 mL. Esta será uma concentração de ~ 1 x 10 ⁸ unidades formadoras de colónias (CFU) / ml. Transferir para um novo tubo cónico de 15 mL e re-sedimentar as bactérias a 3000 × g durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
5. Ressuspender o pellet em PBS em 1/10 do volume original. Por exemplo, se 3 ml de OD ₆₀₀ = 0,4 foi sedimentado, em seguida ressuspender-lo em 300 ul de PBS. NOTA: Este é o final da suspensão bacteriana (~ 1 x 10 ⁹ CFU / ml) usadas para inoculação dos animais.
6. Reserva 50 ul desta suspensão por diluição em série e plaqueamento em agar THB para determinar o inoculo exacta.
7. Inocular cada murganho com 10 uL da suspensão bacteriana final, de modo que 1 x 10 ⁷ UFC é administrado a cada murganho.
   1. Para inocular, conter o mouse manualmente, assegurando a pele solta na nuca do pescoço entre o polegar do condutor eo dedo indicador e, em seguida, imobilizando a cauda, como descrito anteriormente ^28.
   2. Elaborar 10 ul do GBS preparados no passo 2.6 em um gel de 200 ul ponta de carga pipeta. Insira a ponta 5 a 10 mm no lúmen vaginal e dispensar a 10 ml de inóculo.
      NOTA: O gel pontas de carregamento são preferidos em relação dicas de 200 ul padrão para minimizar o risco de trauma ou lesão de órgãos, particularmente em ratos mais jovens ou mais pequenas.
   3. Imediatamente após a inoculação, solte a nuca do pescoço e elevar a extremidade traseira do mouse, levantando o rato pela cauda e walking as patas dianteiras sobre uma superfície dura para ~ 1 min.
   4. inspecionar visualmente a abertura vaginal para qualquer refluxo de inóculo. Se o refluxo é observada, uma ponta de pipeta, pode ser usado para manipular ou ampliar a abertura vaginal, facilitando a absorção de o refluxo para dentro do lúmen. Além disso, o refluxo pode ser aspirado através de uma pipeta e re-inoculado.
      NOTA: Se a administração de agentes tópicos, organismos probióticos, ou proteínas de interesse, um volume de até 20 ul num tampão fisiológico pode ser dado no tracto vaginal.

3. raspagem da Lumen Vaginal para quantificar GBS Carga

1. Preparar um tubo de micro-centrifugação de 1,5 ml por rato através da adição de 100 ul de PBS. Pouco antes de esfregar, pré-molhar o algodão embebido em PBS.
2. Restringir o rato, tal como descrito no passo 2.7.1 e inserir a haste de 10 mm para o lúmen vaginal. Rodar suavemente o cotonete de 4 vezes no sentido horário e 4 vezes sentido anti-horário, aplicando uma leve pressão para a parede vaginal.
3. Transferir o cotonete para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com 100 ul de PBS. Antes do plaqueamento, vortex do tubo de microcentrífuga durante 15 sec ~ para libertar as bactérias do chumaço. Serialmente diluídas em PBS a cada amostra e a placa 20 ul de diluições de 1:10 até 1: 10000 em placas de agar de meio de diferenciais preparada de acordo com as instruções do fabricante. Incubar as placas a 37 ° C durante 24 h. colónias GBS irá aparecer tanto rosa brilhante ou malva em cores. Outros flora endógena será inibida, ou aparecerão como colónias azuis, brancas ou cinzentas.

4. Coleta de fluido vaginal Lavage

1. Contenha o rato como descrito no passo 2.7.1. Utilizando uma ponta de pipeta de carregamento de gel de 200 ul, pipeta 20 ul de PBS para o lúmen vaginal. Suavemente pipeta toda a o volume e para baixo 4 vezes dentro do lúmen, e, em seguida, retirar o volume inteiro na mesma ponta de pipeta. NOTA: Se o fluido de lavagem é grosso com mucosas, uma dica padrão pipeta de 200 mLpode ser utilizada para recolher o fluido de lavagem final.
2. Se salvar lavado para análise de citocinas ou CFU quantificação, dispensam em um tubo de microcentrífuga de 0,7 ml. Se a determinação do estádio do estro, dispensar, pelo menos, 5 mL de fluido de lavagem para uma lâmina de vidro e observar as células sob uma ampliação de 100X de um microscópio de luz. NOTA: Para obter exemplos de fases estral, veja a Figura 1.

5. dissecção dos tecidos e homogeneização

1. Para cada rato, preparar três de 2 ml tubos com tampa de rosca (uma para cada tecido: vagina, colo e útero). Encher cada tubo com amplas (0,4-0,5 g) de 1,0 mm os grânulos de zircónia para cobrir o fundo de forma cónica do tubo.
2. Autoclave os tubos preparados antes da recolha de tecidos durante 30 min a 121 ° C, especialmente se quantificar a carga bacteriana. Adicionar 500 ul de PBS estéril a cada tubo. Pesar cada tubo após a autoclavagem e recorde para futura referência para calcular o peso do tecido recuperado.
3. Sacrifício do mouse usando métodos institucionais aprovados, como o CO ₂ asfixia e luxação cervical. Spray para baixo do abdômen ventral com etanol 70%. Com uma tesoura esterilizada, abrir a cavidade abdominopelvic, levantar a pele para trás e músculos abdominais, e deslocar o intestino para que o trato reprodutivo está exposta.
4. Esterilizar a tesoura com etanol 70%, limpe se necessário, e cortar ambos os cornos uterinos meados de comprimento entre o corpo do útero e ovários. Usando tesouras e pinças, gordura visceral separada, membranas e da bexiga urinária longe do trato reprodutivo, que se deslocam no sentido caudal.
5. Esterilizar tesoura conforme descrito no passo 5.4. Em corte transversal ao da vagina o mais próximo possível da vulva possível separar o tracto reprodutivo do corpo. Levantar e remover o aparelho reprodutor intacto e colocá-lo em uma placa de Petri estéril.
6. Usando uma lâmina de barbear nova, separar o útero do colo do útero em um corte transversal. Esterilizar a lâmina de barbear com 70%EtOH, e em seguida, separar o colo da vagina em um corte transversal. NOTA: Não haverá uma quantidade mínima de tecido uterino ainda ligado ao colo do útero. Haverá uma quantidade mínima de tecido vaginal ainda ligado ao colo do útero.
7. Utilizando fórceps estéreis, transferir cada um dos tecidos em seus respectivos tubos de 2 ml de PBS contendo grânulos e homogeneização. Limpar a pinça com etanol 70% entre manusear cada tecido.
8. Pesar cada tubo 2 ml com tampa de rosca e subtrair o peso original do tubo para determinar o peso do tecido. pesos de tecido, tipicamente variam entre 20-100 mg. Firmemente selar os tubos de tampa de rosca e homogeneizar os tecidos durante 1 minuto à velocidade máxima num homogeneizador de tecidos.
9. Para quantificar a carga bacteriana, dilui-se em série 25 ul de homogeneizado de tecido e diluições 1:10 de placa por meio de 1: 10000 em placas de agar com meio diferenciais. Incubam-se as placas tal como descrito no passo 3.3. Para armazenar amostras para quantificação de citocinas, congelar homogeneizados de tecidos na -20 ° C.

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Resultados

Durante o desenvolvimento deste modelo, várias observações foram feitas em relação aos fatores que afetam a duração do GBS colonização vaginal. Para determinar o estágio como estral em impactos inoculação GBS persistência bacteriana, os ratos foram encenadas no dia da inoculação através de lavado vaginal. A Figura 1 ilustra as quatro fases do ciclo estral de rato, como determinado pela húmida de montagem em fluido de lavagem vaginal, um método bem estab...

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Discussão

Para promover o avanço da compreensão das interacções de GBS com a ambos o hospedeiro e outros micróbios no contexto do hospedeiro, é necessário um modelo animal. Este trabalho descreve os aspectos técnicos da criação de GBS colonização vaginal em ratos. Este protocolo realiza> 90% de colonização de murganhos sem a utilização de anestésicos para inocular bactérias ou para recolher amostras de esfregaço, imuno-supressores para permitir a colonização, pré-lavagem vaginal, ou aditivos para engrossa...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μl gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 ml syringes	BD	309604
1 ml syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Corning	21-031-CV