באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Summary

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Abstract

מחקרים של חלבונים בממברנה נפרדים במבחנה מסובך לעתים קרובות על ידי הנוכחות של תחום הטרנסממברני הידרופובי. שמסבך עוד יותר את המחקרים הללו, reincorporation של חלבונים בממברנה דטרגנט-solubilized לתוך ליפוזומים הוא תהליך סטוכסטיים שבו טופולוגיה חלבון אי אפשר לאכוף. מאמר זה מציע שיטה חלופית לטכניקות מאתגרות אלו אשר מנצלות פיגום מבוסס liposome. מסיסות חלבון מוגברת על ידי מחיקה של תחום הטרנסממברני, וחומצות אמינו אלה מוחלפים עם מחצית קשירה, כגון תג שלו. לקשור זה אינטראקציה עם קבוצת עיגון (Ni ^{2 +} מתואם על ידי חומצה nitrilotriacetic (נ.ת.ע (Ni ^{2 +))} עבור חלבונים שלו מתוייגים), אשר כופה טופולוגיה חלבון אחידה על פני השטח של liposome. דוגמה מוצגת שבה האינטראקציה בין הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) עם חלבון ממברנלי אינטגרלי, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), היה investigated בשיטה ליפוזום פיגום זה. בעבודה זו, אנו הדגמנו את היכולת של MFF לגייס מסיסי Drp1 ביעילות אל פני השטח של ליפוזומים, אשר עורר פעילות GTPase שלה. יתר על כן, Drp1 הצליח tubulate תבנית השומנים המעוטר MFF בנוכחות שומנים ספציפיים. דוגמא זו ממחישה את האפקטיביות של ליפוזומים פיגום באמצעות מבחנים מבניים ותפקודיים ומדגישה את תפקיד MFF בהסדרת פעילות Drp1.

Introduction

לימוד אינטראקציות קרום הפרוקסימלי חלבונים הוא מאמץ מאתגר בשל קושי משחזר את הסביבה הטבעית של חלבונים בממברנה נפרדים המעורבים ^1. זאת בשל הצורך של solubilization דטרגנט ואת הכיוון הלא סדירה של חלבונים proteoliposomes. על מנת למנוע בעיות אלה, יש לנו עובדים אסטרטגיה לפיה תחומים מסיסים של חלבונים בממברנה נפרדים מבוטאות חלבוני היתוך התג שלו, ושברי מסיסים אלה מעוגנים ליפוזומים פיגום באמצעות אינטראקציות עם נת"ע (Ni ^{2 +)} headgroups על השומנים משטח. באמצעות פיגומים אלה, אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי שומנים יכולות להיחקר על פני טווח של קומפוזיציות שומנים וחלבונים.

יש לנו ליישם ביעילות בשיטה זו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבונים הקריטיים השולטים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה ולבחון אינטראקציות שומנים לווסת pr זהocess ^2. במהלך ביקוע המיטוכונדריה, חלבון שיפוץ קרום משומר, שנקרא הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) ^3, מגויסת אל פני השטח של הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי (OMM) בתגובה לאותות הסלולר המווסתים הומאוסטזיס אנרגיה, איתות אפופטוטיים, וכמה אחרים תהליכי המיטוכונדריה נפרדים. GTPase גדול, cytosolic זה גייס אל פני השטח של המיטוכונדריה דרך אינטראקציות עם חלבונים OMM אינטגרלי ^{4 - 8.} תפקידו של חלבון אחד כזה, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), כבר קשה להבהיר עקב אינטראקציה חלשה לכאורה עם Drp1 במבחנה. אף על פי כן, מחקרים גנטיים הראו בבירור כי MFF חיונית ^7,8 ביקוע המיטוכונדריה מוצלח. השיטה המתוארת בכתב היד הזה הייתה מסוגלת להתגבר על חסרונות קודמים על ידי החדרת אינטראקציות שומנים סימולטני המקדמות אינטראקציות Drp1-MFF. בסך הכל, revea assay הרומן הזההובל כוחות יסוד המנחים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה וספק שלב חדש ללימודי מבניים ותפקודיים מתמשכים של מכונה מולקולרית חיונית זה.

נכון להיום, בחינת יחסי הגומלין בין Drp1 ו MFF כבר מסובך בגלל הגמישות המובנית של MFF ^9, ההטרוגניות של Drp1 פולימרים ^2,10, והקושי מטהרים reconstituting באורך מלא MFF עם תחום הטרנסממברני שלם ^11. טיפלנו אתגרים אלה באמצעות נ.ת.ע (Ni ^{2 +)} ליפוזומים פיגום כדי לשקם MFF מתויג שלו חסר תחום הטרנסממברני שלה (MffΔTM-שלו _6). אסטרטגיה זו הייתה יתרון משום MffΔTM היה מסיס מאוד כאשר ביטוי יתר ב E. coli, וחלבון מבודד זה היה מחדש בקלות על ליפוזומים הפיגום. כאשר קשור לתבניות השומנים האלה, MFF להניח אוריינטציה זהה, פונים כלפי חוץ על פני הממברנה.בנוסף יתרונות אלה, שומנים המיטוכונדריה, כגון cardiolipin, נוספו לייצב מתקפלים וההתאגדות MFF עם קרום ^11. Cardiolipin גם אינטראקציה עם התחום המשתנה של Drp1 ^2,12 אשר עשוי לייצב באזור המופרע הזה ולהקל הרכבה של מכונות הביקוע.

שיטה חזקה זו ישימה נרחב למחקרים עתידיים המבקשים להעריך אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי הממברנה. באמצעות שימוש אינטראקציות קשירה / זיקה נוספות, התחכום של מחקרי כינון מחדש קרום אלה ניתן לשפר כדי לחקות מורכבות נוספת נמצאת על פני השטח של ממברנות בתוך תאים. במקביל, קומפוזיציות שומנים ניתן לשנות באופן מדויק יותר לחקות את סביבות יליד מתחמי macromolecular אלה. לסיכום, שיטה זו מספקת אמצעי לבחינת התרומה היחסית של חלבונים ושומנים בעיצוב מורפולוגיות הממברנה במהלך proc הסלולר הקריטיesses.

Protocol

1. הכנת Liposome פיגום

הערה: באופן אידיאלי, ניסויים ראשוניים צריכות להשתמש פיגום פשוט חסר ייחוד יחסית (מורכב dOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine או PC) DGS-נ.ת.ע (Ni ^{2 +)} (1,2-dioleoyl - SN -glycero-3 - [(N - (5-אמינו-1-carboxypentyl) חומצת iminodiacetic) succinyl]. (מלח ניקל)) בניין הנחה של ניסויים אלה, פריצת שומנים, גמישות, ועקמומיות ניתן הציג כגורמים בודדים עם הפוטנציאל לשנות אינטראקציות קרום הפרוקסימלי. ניתן להשיג שינויים אלה על ידי הוספת כמויות מוגדרות של מרכיבי שומנים ספציפיים, כולל phosphatidylserine או cardiolipin (CL), phosphatidylethanolamine (סמים או PE), או galactosyl ceramide (β).

1. מערבבי שומנים מומסים כלורופורם במבחנת זכוכית נקיה. להתאדות ממס עם גז חנקן יבש תוך כדי סיבוב הצינור כדי ליצור סרט שומנים דק. הסר ממס שיורים עם centrifugaמאייד l עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: ניסוחים liposome שונים משמשים הפרוטוקולים המתואר להלן: ליפוזומים פיגום (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni ^{2 +)} / 96.7 mol% dOPC), ליפוזומים פיגום עם cardiolipin (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni ²⁺⁾ / 10 mol% cardiolipin / 86.7 mol% dOPC), ליפוזומים פיגום גמישה עם cardiolipin (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni ^{2 +)} / 10 mol% cardiolipin / 35 DOPE mol% / 51.7 mol% dOPC), ו הפיגום מועשר ליפוזומים (10 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni ^{2 +)} / 15 mol% cardiolipin / 35 mol% DOPE / 40 mol% dOPC).
2. להוסיף הצפת (25 HEPES מ"מ (4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic), 150 מ"מ KCl, pH מותאם 7.5 עם KOH) שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס כך ריכוז השומנים הסופי הוא 1 - 2 מ"מ. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם vortexing מזדמנים resuspend את תערובת שומנים לחלוטין (איור 1 א).
3. מעבירים צינור מבחן פלסטיק, במקום צינור בחנקן נוזלי עד קפוא לחלוטין (roughly 30 s), ומניחים באמבט מים C ° 37 עד מופשר לחלוטין (בערך 1 - 2 דקות). חזור עבור סכום כולל של 4 מחזורים להקפיא להפשיר (איור 1b).
4. הכין מכבש שומנים על ידי השריית 4 תומך מסנן ומסנן פוליקרבונט במאגר והרכבת המכבש לפי הוראות יצרן. Extrude פתרון השומנים דרך המסנן 21 פעמים. עדין, לחץ מתמיד על מנת להבטיח חלוקת גודל הומוגנית (איור 1 ג ').
   הערה: עבור כל הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה, 1.0 מיקרומטר פוליקרבונט הסינון שימש שחול. האינטראקציה Drp1 עם שומנים anionic ניתן לצפות עם מגוון רחב של קטרים liposome הנעים בין 50 ננומטר עד 400 ננומטר ¹² ומעלה ^13. לפיכך, גודל המסנן של 1 מיקרומטר נבחר להיות אידיאלי הוא פעילות GTPase ועבור במיקרוסקופ אלקטרונים. אם קטרי liposome אחרים הם רצויים, הכנת שלפוחית unilamellar הענקית ^14,15 (GUVs) או unilamell הקטןar שלפוחית ¹⁶ (רכבי שטח) ניתן להשתמש. ניתן להשתמש פיזור אור דינאמי להעריך ההטרוגניות גודל liposome ^13.
5. אחסן ליפוזומים הנמתח על 4 מעלות צלזיוס וזורקים לאחר 3 - ד 5.

2. שימוש הפיגום ליפוזומים עבור ניתוח חלבון מחייב

1. לדוגמא הכנה
   1. דגירה MffΔTM שלו מתויג (5 מיקרומטר הסופי) עם ליפוזומים פיגום (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni ^{2 +);} 50 מיקרומטר הסופי) לפחות 15 דקות ב RT הצפת + BME (25 HEPES מ"מ, 150 מ"מ KCl, 10 מ"מ β-mercaptoethanol (BME), pH מותאם 7.5 עם KOH). עבור פקד MFF ללא, דגירה ליפוזומים עם חלבון לשליטתו מתויג (כגון GFP) להיקשר ומגן החשוף נ.ת.ע (Ni ^{2 +).}
      הערה: MffΔTM התבטא וטיהר כמתואר במחקר קודם ^2. GFP היה מטוהר באופן דומה, אך צעד חילוף יונים הושמט. BME נדרשה experimen אלהts כי Drp1 רגיש חמצון, אשר יכול לשנות תכונות הפעילות והרכבה שלו.
   2. להוסיף Drp1 (2 מיקרומטר הסופי) ו דגירה של 1 ש 'ב RT.
      הערה: Drp1 התבטא וטיהר כמתואר במחקר קודם ^2. לאחר הדגרה עם Drp1, השפעת נוקלאוטיד מחייב על עיוות הממברנה יכול להיחקר על ידי דוגרים שעה נוספת אחת עם 2 מ"מ MgCl ₂ ואו 1 מ"מ GTP, 1 מ"מ GMP-PCP, או הצפת + BME.
2. ניתוח הילוכים הכתמים שליליים מיקרוסקופי אלקטרונים (EM)
   1. העברת 5 μL של המדגם כדי סדין של סרט במעבדה, ויניח רשת Rh Cu / מצופה פחמן על המדגם. דגירת דקות רשת 1 על המדגם, למחוק משם נוזל עודף על נייר סינון, ולהעביר לירידה של אצטט uranyl 2%. דגירת 1 דקות, כתם כתם עודף על נייר סינון, ומעביר תיבת רשת. חנות תחת ואקום O / N כדי להבטיח התייבשות מלאה.
   2. דגימות תמונה באמצעות microsc אלקטרוני הילוכיםאופ ב 18,500 - 30,000X הגדלה לצפות לשינויי ultrastructural ב מורפולוגיה חלבון liposome ^17.
      הערה: שינויי ultrastructural ניתן לכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, כגון ¹³ ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). קישוט החלבון ניתן למדוד בהשוואת תבניות שומנים עירום. בנוסף, בקטרים של מגזרים צינורי ניתן למדוד מהחלק החיצוני של המכלולים ^13. ניתוח מפורט יותר ניתן לבצע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני cryo- ^17. שיטה זו יכולה לשמש כדי תמונה מקורית מכלולים חלבון-שומנים ממס ללא שימוש כתמים מתכת כבדה אשר מעיל המדגם. בדרך זו, תכונות מבניות מפורטות לא ניכרו כתם שלילי, לרבות שינויים במורפולוגיה השומנים הבסיסיות, ניתן לבדוק לכמת.

3. השימוש של הפיגום ליפוזומים עבור אנזימתי Assay

הערה: Coloriassay GTPase מטרי ¹⁸ שימש למדידת שחרור פוספט באמצעות הידרוליזה GTP. מבחני GTPase חלופיים זמינים ¹⁹ והוא יכול להיות מיושם על פי הצורך.

1. דגירת MffΔTM המתויג שלו (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), או GFP (5 מיקרומטר סופי עבור כל) עם ליפוזומים פיגום (150 מיקרומטר סופיים) במשך 15 דקות ב RT הצפה + BME (נפח = 30 μL). להוסיף Drp1 (500 סופי ננומטר) דגירת דקות נוספות 15 ב RT (נפח = 80 μL).
   הערה: Fis1 היה מטוהר באופן דומה MFF ^2, אבל הצעד כרומטוגרפיה-חילוף יונים הושמט. מטרת GFP המתויג שלו היא להגן על נ.ת.ע (Ni ^{2 +)} headgroups ולמנוע אינטראקציות תשלום ספציפיות עם חלבונים אחרים. אם אין כל השפעה נצפית בהעדר GFP, אז פקד זה לא ייתכן שיידרש. חלבוני חסימה אלטרנטיביים (גודל דומה לחלבון של עניין) יכולים לשמש גם, אבל GFP מאפשר הדמיה ישירה של אינטראקציות עם scafלקפל ליפוזומים.
2. העברת צינורות אל thermocycler מוגדר 37 ° C, ליזום תגובות על ידי תוספת של GTP ו MgCl ₂ (1 מ"מ ו -2 הסופי מ"מ, בהתאמה; נפח = 120 μL).
3. בנקודות הזמן הרצוי (כלומר T = 5, 10, 20, 40, 60 דק '), להעביר 20 μL של תגובה הבארות של צלחת microtiter המכיל 5 μL של 0.5 M EDTA כדי Chelate Mg ²⁺ ולעצור את התגובה.
4. להכין סט של סטנדרטים פוספט על ידי דילול KH ₂ PO ₄ ב הצפה + BME לכייל תוצאות. קבוצה יעילה של סטנדרטים היא 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, ו -0 מיקרומטר. הוסף 20 μL של כל בארות המכילות 5 μL של 0.5 M EDTA.
5. הוספת 150 μL של מלכיט מגיב ירוק (1 מ"מ קרבינול ירוק מלכיט, 10 מ"מ אמוניום molybdate tetrahydrate ו -1 N HCl) זה טוב, ולקרוא OD ₆₅₀ 5 דקות לאחר תוספת.
   הערה: GTP הוא חומצה יציבה, ויהיה hydrolyze בנוכחות מגיבה ירוק מלכיט. ודא tהוא הזמן בין הוספת מגיב מלכיט והקריאה הוא קבוע על מנת להבטיח תוצאות לשחזור.
6. צור עקומת סטנדרט ידי התוויית OD ₆₅₀ של סטנדרטים כפונקציה של ריכוז פוספט. השתמש רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את הקשר בין OD ₆₅₀ ו ריכוז פוספט במדגם.
7. באמצעות רגרסיה ליניארית, להמיר את OD ₆₅₀ של דגימות תגובת חלבון פוספט מיקרומטר. לקבוע את שיעור דור פוספט עבור כל תערובת תגובה על ידי התוויית ריכוז פוספט כפונקציה של זמן, ולהמיר k _חתול על ידי חלוקת הריבית על ידי ריכוז Drp1 (0.5 מיקרומטר).
   הערה: רק השיעור ליניארי הראשוני אמורה לשמש כדי לקבוע את שיעור דור פוספט, ומינימום של 3 נקודות נתונים חייב לשמש. אם קצב התגובה הוא מהיר מספיק ששלושת נקודות הנתונים הראשונות הם לא ליניארי (כלומר r ² של ההתאמה ליניארית הוא פחות מ 0.9) סימןificantly קצר כמובן זמן עם נקודות זמן לפחות 3 צריך להתבצע.

תוצאות

בעוד האינטראקציה בין Drp1 ו MFF הודגמה להיות חשוב לביקוע המיטוכונדריה, אינטראקציה זו כבר קשה לשחזר במבחנה. מטרתנו הייתה לחקות את הסביבה התאית טוב יותר שבו Drp1 ו MFF אינטראקציה. לשם כך, ליפוזומים המכילים ריכוזים הגבלת נת"ע (Ni ^{2 +)} headgroups הוכנו ...

Discussion

פרוטוקול זה מציע שיטה לחקירת אינטראקציות בין חלבונים מעורבים חלבונים בממברנה נפרד. על ידי ניצול פיגום ליפוזום מודולרי, חוקרים מסוגלים להעריך את הפעילות של חלבונים אחד או יותר בסביבת שומנים הפרוקסימלי. מחקרים קודמים הוכיחו בשיטה דומה עבור אנזימי קולטן של קרום הפלזמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725
DGS-NTA(Ni2+)	Avanti Polar Lipids	790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL)	Avanti Polar Lipids	840012
Chloroform	Acros Organics	268320010
Liposome Extruder	Avanti Polar Lipids	610023
Cu/Rh Negative Stain Grids	Ted Pella	79712
Microfuge Tube	Beckman	357448
GTP	Jena Biosciences	NU-1012
GMP-PCP	Sigma Aldrich	M3509
Microtiter Plate strips	Thermo Scientific	469949
EDTA	Acros Organics	40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye	Expedeon	ISB1L
HEPES	Fisher Scientific	BP310
BME	Sigma Aldrich	M6250
KCl	Fisher Scientific	P330
KOH	Fisher Scientific	P250
Magnesium Chloride	Acros Organics	223211000
4 - 20% SDS-PAGE Gel	Bio Rad	456-1096
4x Laemmli Loading Dye	Bio Rad	161-0747
HCL	Fisher Scientific	A144S
Malachite Green Carbinol	Sigma Aldrich	229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma Aldrich	A7302
Laboratory Film	Parafilm	PM-996
Uranyl Acetate	Polysciences	21447
Tecnai T12 100 keV Microscope	FEI
Optima MAX	Beckman
TLA-55 Rotor	Beckman
Refrigerated CentriVap Concentrator	Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf
VersaMax Microplate reader	Molecular Devices