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要約

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

要約

インビトロでの内在性膜タンパク質の研究は、しばしば、疎水性膜貫通ドメインの存在によって複雑になります。さらに、これらの研究を複雑に、リポソームへの界面活性剤で可溶化膜タンパク質の再取り込みは、タンパク質のトポロジーが強制することは不可能である確率過程です。本稿では、リポソームベースの足場を利用し、これらの困難な技術に代わる方法を提供しています。タンパク質の溶解度は、膜貫通ドメインの欠失によって増強され、そしてこれらのアミノ酸は、Hisタグのように、つなぎ部分で置換されています。このテザーはアンカー基ニッケル（Ni 2+ Hisタグタンパク質についてニトリロ三酢酸（NTAニッケル（Ni 2+））によって調整）、リポソームの表面に均一なタンパク質のトポロジーを強制すると相互作用します。内在性膜タンパク質、ミトコンドリア分裂因子（MFF）とダイナミン関連タンパク質1（DRP1）の間の相互作用は、inveだった例が提示されますこの足場のリポソーム法を用いstigated。本研究では、効率的にそのGTPase活性を刺激したリポソームの表面に可溶性DRP1を募集するMFFの能力を実証しています。また、DRP1は、特定の脂質の存在下でMFF装飾脂質テンプレートをチューブ状にすることができました。この例では、構造的および機能的アッセイを用いて足場リポソームの有効性を実証し、DRP1活性の調節におけるMFFの役割を強調しています。

概要

膜近位のタンパク質-タンパク質相互作用を研究することにより、1関わる内在性膜タンパク質のネイティブ環境を反復するのが困難に挑戦し努力です。これは、界面活性剤可溶化およびプロテオリポソーム中のタンパク質の矛盾した姿勢の必要性に起因しています。これらの問題を回避するために、我々は、内在性膜タンパク質の可溶性ドメインは、Hisタグ融合タンパク質として発現させる戦略を採用しており、これらの可溶性断片は、脂質でNTAニッケル（Ni 2+）頭部基との相互作用を介して足場リポソームに固定されています表面。これらの足場を使用して、脂質近位タンパク質相互作用は、脂質およびタンパク質組成の範囲にわたって調べることができます。

我々は、ミトコンドリア分裂複合体のアセンブリを管理する重要なタンパク質 - タンパク質相互作用を調査し、このPRを調節する脂質との相互作用を調べるために、この方法を有効に適用していますocess 2。ミトコンドリア分裂の間、ダイナミン関連タンパク質1（DRP1）3と呼ばれる保存された膜のリモデリングタンパク質は、エネルギー恒常性、アポトーシスシグナル伝達、およびその他のいくつかを調節する細胞シグナルに応答してミトコンドリア外膜（OMM）の表面に補充され一体的なミトコンドリアのプロセス。 8 -この大規模な、細胞質ゾルのGTPアーゼは、一体のOMMタンパク質4との相互作用を介してミトコンドリアの表面に補充されます。そのようなタンパク質の役割、ミトコンドリア分裂因子（MFF）は、原因in vitroで DRP1と明らか弱い相互作用に解明することは困難でした。それにもかかわらず、遺伝学的研究は、MFFが成功したミトコンドリア分裂7,8に必須であることを実証しました。本稿に記載される方法は、DRP1、MFFの相互作用を促進し、同時に脂質相互作用を導入することによって、以前の欠点を克服することができました。全体的に、この新規アッセイreveaミトコンドリア分裂複合体の構築を導く基本的な相互作用を導き、この本質的な分子機械の継続的な構造的および機能的研究のための新たなステージを提供します。

現在までに、DRP1とMFFの間の相互作用の検討はMFF 9、DRP1ポリマー2,10、および精製することが困難と無傷の膜貫通ドメイン11と、全長MFFを再構成するの異質性の固有の柔軟性によって複雑にされています。私たちは、その膜貫通ドメイン（MffΔTM-彼の6）を欠いているHisタグMFFを再構成するNTA（ニッケル2+）足場リポソームを用いて、これらの課題に対処しました。 Eにおいて過剰発現された場合MffΔTMは非常に可溶であったため、この戦略が有利でした。大腸菌 、この単離されたタンパク質は、簡単に足場リポソームに再構成しました。これらの脂質のテンプレートに繋留すると、MFFは、膜の表面上の同一の、外向きの方向性を仮定しました。これらの利点に加えて、カルジオリピンのようなミトコンドリアの脂質は、膜11とMFFの折り畳みおよび会合を安定化させるために添加しました。カルジオリピンはまた、この無秩序地域を安定させ、核分裂機械の組み立てを容易にすることができるDRP1 2,12の可変ドメインと相互作用します。

このロバストな方法は、膜近位タンパク質相互作用を評価するために求める将来の研究のために広く適用可能です。追加のテザリング/親和性相互作用を使用することにより、これらの膜の再構成の研究の高度化は、細胞内の膜の表面で見出される付加的な複雑性を模倣するように拡張することができます。これと同時に、脂質組成物は、より正確に、これらの巨大分子複合体のネイティブ環境を模倣するように改変することができます。要約すると、この方法は、重要な細胞PROC中に膜形態を形成する上でのタンパク質及び脂質の相対的な寄与を検討するための手段を提供しますesses。

プロトコル

1.足場リポソームの調製

注：理想的には、最初の実験は、比較的シンプルで特徴足場を使用する必要があります（DOPC（1,2- dioleoyl- のsn -glycero-3ホスホコリンまたはPC）およびDGS-NTA（ニッケル2 +）（1,2-ジオレオイルで構成される- SN -glycero -3 - [（N - （5-アミノ-1-カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル]（ニッケル塩））建物これらの実験のオフ、脂質電荷、柔軟性、及び曲率は、個々の要素として導入することができます膜近位の相互作用を変化させる可能性を有する。これらの変化は、ホスファチジルセリンまたはカルジオリピン（CL）、ホスファチジルエタノールアミン（DOPEまたはPE）、又はガラクトシル（β）、セラミドを含む特定の脂質成分の規定量を添加することによって達成することができます。

  1. きれいなガラス試験管にクロロホルムに溶解した脂質を組み合わせます。薄い脂質フィルムを形成するためにチューブを回転させながら乾燥窒素ガスで溶媒を蒸発させます。 centrifugaで残留溶媒を除去37℃で1時間リットル蒸発器。
    注：様々なリポソーム製剤は、以下に記載されたプロトコルで使用されている：足場リポソーム（3.3モル％DGS-NTA（ニッケル2 +）/ 96.7モル％DOPC）、カルジオリピン（3.3モル％DGS-NTA（ニッケル2+）との足場リポソーム/ 10モル％のカルジオリピン/ 86.7モル％DOPC）、カルジオリピンとの柔軟な足場リポソーム（3.3モル％DGS-NTA（ニッケル2 +）/ 10モル％のカルジオリピン/ 35モル％のDOPE / 51.7モル％DOPC）、および濃縮された足場リポソーム（10モル％DGS-NTAニッケル（Ni 2+）/ 35モル％DOPE / 40モル％のDOPC / 15モル％のカルジオリピン）。
  2. 37℃に予熱し、緩衝液A（25mMのHEPES（4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、KOHで7.5に調整し、150mMの塩化カリウム、pH値）を追加し、最終脂質濃度が1であるよう - 2 mmです。完全に脂質混合物（ 図1a）を再懸濁し、時々ボルテックスしながら37℃で30分間インキュベートします。
  3. 完全に凍結（rougまで液体窒素中でチューブを、プラスチック試験管に移す配置HLY 30秒）、37℃の水浴に入れ、完全に解凍するまで（およそ1 - 2分）。 4凍結融解サイクル（ 図1b）の合計に対して、この手順を繰り返します。
  4. 4フィルタ支持体およびバッファ内のポリカーボネートフィルターを浸漬し、製造業者の指示に従って押出機を組み立てることによって脂質押出機を準備します。フィルターを通して21回脂質溶液を押し出します。均質なサイズ分布（ 図1c）を確保するために、穏やかに、一定の圧力を使用してください。
    注：このプロトコールに記載されているすべての実験について、1.0μmのポリカーボネートフィルター押出のために使用しました。アニオン性脂質とDRP1の相互作用は、50ナノメートルから400ナノメートル12以上13までの範囲のリポソーム直径の様々な観察することができます。したがって、1μmのフィルタサイズは、両方のGTPアーゼ活性および電子顕微鏡法のために理想的であるように選択しました。他のリポソームの直径が所望される場合には、巨大な単層小胞14,15（GUVs）の調製または小unilamellARベシクル16（SUV車）を用いることができます。動的光散乱は、リポソームサイズの異質13を評価することができます。
  5. 4℃で押し出されたリポソームを格納し、3の後に捨てる - 5日間。

タンパク質結合分析のための足場リポソームの2.

  1. 試料調製
    1. 足場リポソームとHisタグMffΔTM（最終5μM）をインキュベート（40モル％のPC / 35モル％PE / 15モル％CL / 10モル％DGS-NTA（ニッケル2+）;最終50μM）は、少なくとも15分間緩衝液A + BMEにおけるRT（25mMのHEPES、150mMの塩化カリウム、10mMのβメルカプトエタノール（BME）、pHはKOHで7.5に調整）で。 MFF無制御のために、結合してシールドする（GFPなど）のhisタグ付き対照タンパク質を有するリポソームをインキュベートNTAニッケル（Ni 2+）が露出。
      注：以前の研究2で説明したようにMffΔTMを発現および精製しました。 GFPは、同様の方法で精製したが、イオン交換工程を省略しました。 BMEは、これらのexperimenために必要でしたTS DRP1は、その活性およびアセンブリ特性を変化させることができる酸化に敏感に反応するためです。
    2. DRP1（2μM最終）を追加し、室温で1時間インキュベートします。
      注：以前の研究2で説明したようにDRP1を発現および精製しました。 DRP1とのインキュベーション後、膜の変形に結合ヌクレオチドの効果は、2のMgCl 2および1mM GTP、1mMのGMP-PCP、または緩衝液A + BMEのいずれかでさらに1時間インキュベートすることにより調べることができます。
  2. ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（EM）分析
    1. 実験用フィルムのシートへの転写サンプルの5μLを、サンプル上に炭素被覆銅/ Rhのグリッドを置きます。サンプル上のグリッド1分間インキュベートし、濾紙上で余分な液体を離れブロット、および2％酢酸ウラニルのドロップに移します。 、1分間インキュベートし、濾紙上で余分な汚れを吸い取ると、グリッドボックスに転送します。完全な乾燥を確実にするために、真空O / Nの下に保管してください。
    2. 透過型電子microscを使用して画像サンプル18500でのOPE - 30,000Xの倍率は、タンパク質およびリポソームの形態17における超微細構造の変化を観察しました。
      注：微細構造の変化は、ImageJの13（http://imagej.nih.gov/ij/）として、画像解析ソフトウェアを用いて定量することができます。裸の脂質のテンプレートと比較してタンパク質の装飾を測定することができます。さらに、管状セグメントの直径は、アセンブリ13の最も外側の部分から測定することができます。より詳細な分析は、低温電子顕微鏡17を用いて行うことができます。この方法は、そのコートサンプルを重金属の汚れを使用せずに溶媒中に画像天然タンパク質、脂質集合体に使用することができます。このようにして、基礎となる脂質の形態の変化を含む、ネガティブ染色で明らかでない詳細な構造的特徴は、検査及び定量することができます。

酵素アッセイのための足場リポソームの3.

注：コロリメトリックGTPアーゼアッセイ18は、GTP加水分解を介してリン酸遊離を測定するために使用されました。代替GTPアーゼアッセイは、19入手可能であり、必要に応じて実施することができます。

  1. 緩衝液A + BME（ボリューム= 30μL）中、室温で15分間足場リポソーム（最終150μM）でHis標識MffΔTM（MFF）、Fis1ΔTM（Fis1）、またはGFP（すべての最終的な5μM）をインキュベートします。 DRP1（最終500 nM）を追加し、RT（体積= 80μL）でさらに15分間インキュベートします。
    注：Fis1はMFF 2と同様に精製したが、イオン交換クロマトグラフィー工程を省略しました。 HisタグGFPの目的は、NTA（ニッケル2+）頭部基を保護し、他のタンパク質との非特異的な電荷相互作用を防止することです。何の効果がGFPの非存在下で観察されていない場合、この制御が必要とされないかもしれません。 （目的のタンパク質に匹敵する大きさの）代替的なブロッキングタンパク質も同様に使用することができるが、GFPはSCAFとの相互作用の直接可視化を可能にしますリポソームを折ります。
  2. 転送37℃に設定したサーモサイクラーにチューブ、およびGTPおよびMgCl 2の添加によって反応を開始（それぞれ1から2mmの最終;体積= 120μL）。
  3. 所望の時点（ すなわち、T = 5、10、20、40、60分）で、マグネシウムをキレート2+と反応を停止させるために0.5 M EDTAを5μLを含むマイクロタイタープレートのウェルに反応の20μLを移します。
  4. 結果を校正するために緩衝液A + BMEにKH 2 PO 4を希釈することにより、リン酸標準のセットを準備します。標準の有用なセット100、80、60、40、20、10、5、0μMです。 0.5 M EDTAの5μLを含むウェルに各20μLのを追加します。
  5. 各ウェルにマラカイトグリーン試薬の150μL（1 mMのマラカイトグリーンカルビノール、10mMのモリブデン酸アンモニウム四水和物、および1NのHCl）を追加し、さらに後にOD 650 5分をお読みください。
    注：GTPは酸に不安定であり、マラカイトグリーン試薬の存在下で加水分解する。そのトンを確認してくださいマラカイト試薬を添加し、読書の間、彼は時間が再現可能な結果を​​確実にするために一定です。
  6. リン酸濃度の関数として標準のOD 650をプロットすることにより標準曲線を生成します。サンプル中のOD 650とリン酸濃度との関係を決定するために、線形回帰を使用してください。
  7. 線形回帰を使用して、タンパク質の反応試料のOD 650は μMリン酸に変換します。時間の関数としてのリン酸濃度をプロットすることにより、各反応混合物のためのリン酸生成速度を決定し、DRP1濃度（0.5μM）によって速度を分割して猫を kに変換します。
    注：のみ最初の線形速度は、リン酸の生成速度を決定するために使用する必要があり、そして3つのデータ点の最小値を使用しなければなりません。反応速度は、最初の3つのデータ点が線形ではないことは十分に迅速である場合（線形フィットのR 2は 0.9未満である）記号少なくとも3の時点でificantly短い時間のコースを実施すべきです。

結果

DRP1とMFFとの間の相互作用は、ミトコンドリア分裂に重要であることが実証されているが、この相互作用は、 インビトロで再現することは困難でした。私たちの目標は、より良いDRP1とMFFが相互作用前記細胞環境をエミュレートすることでした。この目的のために、NTAニッケル（Ni 2+）の限界濃度を含有するリポソームは、頭部基は、上述のように脂質?...

ディスカッション

このプロトコルは、内在性膜タンパク質を含むタンパク質 - タンパク質相互作用を調査するための方法を提供しています。モジュラーリポソーム足場を利用することにより、研究者らは、脂質近位環境内の1つ以上のタンパク質の活性を評価することが可能です。 26 -これまでの研究は、原形質膜24の受容体酵素の同様の方法を実証しました。私たちは、脂質補因子を?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphatidylcholine (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE)Avanti Polar Lipids850725
DGS-NTA(Ni2+)Avanti Polar Lipids790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL)Avanti Polar Lipids840012
ChloroformAcros Organics268320010
Liposome ExtruderAvanti Polar Lipids610023
Cu/Rh Negative Stain GridsTed Pella79712
Microfuge TubeBeckman357448
GTPJena BiosciencesNU-1012
GMP-PCPSigma AldrichM3509
Microtiter Plate stripsThermo Scientific469949
EDTAAcros Organics40993-0010
Instant Blue Coomassie DyeExpedeonISB1L
HEPESFisher ScientificBP310
BMESigma AldrichM6250
KClFisher ScientificP330
KOHFisher ScientificP250
Magnesium ChlorideAcros Organics223211000
4 - 20% SDS-PAGE GelBio Rad456-1096
4x Laemmli Loading DyeBio Rad161-0747
HCLFisher ScientificA144S
Malachite Green CarbinolSigma Aldrich229105
Ammonium Molybdate TetrahydrateSigma AldrichA7302
Laboratory FilmParafilmPM-996
Uranyl AcetatePolysciences21447
Tecnai T12 100 keV MicroscopeFEI
Optima MAXBeckman
TLA-55 RotorBeckman
Refrigerated CentriVap ConcentratorLabconico
Mastercycler Pro ThermocyclerEppendorf
VersaMax Microplate readerMolecular Devices

参考文献

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