Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Resumo

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Resumo

Estudos de proteínas de membrana integrais in vitro são frequentemente complicada pela presença de um domínio transmembranar hidrófobo. complicando ainda mais estes estudos, a reincorporação de proteínas de membrana de detergente-solubilizado em lipossomas é um processo estocástico, onde topologia proteína é impossível de aplicar. Este documento apresenta um método alternativo para estas técnicas difíceis que utiliza uma estrutura de suporte à base de lipossomas. a solubilidade da proteína é aumentada pela supressão do domínio transmembranar, e estes aminoácidos são substituídos com um radical amarrar, tal como uma cauda de His. Este tirante interage com um grupo de ancoragem ^{(Ni2 +} coordenado por ácido nitrilotriacético (NTA (Ni ²⁺⁾⁾ para proteínas marcadas com His), que executa uma topologia uniforme de proteína na superfície do lipossoma. Um exemplo é apresentado, em que a interacção entre a proteína relacionada com um dinamina (Drp1) com uma proteína de membrana integral, Cisão do Factor mitocondrial (QFP), foi investigated usando este método scaffold lipossoma. Neste trabalho, nós demonstramos a capacidade de recrutar Mff eficientemente Drp1 solúvel à superfície dos lipossomas, o que estimulou a sua actividade de GTPase. Além disso, foi capaz de Drp1 tubulate o modelo lípido Mff-decorado na presença de lípidos específicos. Este exemplo demonstra a eficácia de lipossomas de andaime usando ensaios estruturais e funcionais e destaca o papel do QFP, a regulação da actividade Drp1.

Introdução

Estudando interações proteína-proteína de membrana-proximal é uma tarefa desafiadora devido à dificuldade de recapitular o ambiente nativo das proteínas de membrana integrais envolvidas ^1. Isto é devido à necessidade de solubilização detergente e a orientação inconsistente de proteínas em proteolipossomas. A fim de evitar estes problemas, que têm empregue uma estratégia em que os domínios solúveis de proteínas de membrana integrais são expressos como proteínas de fusão His-tag, e estes fragmentos solúveis estão ancoradas aos lipossomas através de interacções de andaime com NTA (Ni ²⁺⁾ headgroups no lípido superfície. Usando estes andaimes, as interacções proteína-lipídicos proximal pode ser investigada através de uma gama de composições de lípidos e proteínas.

Temos eficazmente aplicado esse método para investigar as interacções proteína-proteína crítica que governam a montagem do complexo de fissão mitocondrial e examinar interacções lípidos que modulam este processo ^2. Durante fissão mitocondrial, uma proteína de remodelação da membrana conservada, chamada proteína relacionada com dinamina 1 (Drp1) ^3, é recrutado para a superfície do mitocondrial externa da membrana (OMM) em resposta a sinais celulares que regulam a homeostase de energia, sinalização apoptótica, e vários outros processos mitocondriais integral. Esta grande GTPase, citosólica é recrutada para a superfície das mitocôndrias através de interacções com proteínas integrais OMM ^{4 - 8.} O papel de uma tal proteína, Cisão do Factor mitocondrial (QFP), tem sido difícil para elucidar devido a uma interacção fraca aparente com Drp1 in vitro. No entanto, estudos genéticos demonstraram claramente que Mff é essencial para o êxito da fissão ^7,8 mitocondrial. O método descrito neste manuscrito foi capaz de superar as deficiências anteriores, introduzindo interações lipídicas simultâneas que promovem interações Drp1-QFP. No geral, este romance REVEA ensaiolevou interações fundamentais que orientam a montagem do complexo de fissão mitocondrial e forneceu uma nova etapa para estudos estruturais e funcionais em curso desta máquina molecular essencial.

Até à data, a análise de interacções entre Drp1 e Mff ter sido complicada pela flexibilidade inerente do Mff ^9, a heterogeneidade dos polímeros Drp1 ^2,10, e a dificuldade de purificação e a reconstituição de comprimento completo Mff com um domínio transmembranar de ¹¹ intacta. Nós abordado esses desafios usando lipossomas NTA (Ni ²⁺⁾ de andaime para reconstituir marcada com His Mff faltando seu domínio transmembranar (MffΔTM-His _6). Esta estratégia foi vantajoso porque MffΔTM foi extremamente solúvel quando sobre-expresso em E. coli, e esta proteína foi isolado facilmente reconstituída em lipossomas de andaime. Quando preso a estes modelos de lípidos, Mff assumido um, voltados para o exterior orientação idêntica na superfície da membrana.Além destas vantagens, lípidos mitocondriais, tais como a cardiolipina, foram adicionados para estabilizar Mff dobragem e de associação com a membrana ^11. A cardiolipina também interage com o domínio variável de ^2,12 Drp1 que podem estabilizar esta região desordenada e facilitar a montagem da máquina de fissão.

Este método robusto é amplamente aplicável para futuros estudos que visam avaliar as interações proteína de membrana-proximal. Através do uso de interacções amarrar / afinidade adicionais, a sofisticação destes estudos de reconstituição da membrana pode ser aumentada para imitar complexidade adicional encontrado na superfície das membranas dentro das células. Ao mesmo tempo, as composições de lípidos podem ser modificados para mimetizar mais precisamente os ambientes nativas destes complexos macromoleculares. Em resumo, este método proporciona um meio para examinar as contribuições relativas de proteínas e lípidos em moldar a morfologias de membrana durante Proc celulares críticascessos.

Protocolo

1. Andaime lipossomas Preparação

NOTA: Idealmente, as experiências iniciais deve usar um andaime relativamente simples e sem traços característicos (composto de DOPC (1,2-dioleoyl--sn-glicero-3-fosfocolina ou PC) e DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ (1,2-dioleoil - sn-glicero-3 - [(N - (5-amino-1-carboxipentil) ácido iminodiacético) succinil]. (sal de níquel)) edifício fora destas experiências, a carga de lípidos, a flexibilidade, e a curvatura pode ser introduzido como factores individuais com o potencial para alterar as interacções da membrana proximal. Estas alterações podem ser conseguida por adição de quantidades definidas de componentes lípidos específicos, incluindo fosfatidilserina ou cardiolipina (CL), f osf atidiletanolamina (DOPE ou PE), ou galactosil (β) ceramida.

1. Combinar lipidos dissolvidos em clorofórmio em um tubo de ensaio de vidro limpo. Evapora-se o solvente com azoto gasoso seco durante a rotação do tubo de modo a formar uma película fina de lípidos. Remover o solvente residual com uma centrifugal evaporador durante 1 h a 37 ° C.
   NOTA: As várias formulações lipossomais são usadas nos protocolos descritos abaixo: lipossomas de andaime (3,3 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 96,7% molar de DOPC), lipossomas de andaime com cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 10% molar de cardiolipina / 86,7% molar de DOPC), lipossomas de andaime flexíveis com cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 10% molar de cardiolipina / 35% molar de DOPE / DOPC 51,7 mol%), e de andaime enriquecido lipossomas (10 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 15% molar de cardiolipina / 35% molar de DOPE / 40% molar de DOPC).
2. Adicionar tampão A (25 mM de HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico), KCl 150 mM, pH ajustado para 7,5 com KOH) pré-aquecido a 37 ° C, de modo que a concentração final de lípido é de 1 - 2 mm. Incubar 30 min a 37 ° C com agitação em vórtice para ressuspender completamente ocasional da mistura de lípidos (Figura 1a).
3. Transferir para um tubo de ensaio de plástico, colocar o tubo em nitrogênio líquido até que esteja completamente congelado (rougHly 30 s), e coloque em uma temperatura de 37 ° C banho de água até estar totalmente descongelado (cerca de 1-2 min). Repetir para um total de 4 ciclos de congelação-descongelação (Figura 1B).
4. Prepara-se uma extrusora de lípido por imersão 4 suportes de filtro e um filtro de policarbonato e em tampão de montagem da extrusora de acordo com as instruções do fabricante. Extrudir a solução de lípidos através do filtro 21 vezes. Use pressão suave e constante para assegurar uma distribuição de tamanho homogêneo (Figura 1c).
   NOTA: Para todas as experiências descritas neste protocolo, um filtro de 1,0 um policarbonato foi usada para a extrusão. Drp1 interacção com lípidos aniónicos pode ser observada com uma variedade de diâmetros de lipossomas variando desde 50 nm a 400 nm, ¹² ou maior ^13. Por isso, o tamanho do filtro de 1 ^ M foi escolhida para ser ideal, tanto para a actividade de GTPase e por microscopia electrónica. Se outros diâmetros de lipossomas são desejados, preparação de gigantes vesículas unilamelares ^14,15 (GUVs) ou pequena unilamellAR vesículas ¹⁶ (SUVs) pode ser usado. Dispersão dinâmica de luz pode ser utilizado para avaliar o tamanho do lipossoma heterogeneidade ^13.
5. Armazenar lipossomas extrudidos a 4 ° C e depois descartá 3-5 d.

2. Uso de andaime lipossomas para Análise de ligação às proteínas

1. Preparação de amostra
   1. Incubar marcada com His MffΔTM (5 uM final), com lipossomas de andaime (40 mol% de PC / 35% molar de PE / mole 15% CL / 10% molar de SGD-NTA (Ni ^2+), 50 uM final) durante pelo menos 15 min à TA em Tampão a + BME (25 mM de HEPES, 150 mM de KCl, 10 mM de β-mercaptoetanol (BME), pH ajustado para 7,5 com KOH). Para um controle Mff-livre, incubar lipossomas com uma marcada com His proteína de controlo (tal como GFP) para ligar e escudo exposta NTA (Ni ^2+).
      NOTA: MffΔTM foi expressa e purificada como descrito em um estudo prévio ^2. GFP foi purificado de uma maneira similar, mas o passo de permuta iónica foi omitido. BME foi necessária para estes experimenTS porque Drp1 é sensível à oxidação, o qual pode alterar as suas propriedades de actividade e de montagem.
   2. Adicionar Drp1 (2 uM final) e incubar durante 1 h a RT.
      NOTA: Drp1 foi expressa e purificada como descrito em um estudo prévio ^2. Após incubação com Drp1, o efeito de deformação de ligação de membrana de nucleótidos pode ser investigada através da incubação de uma hora adicional com 2 mM de _MgCl2 e 1 mM de GTP, quer, 1 mM de GMP-PCP, ou tampão A + BME.
2. Negativo Stain Transmission Electron Microscopy (EM) Análise
   1. Transferência de 5 uL de amostra a uma folha de película de laboratório, e estabelecer uma rede de Cu / Rh revestido-carbono sobre a amostra. Incubar a grade 1 min sobre a amostra, limpar o excesso de líquido em papel de filtro, e transferir para uma queda de 2% de acetato de uranilo. Incubar 1 min, blot excesso de corante em papel de filtro, e transferir para um caixa de grade. Loja sob vácuo O / N para assegurar a dessecação completa.
   2. amostras de imagem usando um microsc eletrônica de transmissãoope em 18.500 - 30,000X ampliação para observar as alterações ultra-estruturais em proteínas e lipossomas morfologias ^17.
      Nota: As alterações ultra-estruturais podem ser quantificados usando software de análise de imagem, tais como ImageJ ¹³ (http://imagej.nih.gov/ij/). decoração proteína pode ser medido quando comparada com modelos nus lipídicas. Além disso, os diâmetros dos segmentos tubulares pode ser medido a partir da porção mais externa dos conjuntos ^13. Uma análise mais detalhada pode ser realizada através de microscopia crio-eletrônico de ^17. Este método pode ser utilizado para os conjuntos de proteínas em lípidos nativas imagem em solvente, sem a utilização de manchas de metais pesados ​​que o revestimento da amostra. Desta forma, as características estruturais detalhados não aparentes na coloração negativa, incluindo mudanças na morfologia lipídico subjacente pode ser examinados e quantificados.

3. Uso de andaime lipossomas para Ensaio Enzimático

Nota: A coloriensaio GTPase métrica ¹⁸ foi utilizado para medir a libertação de fosfato por hidrólise GTP. GTPase ensaios alternativos estão disponíveis ¹⁹ e pode ser implementado conforme necessário.

1. Incubar marcada com His MffΔTM (QFP), Fis1ΔTM (Fis1), ou GFP (5 uM final para todos) com lipossomas de andaime (150 uM final) durante 15 min à temperatura ambiente em Tampão A + BME (volume = 30 mL). Adicionar Drp1 (500 nM final) e incuba-se um adicional de 15 min à temperatura ambiente (= 80 mL de volume).
   NOTA: Fis1 foi purificado de uma maneira similar à Mff ^2, mas o passo de cromatografia de permuta iónica foi omitido. O propósito de Sua marcado com GFP é para proteger o NTA (Ni ²⁺⁾ headgroups e evitar interacções de carga não específicas com outras proteínas. Se nenhum efeito é observado na ausência de GFP, então pode não ser necessária este controlo. proteínas alternativos de bloqueio (de tamanho comparável à da proteína de interesse) pode ser utilizado, bem como, mas GFP permite a visualização directa das interacções com SCAFdobre lipossomas.
2. Tubos de transferência para um termociclador definido como 37 ° C, e iniciar as reacções por adição de GTP e _MgCl2 (1 mM e final de 2 mM, respectivamente; volume = 120 mL).
3. Em pontos de tempo desejado (isto é, T = 5, 10, 20, 40, 60 min), a transferência de 20 uL da reacção aos poços de uma placa de microtitulação contendo 5 uL de EDTA 0,5 M para quelar Mg ²⁺ e parar a reacção.
4. Preparar um conjunto de padrões através da diluição de fosfato _de KH ₂ PO ₄ em tampão A + BME para calibrar os resultados. Um conjunto útil de padrões é de 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 e 0 uM. Adicionar 20 ul de cada uma a poços contendo 5 uL de 0,5 M de EDTA.
5. Adicionar 150 uL de reagente de malaquite verde (1 mM de malaquite verde carbinol, 10 mM de molibdato de amónio tetrahidratado, e HCl 1 N) a cada alvéolo, e leu _OD650 5 min após a adição.
   NOTA: GTP é ácido lábil, e irão hidrolisar na presença de reagente de verde de malaquite. Certifique-se que tele o tempo entre a adição do reagente malaquita e leitura é constante para garantir a reprodutibilidade dos resultados.
6. Gerar uma curva padrão através da representação gráfica OD ₆₅₀ dos padrões como uma função da concentração de fosfato. Use de regressão linear para determinar a relação entre a OD ₆₅₀ e a concentração de fosfato numa amostra.
7. Usando a regressão linear, converter a OD ₆₅₀ das amostras de reacção de fosfato de proteína para uM. Determinar a taxa de geração de fosfato para cada mistura de reacção através da representação gráfica concentração de fosfato como uma função do tempo, e converter a k _cat dividindo a taxa pela concentração Drp1 (0,5 uM).
   NOTA: Apenas a taxa linear inicial deve ser utilizado para determinar a taxa de geração de fosfato, e um mínimo de 3 pontos de dados devem ser usados. Se a velocidade de reacção é suficientemente rápida que os três primeiros pontos de dados não é linear (isto é, o ^R2 do ajuste linear é inferior a 0,9) um sinalcurso de tempo mais curto ificantly com, pelo menos, 3 pontos de tempo deve ser realizada.

Resultados

Embora a interacção entre Drp1 Mff e foi demonstrada ser importante para a fissão mitocondrial, esta interacção tem sido difícil de recapitular in vitro. Nosso objetivo era melhor emular o ambiente celular no qual Drp1 e do QFP interagir. Para este fim, os lipossomas contendo concentrações limitativos de NTA (Ni ²⁺⁾ headgroups foram preparados através da hidratação de uma película de lípido, tal como descrito acima. A solução de lípido consiste inicial...

Discussão

Este protocolo oferece um método para a investigação das interacções proteína-proteína envolvendo proteínas de membrana integrais. Através da utilização de um lipossoma andaime modular, os investigadores são capazes de avaliar a actividade de uma ou mais proteínas num ambiente de lípido-proximal. Estudos anteriores têm demonstrado um método semelhante por enzimas de receptor da membrana do plasma ^24-26. Nós expandimos esse método para incorporar cofatores lipídicos e e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725
DGS-NTA(Ni2+)	Avanti Polar Lipids	790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL)	Avanti Polar Lipids	840012
Chloroform	Acros Organics	268320010
Liposome Extruder	Avanti Polar Lipids	610023
Cu/Rh Negative Stain Grids	Ted Pella	79712
Microfuge Tube	Beckman	357448
GTP	Jena Biosciences	NU-1012
GMP-PCP	Sigma Aldrich	M3509
Microtiter Plate strips	Thermo Scientific	469949
EDTA	Acros Organics	40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye	Expedeon	ISB1L
HEPES	Fisher Scientific	BP310
BME	Sigma Aldrich	M6250
KCl	Fisher Scientific	P330
KOH	Fisher Scientific	P250
Magnesium Chloride	Acros Organics	223211000
4 - 20% SDS-PAGE Gel	Bio Rad	456-1096
4x Laemmli Loading Dye	Bio Rad	161-0747
HCL	Fisher Scientific	A144S
Malachite Green Carbinol	Sigma Aldrich	229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma Aldrich	A7302
Laboratory Film	Parafilm	PM-996
Uranyl Acetate	Polysciences	21447
Tecnai T12 100 keV Microscope	FEI
Optima MAX	Beckman
TLA-55 Rotor	Beckman
Refrigerated CentriVap Concentrator	Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf
VersaMax Microplate reader	Molecular Devices