באמצעות TMEM184A GFP-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות

Summary

TMEM184A קידוד לבנות עם תג ה- GFP על הסופית- carboxy המיועד ביטוי איקריוטיים, הועסק מבחנים שנועדו לאשר את זיהוי של TMEM184A כמו קולטן הפרין בתאי כלי דם.

Abstract

כאשר חלבונים חדשים מזוהים באמצעות ניתוח בידוד ביואינפורמטיקה מבוסס זיקה, הם לעתים קרובות uncharacterized ברובו. נוגדנים נגד פפטידים ספציפיים בתוך רצף החזה לאפשר כמה ניסויי לוקליזציה. עם זאת, אינטראקציות אפשריות אחרות עם הנוגדנים לעתים קרובות לא ניתן לשלול. מצב זה ספק הזדמנות לפתח סדרה של מבחנים תלויים רצף החלבון. באופן ספציפי, מבנה המכיל את רצף הגן מצמידים את רצף קידוד GFP בסוף C- מסוף של החלבון הושג והעסיק למטרות אלה. ניסויים לאפיין לוקליזציה, זיקה ליגנד, ורווח של פונקציה תוכננו במקור ובוצע כדי לאשר את הזיהוי של TMEM184A כמו קולטן הפרין ^1. בנוסף, המבנה יכול להיות מועסק ללימודים בשאלות טופולוגיה הממברנה אינטראקציות חלבון-ליגנד מפורטים. הדו"ח הנוכחי מציג arange של פרוטוקולי ניסוי מבוססים על מבנה GFP-TMEM184A לידי ביטוי בתאי כלי דם שיכול בקלות להיות מותאם עבור חלבונים חדשים אחרים.

Introduction

זיהוי של חלבוני מועמד פונקציות רומן לעתים קרובות תלוי פרוטוקולי בידוד מבוסס זיקה ואחריו נחישות רצף חלקית. הדוגמות אחרונות של חלבונים זיהו לאחרונה כוללות הטרנסממברני חלבון 184A (TMEM184A), קולטן הפרין המזוהה לאחר אינטראקציות זיקת הפרין ^1, ו TgPH1, חלבון מושלם הומולוגית pleckstrin שקושר PI phosphoinositide (3,5) P ₂ ^2. זיהוי חלבונים הרומן השני כרוך ניתוח רצף ישיר של פפטידים כגון שעד Vit, et al. שהשתמשו פפטידים הטרנסממברני לזהות מוצרי חלבון מן הגנים uncharacterized בעבר ^3. באופן דומה, זיהוי רצפי חלבוני רומן ניתן להשיג באמצעות ביואינפורמטיקה מחפש משפחות חלבון מאופיינים בעבר כגון זיהוי של חלבוני 4TM חדשים ^4. בחינת רצפי גנים המשפחה aquaporin יש אלכך הניב זיהוי של חברים חדשים עם פונקציות רומן ^5. לאחר זיהוי, ניתוח של תפקוד חלבון הוא בדרך כלל השלב הבא שלפעמים ניתן לבדוק באמצעות assay ספציפי של תפקוד חלבון כגון במקרה aquaporin.

במידת האפשר, פונקציה של חלבון זיהו לאחרונה ניתן לבדוק עם האנזימטית ספציפי או מבחני תפקוד חוץ גופית דומה. בגלל פונקציות רבות של חלבונים חדשים תלויות יחסי גומלין מורכבים המתרחשים רק פגעו תאים או אורגניזמים, ב מבחני חוץ גופייה לא תמיד יעילים. עם זאת, מבחני vivo ב חייב להיות מתוכנן בצורה כזאת, כי הם תלויים רצף הגן. תרבית תאים, ו / או אורגניזמים מודל פשוט, מציאה יכולה לספק ראיות תומכות לזיהוי חלבון / הפונקציה ^6. עם חלבונים חדשים שזוהו כאמור לעיל, הוא לעתים קרובות די פשוט להפיל חלבון כדי לאשר פונקציה, גידולד העיצוב של in vivo מבחנים תפקודיים שתלויים רצף גן הופך להיות חשוב עבור האפיון של חלבונים חדשים.

הזיהוי האחרונה של TMEM184A כמו קולטן הפרין (כי מודולציה התפשטות שריר חלק בכלי דם ותגובות דלקתיות בתאי האנדותל) באמצעות כרומטוגרפיה זיקת MALDI MS ^{1, 7} ספקו הזדמנות לפתח אוסף של מבחנים לאחר מציאת ניב תוצאות עקביות עם זיהוי . סקירה אחרונה אשרה כי הפרין אינטראקציה במיוחד עם גורמי גדילה רבים, הקולטנים שלהם, רכיבים תאים מטריקס, קולטנים הידבקות תא, וחלבונים אחרים ^8. במערכת כלי הדם, הפרין ו proteoglycans סולפט heparan (המכיל שרשראות סולפט heparan הדומים במבנה שלהם הפרין) אינטראקציה עם כמה מאות חלבונים ^9. כדי לאשר מבחינה תפקודית that TMEM184A היה מעורב עם ספיגת הפרין ומחייבת, טכניקות שהעסיקו את מבנה הגן TMEM184A פותחו. הדו"ח הנוכחי כולל אוסף של מבחנים המבוססים על ה- GFP-TMEM184A לבנות לשימוש המאשר את זהותו של TMEM184A כמו קולטן הפרין.

Protocol

עיצוב 1. של Construct GFP-חלבון

1. רכישה, או לעצב ולבנות, לבנות-tagged GFP מבוסס על החלבון המדובר.
   הערה: לקבלת מבנה שנרכש, וקטורים רגילים זמינים ממעבדות מסחריות הכוללות חלק או את כל ההצעות הבאות: לקבלת חלבון הממברנה, בחרו במיקום C-terminal של GFP כי זה פחות סביר כדי להפריע סחר חלבון הממברנה. שקל רחבה בין הגן של ריבית ה- GFP אם יש סיבה להאמין C- הסופית של החלבון מדובר הוא מקופל בצורה מרוכזת לתוך תחום של החלבון. בחר לבנות לביטוי תא כללי איקריוטיים, אלא לאפשר לבנות ייצור במערכות חיידקים. כלול אתר מחשוף (כגון עבור פרוטאז TEV) שבאמצעותו GFP ניתן להסיר אם רוצים עבור בניסויים מסוימים שבהם GFP יכול להפריע לפעילות חלבון. להוסיף מוסיף אחרים כגון תג נוסף עבור לוקליזציה או זיקה בteractions (למשל, His6). זה לא היה נחוץ עבור המבחנים המתוארים כאן, אבל אולי להקל מבחני אחרים, או להיות שימושי ישירות בסמוך הגן, לפני GFP, אם הסרת GFP היא רצויה.

2. ביטוי GFP-TMEM184A בתאי דם

1. האנדותל תרבות או תאי שריר חלק בכלי דם על מנות בתרבית רקמת 0.2% ג'לטין מצופה כפי שדווחו ^{1 בעבר, 6, 7.}
2. הוסף 5 מיליליטר תרבית תאי טריפסין פתרון (0.5% w / v) על מ"מ שטוף 100, או גדול יותר, צלחת ומחוברות של תאים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד תאים שוחררו רק מהצלחת, ולהעביר את תאי צינור צנטריפוגות פוליפרופילן סטרילי.
3. הוסף מעכב טריפסין (למשל, נפח שווה של מדיום תרבות הקבוע), כפי שמוצג בתרבות לשגרה, פתרון התא / טריפסין להגבלת פעילות טריפסין. גלולת התאים למשך 5 דקות ב approximately 600 XG (או מהירות וזמן מתאימה רק כדי גלולת התאים לתרבות תקן רקמות). לשאוב supernatant.
4. תאים Resuspend ב 1 מ"ל של HeBS (Hepes-בופר) חיץ electroporation, להגביל את כמות תאי הזמן נמצאים גלולה או השעיה. מניח את השעית התא על קרח ולבצע שלבים הנותרים על קרח.
   הערה: גלולה ניתן לכבס פעם אחת עם HeBS לפני resuspension.
5. הוספת נפח מספיק של פלסמיד TMEM184A-tagged GFP לתאים כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNA. השתמש בפרוטוקול זהה עבור מבנה GFP.
6. מניחים כ 0.4 מ"ל של הפתרון תא HeBS בתוך קובט electroporation. טרום לצנן את cuvettes לפני השימוש.
7. Electroporate את התאים באמצעות התנאים הבאים: דעיכה מעריכית, 500 μF, ∞ אוהם, ו -170 V.
   הערה: המתח עבור סוג תא נתון צריכה להיות מותאמת. מחקרים ראשוניים עם האנדותל cel שריר חלקסוגי l הושגו עם מבנה GFP-vinculin כדי לקבוע את ערך המתח האופטימלי לציין כאן, למשל ^10.
   1. כדי לייעל את electroporation, להתחיל עם המלצות יצרן הציוד (הכוללות תנאים מסוימים סוגי תאים סטנדרטיים). השתמש המבנה הרצוי או חלבון בקרה פלורסנט לבנות בגודל דומה ומאפייני ניאון כדי לבנות הרצוי.
      הערה: חומצות גרעין קטנה להופיע להיכנס תאים יותר בקלות מאשר בונה גדולה, כך לבנות עם חלבון פלואורסצנטי רק יכול להיות קל יותר לבטא מאשר אחד גדול יותר.
   2. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע כדאיות התא, באחוז התאים בהם מבנה ניאון מתבטא לאחר 24 ו -48 שעות, ואת עוצמת הביטוי.
      הערה: הנמך את המתח ו / או זמן מעט אם ההישרדות היא נמוכה. כוון בזמן הקצר ביותר האפשרי בין שחרורו של תאים מפני שטח התרבות והחזרהתאים לתרבות כדי לשפר את ההישרדות. עליות קלות בזמן או דופק שני יכולות לשפר ספיגות לבנות אם ההישרדות גבוהה הביטוי הוא נמוך. תנאים וביטוי אופטימום ינועו בין סוגי תאים. אם אחוז תאים המבטאים את המבנה גבוה, אבל העצמה היא נמוכה, להגדיל את ריכוז ה- DNA וניטור תאי transfected לאורך זמן עבור עוצמת אופטימלית, אשר ישתנה בהתאם מחצית חי חלבון כמו גם ביטוי, עשוי לשפר אינטנסיביות. עוצמת מכתים ניתן להגדיל עבור מבחנים מסוימים, אם יהיה צורך בכך, על ידי מכתים immunofluorescence של GFP עם נוגדנים אנטי GFP
8. לאחר electroporation, זרע את התאים לתוך בארות בתרבית רקמה שישה 30 מ"מ עם coverslips הדמיה או לתוך מנות בתרבית רקמה. תרבות תא באמצעות נהלי תרבית תאים סטנדרטיים.
9. אופציונאלי: החלף את מדיום התרבות אחרי 24 שעות כדי להסיר כל חיץ electroporation HeBS.

ויזואליזציה 3.-TMEM GFPלוקליזציה 184A

1. יש לשטוף את התאים עם PBS ו רעד עדין לאחר culturing עבור h 24 לפחות. להגביל את החשיפה לאור בהיר כדי למנוע דהייה GFP.
2. תקן תאים עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS במשך 15 דקות ב RT עם רעד עדין. הימנע משימוש בכל ריאגנטים המכיל מתנול אשר עשוי permeabilize התאים. קיבוע עם מתנול יכול לשמש אם זה לא הכרחי כדי להעריך אינטראקציות ליגנד.
   זהירות: Paraformaldehyde רעיל. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים. השתמש במנדף, בזהירות, וזורקים כראוי.
3. לשטוף עם PBS כנ"ל. עבור מכתים מבוסס נוגדן, ראה 3.6 להלן.
4. Coverslips הר שקופיות באמצעות Mowiol או הרכבה בינונית מתאימה אחרת.
5. שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי עם מערכות הסינון המתאימות עבור עירור GFP ספקטרום פליטה. מיקרוסקופיה Confocal עדיפה בגלל היכולת להפריד דגימות מטוס- z. לשמור תמונות בגוונים אפורים עבור quלמטרות antitation בפורמט TIF (בנוסף תמונות בצבע מלא עבור איורים).
6. לשם השוואה עם WT TMEM184A הביע ידי התאים, להכין תאים אחרים immunofluorescence באמצעות נוגדנים ראשוניים מוכן פפטיד (שניות) מרגע רצף TMEM184A, למשל ^1. זיהוי של GFP-TEMEM184A יכול גם להיות מושג באמצעות נוגדנים נגד GFP. להעריך הוא דגימות התאים על ידי שיטות מיקרוסקופיה זהות.

4. Rhodamine-הפרין מחייב לבין colocalization עם תאי GFP-TMEM184A-טרנספקציה

1. פנקו GFP-TMEM184A להביע תאים עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​הפרין rhodamine להוסיף בינוני תרבות, ולאפשר לתאים דגירה עבור סכום מסוים של זמן, בדרך כלל פחות מ -10 דקות עבור התאים A7r5. לשטוף ולתקן כמו 3.1 ו -3.2.
   הערה: בפעם והריכוז האופטימלית של ליגנד תלוי תגובת תא, עוצמת קרינה של עוצמת ליגנד ותמונה שהושגה. תרכיזים זהיון של הפרין הועסק כי התוצאה היא יותר מ -50% בתגובה מבחני אחרים ^11. ריכוז זה יכול להיות דמיין באמצעות טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטיות, כך שזה לא היה הכרחי כדי להגדיל אותה. דילול של rhodamine-הפרין עם תוצאות הפרין ללא תווית קרינה נמוכה בתאים, וכך קשה יותר תמונה ולכמת.
2. כדי לכמת את rhodamine-הפרין מחייב בשל transfection GFP-TMEM184A, להכין תאים זהים ללא GFP-TMEM184A transfected.
3. תמונה התאים באמצעות מיקרוסקופ confocal עם GFP המתאימה (488 ננומטר) ו rhodamine (543 ננומטר) עירור ופליטה (500 - 530 ננומטר עבור GFP ו יותר מ -560 ננומטר עבור rhodamine) ערכים כדי לקבוע לוקליזציה שיתוף. להשיג תמונות של 50 תאים לפחות מלפחות שלושה ניסויים נפרדים כדי לקבל נתונים סטטיסטיים. שמור הגדרות זהות בתוך ניסויים, ולהעסיק מדגם ביקורת (ים) (למשל, תאי transfected ללא טיפול) הבבית יכול לשמש כדי לתקנן נתונים לניתוח של ניסויים מרובים.
4. בדוק את התמונות באמצעות תוכנת מחשב כדי לקבוע rhodamine ביחס מחייב ספיג / בכל תא כדי לכמת מחייב.
   הערה: תמונות TIF צריכות להיות מועסקות כפי שהם נוחים לניתוח ניתן להמיר לאפור מידת תוכנות מחשב רבים אם הם לא נצלו בתחילה בפורמט זה. התמונה J (freeware) הועסקה הניתוח המובא ומאפשרת באזור ועוצמת פיקסל יימדדו בכל תחום המוגדר על ידי משתמש בתמונה.
   1. השתמש בכלי חופשי להקיף תא בתוך תמונה פלורסנט ולהשתמש בכלי מדידה כדי לקבוע את עוצמת בתוך המרחב הזה.
      הערה: מדידות אלה מספקים את המידע הדרוש כדי לחשב עוצמת הכולל אזור המוגדרים על ידי המשתמש (כל תא, גרעין, וכו ') מאפשר דרך להשוות תאים שונים בגיאומטריות שונות. ממוצע עוצם פני שטח של רקע ניתן לדווח, וכי להקלאוסף ים של עוצמת רקע לניתוח.
   2. ייצא גיליון אלקטרוני כדי לחשב את השטח מוכפל העוצם ולחסר רקע לאותה כמות השטח. ממוצע הקרינה / תא עבור תאים / ניסוי מספיק כדי להשיג מובהקות סטטיסטית.

5. העברת אנרגיה תהודה הקרינה מן ה- GFP-TMEM184A כדי Rhodamine-הפרין

1. הכן תאים transfected דגירה עם 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​ליגנד-tagged rhodamine כמו 3.1. ראוי לציין, כי זמן הדגירה עם ליגנד הניאון הוא תאים מסוג תלוי. תקן עם PFA בלבד, הר שקופיות הדמיה.
2. ראשית, לרגש ב 405 ננומטר ותמונה עבור פליטת rhodamine (566 - 685 ננומטר; סריג). שנית, לרגש ב 488 עבור GFP (תמונה ב 493 - 530), והשלישי, לרגש ב -561 עבור rhodamine (תמונה ב 566 - 685). בקרות ללא GFP-TMEM184A או ללא-הפרין rhodamine הן קריטיות.

6. Live- תא הדמיה של Rhodamine-Heparin ספיגה

1. זרעי GFP-TMEM184A תאי transfected לתוך מנות בודדות המיועד דימות תאי חיים ולטפל כמו בפרוטוקול 3.
   הערה: מספר התאים הנדרשים תלוי בסוג התא וצפיפות הרצוי. כדי למזער את כמות הזמן התאים בתרחיף, לא לספור תאים. תאי זרע מצלחת ומחוברות 100 מ"מימ לשש 35 מ"מ צלחות הדמיה לחיות להשיג תאי מפגש קרוב 48 שעות.
2. לאחר 48 שעות, להחליף בינוני עם בינוני תרבות ללא פנול אדום.
3. עבר צלחת של תאים כדי מיקרוסקופ confocal עם שלב התחממות כדי לשמור על טמפרטורה, ולמקד את המיקרוסקופ.
4. Pipet 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​rhodamine-הפרין לתוך צלחת ומערבבים בעדינות.
5. מיד להתחיל להקליט תמונות חיות. אם אין ספיגת תא של הפרין מתרחשת בתוך האזור לאור, להזיז את הצלחת מעט כדי לזהות תאים עם לפחות שלפוחית ​​ירוקה אחד המכילה את תווית rhodamine.
   הערה: פרטי עירור ופליטת הדמיה הםזהה לפרוטוקול הספיג הפרין (סעיף 5). פרק הזמן בין התמונות היה כ -16 שניות. תנאי הניסוי המיקרוסקופ בדרך כלל יקבעו את המהירות שבה תמונות ניתן להשיג.

בידוד 7. של GFP-TMEM184A ו- GFP מ תאים בתרבית

1. לאחר הסרת בינוני תרבות ושטיפה עם PBS, להוסיף 2 מ"ל 0.2% (w / v) פתרון בחורים 1x PBS עם מעכבי פרוטאז לצלחת 150 מ"מ של תאים המבטאים GFP-TMEM184A או GFP (עבור מבחני מחייב שליטה). גרדו את התאים מצלחת, למקם את הפתרון תאים / בחורים בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל על הקרח, ומערבבים היטב על ידי הקשה. השלם את כל השלבים באור בהיר כדי להבטיח את תג ה- GFP הוא מחומצן עבור assay מחייב להלן.
2. כדי לאגד GFP-TMEM184A במיוחד (או פקד GFP המתאים), להוסיף 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​biotinylated אנטי GFP נוגדנים הפתרון ו דגירה לילה ב 4 ° C עם נדנדה.
3. הוספת 500 μLחרוזי agarose-streptavidin עם כמה מחברי 5 מיליליטר 0.2% לפחות / PBS ו צנטריפוגות ב כ 600 XG במשך 3 עד 5 דקות. הסר את supernatant. חזור פעמיים נוספות עם בחורים טריים / PBS בכל פעם. להוסיף חרוזים לפתרון נוגדן ותא דגירה לילה ב 4 ° C עם נדנדה לאפשר חרוזים להיקשר נוגדן אנטי GFP biotinylated מאוגד GFP או GFP-TMEM184A.
4. גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה (כמו 7.3) ולהסיר החומר מאוגד. הוסף לפחות 5 מ"ל 0.2% בחורים / PBS / מעכבי פרוטאז לשטוף. כביסה צנטריפוגה חזור לפחות 3x כדי להסיר כל חלבון מאוגד ביעילות.
5. לאחר הסרת לשטוף הסופי, דגירה חרוזים עם 1 מ"ל של 0.2 מ 'גליצין / 0.2 בחורים% ב PBS (pH 2.0 באמצעות HCl) על קרח למשך 3 דקות כדי לנתק את נוגדן-GFP מחייב (וכתוצאה מכך GFP-TMEM184A בחינם או בחינם GFP). מערבבים בעדינות על ידי הקשה על כל 30 שניות.
6. צנטריפוגה ב כ 600 XG ולהעביר את supernatant המכיל את p מטוהריםrotein לצינור 15 מ"ל חדש ואחריו נטרול מיידי עם 5 מ"ל של 1 M סודיום ביקרבונט (להביא את ה- pH 7).
7. תתרכז המדגם באמצעות concentrator צנטריפוגלי מולקולרי 10,000 דלתון משקל חתוך (להעסיק מהירות צנטריפוגה המומלץ על ידי הספק). כאשר נפח ומגיע לכ 0.5 מ"ל, להוסיף 0.2% בחורים / PBS. המשך להתרכז והוסיף עוד 0.2% בחורים / PBS עד לפחות עשרה כרכים (פי נפח דגימת ההתחלה) מן הבחורים 0.2% / PBS נוספו.
8. כדי לקבוע אומדן של הסכום של GFP המבודד או חלבון מתויג GFP, לקבל ספיגת הקריאה ב 280 ננומטר ולהשוות אותו עקומת סטנדרט המוכנה מן אלבומין בסרום שור או חלבון בקרה אחר באותו החיץ.
   הערה: בשל הבדלים מקדמים הכחדה, ריכוז זה הוא אומדן, אבל יכול לספק ריכוז חלבון משוער כדי להקל על ניתוח נוסף בלי לבזבז מדגם. ריכוז החלבון מדויק ניתן להרתיעממוקש באמצעות assay חלבון מיקרו-לורי ביצוע מסוימים להכין את חלבון רגיל באותה חיץ כמו המדגם. ניתוח נוסף של החלבון המבודד ניתן להשיג על ידי סופג המערבי של החלבון המבודד (באמצעות זיהוי נוגדן עבור GFP) והשוואה למשקל המולקולרי חזה. לחלופין, שימוש של נוגדנים TMEM184A אמור לגרום להקה של גודל המבנה חזה, אך עלול גם לגרום להקת WT TMEM184A אם הדימרים (או oligomers מסדר גבוה) נוכחים במדגם. אומדן טוהר ניתן להשיג על ידי מכתים כתם עבור חלבון הכולל מהדגימה המבודדת לעומת חלבון הכולל מ aliquot של החומר המוצא.

8. Assay כריכה במבחנה הפרין

1. הכינו צלחת 96-היטב avidin מצופה שחור על ידי שטיפה עם 200 μL 0.2% בחורים / PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות עם רעד. הכן צלחת 96-היטב noncoated שחורה זהות בהפעלת נוהל הכביסה אותו. להכיןפריסה עבור דגימות הניסוי (בשלושה עותקים) לעקוב במהלך assay. כלול בארות לריכוזי הפרין רגילים, שולט חיץ, ובארות עם דגימות ה- GFP ללא הפרין כדי לאשר לבן של ה- GFP.
   הערה: אם מאגרי בידוד או אינטראקציה ליגנד מותאם הם שונים עבור החלבון מדובר, לעשות את כל הכנות צלחת הכביסה עם מערכת החיץ האופטימלית.
2. הוספת 100 μL של 60 pmol / biotinylated היטב GFP אנטי לכל הבארות בצלחת מצופית avidin שבו GFP כריכה הוא רצוי. כמות הנוגדנים מספיקה רק כדי להרוות את avidin גבוהה זיקה במי הקידוחים.
   1. הוסף חוצץ רק לכל הבארות המשמשות למטרות בקרה (לא GFP או GFP-TMEM184A כריכה רצויה). חותם את הבארות עם כיסוי צלחת על מנת למנוע אידוי. דגירה של 2 שעות ב RT, עם רעד.
      הערה: כרכים הוסיפו לבארות פעמי דגירה מבוססים על המלצות מהנותנות.
3. לשטוף את כל הבארות שלוש פעמיםבמשך 5 דקות עם 200 בחורים 0.2% μL / PBS.
4. הוספת 100 μL של 5 nmol / טוב GFP-TMEM184A או GFP לנכס בארות בצלחת מצופה avidin דגירה של 1 ש 'ב RT עם רעד. לשטוף שוב כמו 8.3.
   הערה: ריכוז זה של חלבון נבחר על מנת להבטיח כי כל האתרים היו רוויים עודף GFP או GFP-TMEM184A. זה חשוב כדי להבטיח כי אותה הכמות של חלבון מאוגדת היטב כל אחד. כמויות נמוכות של חלבון יכולות גם להרוות את האתרים, אפשרות כי ניתן הייתה לבדוק על ידי הערכת חלבון מאוגד הנותר לאחר דוגרי ריכוזים כמה חלבון עם הצלחת והשוואת חלבון מאוגד ליגנד מחייב מבחנים.
5. הכין ריכוזים שונים של הפרין שכותרתו והעמסה, למשל, 10, 25, 50, 75, 100, 200 מיקרוגרם / מיליליטר, ב 0.2% בחורים / PBS. האם עבודה זו וכל שנותר בחושך.
   הערה: לפני ההכנה ריכוזית, בריכוזים מסוימים עבור ligands אחר יקבעו עבור protein היעד המדובר. הריכוז הנמוך ביותר ניתן יהיה לקלוט את קורא הצלחת. לכן חשוב קודם לקבוע את הטווח כי ניתן לאתר במדויק במערכת החיץ המועסקת. ואז לקבוע את הטווח הנדרש להשגת מחייב למדידה. ריכוזים של והעמסה-הפרין מתחת ל -10 מיקרוגרם / מיליליטר לא לרשום בעקביות אצל קורא הצלחת בתנאי החיץ המועסק. בדומה לכך, בעוד rhodamine-הפרין כגון המשמש מבחנים האחרים, יכול להיות דמיינו בקורא הצלחת, בתנאי החיץ בריכוזים הנדרשים מחייב, קריאות הקרינה עבור סטנדרטים לא היו שונות reproducibly עם fluorophore כי.
6. הוספת 100 μL של וההעמסה-הפרין כדי בארות מתאימות בארות צלחת ורמת ריכוז מצופה avidin היא מצופה avidin ואת הצלחת הלא מצופית. דגירה של 10 דקות ב RT עם רעד. שמור צלחות בחושך (או רדיד מכוסה).
7. באמצעות rea צלחתדר, להקליט את פליטת הקרינה הראשונית מן הפרין בבארות מלאה הן של צלחות ואת הקרינה הראשונית (סה"כ) פליטת מבארות עם משותקת GFP-TMEM184A או GFP בצלחת מצופה avidin. במידת הצורך, להתאים את רווח המכשיר כדי לוודא זיהוי של הפרין ניאון בין הנמוך הריכוזים הגבוהים ביותר.
   הערה: ודא את קורא צלחת קורא בארות מלמעלה וקורא על המיקום האופטימלי בבארות אם כי היא מתכווננת. לצורך המחקר המדובר, את המיקום האופטימלי היה כ -75% למטה בארות. מידע זמין עם קורא הצלחת צריך לספק הצעות ייחודיות קוראת הצלחת מדוברת לקריאת מבחנים של מדגם כבול צלחות שחורות.
8. הסר הפרין ניאון מאוגד מבארות עם משותקת GFP-TMEM184A או GFP ומקום לתוך בארות מקבילות צלחת השחור שאינם מצופה. מיד לקרוא את פליטת הקרינה.
9. הוספת 100 μL טריים 0.2% בחורים / PBS בחזרה intבארות o שמהם-הפרין וההעמסה הוסרו, ולקרוא פליטת קרינה.
10. חזור על שלבים 8.8 - 8.9 3x.
    הערה: קריאות אלה מצלחת מצופה מצביעי הפרין והעמסה שנותר בארות GFP או GFP-TMEM184A. אם קרינה משמעותית נמצאת במדגם המאוגד השלישי, לשטוף נוסף אמורים להתרחש. אם הקרינה ממשיכה להסירו בכל לשטוף, מחייב של ליגנד עלול להיות זיקה נמוכה, והתנאים צריכים להיות הערכה מחדש. הקריאה הסופית מהווה את הקריאה הפרין הכבולה.
11. פליטת קרינת שיא מן הסיר, מאוגדות, הדגימות בצלחת noncoated, השיגו מספרים עבור כל שטיפה. אלו הם קריאות "מאוגדות".
12. השתמש ערכי פליטת הפרין כוללים שהושגו 8.7 כדי לאשר את הרמות הנכונות של הפרין מתווספות גם כל. פחת קריאות רקע ממוצעות מערכיה.
    הערה: ולס ללא כל והעמסה-הפרין לשמש רקע עקב נוגדנים, GFP חיץ. Averagדואר ברקע חוזר כדי לקבל את הערך ברקע. קריאות רקע ממוצעות לגרוע קריאות הכבולות וחסרת מאוגד כדי לקבל ערכים בפועל.
13. להעסיק חלקת הפליטה לעומת והעמסה-הפרין מוסף לקבוע את היקף הפליטה לעומת הסכום של הפרין.
    הערה: נוגדן לבד, או נוגדן אנטיגן הביאה כמה מרווה של קרינה. לכן, הפרין הכולל נקבע בהתבסס על הפרין המוסף כפי שמצוין 8.7.
14. עלילת הפרין מחויב לתקן מול הפרין המוסף triplicates בשני במקרה GFP-TMEM184A ותיק GFP.
15. לקבוע ליגנד בחינם על ידי הוספת הקריאות המאוגדת מכל שוטף ריכוז ספציפי.

תוצאות

אמנם, בתיאוריה, transfection של כל DNA לבנות לתוך תאים יכול להיות מושלם עם ריאגנטים transfection lipophilic, דיווחים קודמים מצביעים transfection יעיל יותר של GFP בונה לתאי אנדותל באמצעות electroporation ^12. הפרוטוקול הניתן כאן בדרך כלל מושגת GFP-לבנות ביטוי יותר מ -80% של תא?...

Discussion

הפרוטוקולים דיווחו כאן נועדו לספק עדויות מאשרות לזיהוי TMEM184A כמו קולטן הפרין בתאי כלי הדם ^1. טכניקות מציאה משמשים באופן שגרתי כמנגנון אחד כדי לאשר את הזיהוי של חלבונים חדשים. עם זאת, כמה אובדן תפקודי לאחר המציאה היא בדרך כלל לא הוכחה מספקת כי חלבון מועמד ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-TMEM184A construct	OriGene	RG213192
Rhodamine-Heparin	Creative PEGWorks	HP-204	Light Sensitive
Fluorescein-Heparin	Creative PEGWorks	HP-201	Light Sensitive
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
Paraformaldehyde (methanol free)	Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific	PI28908 at Fisher	Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes)	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	PI15510 at Fisher	Pay attention to shelf-life
Black 96 well plates	Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific	064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line	ATCC	CRL 1444	Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	B304-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells	Cell Applications, Inc.	B354-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	R304-05a	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads	Sigma	S1638
HeBS	Available from Bio-Rad		Can be prepared in the lab.  The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus	Obtained from ProSci Inc, Poway, CA	Pro Sci 5681	ProSci used in figure 1
GFP antibodies	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Used in figures 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)	Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining.
CHAPS	Purchased from Sigma	C5849	Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35 mm dishes	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens	Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope	Nikon	C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens	Used for images in Figure 5
Confocal Microscope	Zeiss	Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens	Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes	Available from MidSci	EC2L	Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader	TECAN	TECAN Infinite® m200 Pro plate reader	Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line	Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail
Cell Culture trypsin solution	Sigma	T4174	purchased as a 10X solution