Utilizzando un TMEM184A GFP-tagged Construct per la conferma della Eparina Receptor Identità

Riepilogo

Un TMEM184A codifica costrutto con un tag GFP al carbossi-terminale progettato per l'espressione eucariotica, è stato impiegato in saggi progettati per confermare l'identificazione di TMEM184A come recettore eparina in cellule vascolari.

Abstract

Quando nuove proteine ​​vengono identificati attraverso l'isolamento e la bioinformatica market basket analysis-based, sono spesso in gran parte indefinita. Gli anticorpi contro peptidi specifici all'interno della sequenza prevista consentono alcuni esperimenti di localizzazione. Tuttavia, spesso non possono essere escluse altre interazioni possibili con gli anticorpi. Questa situazione ha offerto l'opportunità di sviluppare una serie di saggi dipendenti dalla sequenza della proteina. In particolare, un costrutto contenente la sequenza genica accoppiato alla sequenza codificante GFP all'estremità C-terminale della proteina è stata ottenuta e utilizzata per questi scopi. Gli esperimenti per caratterizzare la localizzazione, ligando di affinità, e guadagno di funzione sono stati originariamente progettati e realizzati per confermare l'identificazione di TMEM184A come recettore eparina ^1. Inoltre, il costrutto può essere impiegato per studi che riguardano domande topologia di membrana e le interazioni proteina-ligando dettagliate. La presente relazione presenta arange di protocolli sperimentali basati sul costrutto GFP-TMEM184A espresso in cellule vascolari che potrebbe essere facilmente adattato per altre nuove proteine.

Introduzione

L'identificazione di proteine ​​candidate per le funzioni nuove, spesso dipende da protocolli di isolamento di affinità basata seguita da determinazione sequenza parziale. Esempi recenti di nuove proteine identificate sono proteine transmembrana 184A (TMEM184A), un recettore eparina identificato dopo interazioni eparina affinità ^1, e TgPH1, una proteina dominio pleckstrin omologia che lega phosphoinositide PI (3,5) _P2 ^2. Altro novel identificazione delle proteine attraverso analisi di sequenza diretta dei peptidi come quello di Vit, et al. che ha usato peptidi transmembrana per identificare i prodotti proteici da geni precedentemente non caratterizzate ^3. Allo stesso modo, l'identificazione di nuove sequenze di proteine può essere realizzato utilizzando la bioinformatica alla ricerca di famiglie di proteine precedentemente caratterizzati come l'identificazione di nuove proteine 4TM ^4. L'esame delle sequenze di geni della famiglia aquaporin ha alcosì ceduto l'identificazione di nuovi membri caratterizzati da nuove funzioni ^5. Dopo l'identificazione, l'analisi della funzione della proteina è tipicamente un passo successivo, che a volte può essere esaminato utilizzando un dosaggio specifico della funzione proteica come nel caso aquaporin.

Quando possibile, la funzione di una proteina di recente identificazione può essere esaminato con particolare enzimatici o simili saggi funzionali in vitro. Poiché molte funzioni delle nuove proteine dipendono complesse interazioni che si verificano solo in cellule intatte o organismi, in vitro non sono sempre efficaci. Tuttavia, i saggi in vivo devono essere progettati in modo tale che essi dipendono dalla sequenza del gene. In coltura cellulare, e / o organismi modello semplici, atterramento in grado di fornire elementi di prova per l'identificazione delle proteine / funzione ^6. Con nuove proteine ​​identificate come notato sopra, è spesso insufficiente a battere semplicemente verso il basso una proteina per confermare la funzione, und progettazione di saggi in vivo funzionali che dipendono sequenza genetica diventa importante per la caratterizzazione di nuove proteine.

La recente individuazione di TMEM184A come recettore eparina (che modula la proliferazione in muscolatura liscia vascolare e le risposte infiammatorie nelle cellule endoteliali) mediante cromatografia di affinità e MALDI MS ^{1, 7} fornito l'opportunità di sviluppare una collezione di saggi dopo atterramento prodotto risultati coerenti con l'identificazione . Una recente revisione ha confermato che l'eparina interagisce specificamente con molti fattori di crescita, i loro recettori, i componenti della matrice extracellulare, recettori di adesione cellulare, e altre proteine ^8. Nel sistema vascolare, eparina e proteoglicani eparan solfato (contenente catene eparan solfato di struttura simile a eparina) interagire con diverse centinaia di proteine ^9. Per confermare funzionalmente that TMEM184A è stato coinvolto con l'eparina assorbimento e vincolante, sono state sviluppate tecniche che hanno impiegato il costrutto gene per TMEM184A. La presente relazione comprende una raccolta di saggi sulla base di un GFP-TMEM184A costrutto per l'uso nel confermare l'identità di TMEM184A come recettore eparina.

Protocollo

1. Progettazione di un costrutto GFP-proteina

1. Acquisto, o la progettazione e costruzione, un costrutto GFP-tagged basato sulla proteina in questione.
   NOTA: Per un costrutto acquistato, vettori standard sono disponibili dai laboratori commerciali che includono alcuni o tutti i seguenti suggerimenti: Per una proteina di membrana, selezionare una posizione C-terminale della GFP perché è meno probabile che interferire con il traffico di proteine ​​di membrana. Si consideri una estensione tra il gene di interesse e la GFP se vi è ragione di credere che il C-terminale della proteina in questione è compatto piegato in un dominio della proteina. Selezionare il costrutto di espressione generale cellula eucariotica, ma consentono di costruire la produzione in sistemi batterici. Include un sito di taglio (ad esempio per la proteasi TEV) attraverso il quale GFP può essere rimosso se desiderato per alcuni esperimenti in cui la GFP potrebbe interferire con l'attività della proteina. Aggiungere altri inserti, come un tag aggiuntivo per la localizzazione o di affinità ininterazioni (ad esempio, His6). Questo non era necessario per i saggi descritti qui, ma potrebbe facilitare altri saggi, o essere utile direttamente adiacente al gene, prima della GFP, se la rimozione di GFP è desiderato.

2. Espressione GFP-TMEM184A in cellule vascolari

1. Endoteliali cultura o cellule muscolari lisce vascolari su 0,2% ricoperto di gelatina piatti di coltura tissutale come riportato in precedenza ^{1, 6, 7.}
2. Aggiungere 5 soluzione di coltura cellulare tripsina mL (0,5% w / v) ad un risciacquato 100 mm, o maggiore, confluenti piatto di cellule. Incubare a 37 ° C finché le cellule sono appena rilasciato dalla piastra, e trasferire le cellule in una provetta di polipropilene da centrifuga sterile.
3. Aggiungere un inibitore della tripsina (ad esempio, un uguale volume di mezzo di coltura normale), come usato in coltura di routine, alla soluzione di cellule / tripsina per limitare l'attività tripsina. Agglomerare le cellule per 5 minuti a approximdiatamente 600 g (o la velocità adeguata e il tempo di pellet solo le cellule per coltura tissutale standard). Aspirare il surnatante.
4. Risospendere le cellule in 1 ml di HeBS (Hepes-Buffered Saline) tampone elettroporazione, limitando la quantità di cellule di tempo sono nel pellet o sospensione. Posizionare la sospensione cellulare su ghiaccio ed effettuare passaggi rimanenti sul ghiaccio.
   NOTA: pellet può essere lavato una volta con HeBS prima di risospensione.
5. Aggiungere un volume sufficiente di GFP-tagged TMEM184A plasmide alle cellule per ottenere una concentrazione finale di 20 mg / mL di DNA. Utilizzare un protocollo identico per un costrutto GFP.
6. Posizionare circa 0,4 mL della soluzione di cellule in HeBS in una cuvetta elettroporazione. Pre-raffreddare le cuvette prima dell'uso.
7. L'elettroporazione di cellule utilizzando le seguenti condizioni: decadimento esponenziale, 500 uF, ∞ Ohm, e 170 V.
   NOTA: La tensione per un dato tipo di cellula deve essere ottimizzata. Studi preliminari con endoteliali e muscolari lisce celtipi l sono state realizzate con un costrutto GFP-vinculin per determinare il valore di tensione ottimale notato qui, ad esempio ^10.
   1. Per ottimizzare elettroporazione, iniziare con le raccomandazioni del produttore di apparecchiature (che includono le condizioni di alcuni tipi di cellule normali). Utilizzare il costrutto desiderato o una proteina fluorescente di controllo costruire simili per dimensioni e caratteristiche fluorescenti per il costrutto desiderato.
      NOTA: Piccolo acidi nucleici sembrano entrare nelle cellule più facilmente rispetto costrutti più grandi, quindi un costrutto con soltanto una proteina fluorescente possono essere più conveniente esprimere di una più grande.
   2. Utilizzare microscopia a fluorescenza per determinare la vitalità cellulare, la percentuale di cellule in cui il costrutto fluorescente viene espresso dopo 24 e 48 ore, e l'intensità di espressione.
      NOTA: Diminuire la tensione e / o tempo leggermente se la sopravvivenza è bassa. Obiettivo per il minor tempo possibile tra liberazione delle cellule dalla superficie coltura e ritornole cellule alla cultura per favorire la sopravvivenza. Lievi aumenti nel tempo o un secondo impulso possono migliorare l'assorbimento costrutto se la sopravvivenza è alta e l'espressione è basso. condizioni ottimali e di espressione varieranno tra i tipi di cellule. Se la percentuale di cellule che esprimono il costrutto è alto, ma l'intensità è bassa, aumentando la concentrazione di DNA e il monitoraggio delle cellule trasfettate nel tempo per intensità ottimale, che varieranno basato sulla proteina emivita nonché espressione, può migliorare l'intensità. intensità di colorazione può essere ingrandita per alcuni test, se necessario, per immunofluorescenza di GFP con anticorpi anti-GFP
8. Dopo l'elettroporazione, seminare le cellule in sei pozzi di coltura di tessuti da 30 mm, con lamelle per l'imaging o in piatti di coltura di tessuti. Coltivare le cellule utilizzando le procedure standard di coltura cellulare.
9. Opzionale: Sostituire il terreno di coltura dopo 24 ore per eliminare ogni tampone elettroporazione HeBS.

3. Visualizzazione di GFP-TMEM184A Localizzazione

1. Lavare le cellule con PBS e un leggero scuotimento dopo coltura per almeno 24 ore. Limitare l'esposizione alla luce intensa per evitare GFP sbiadimento.
2. Fissare cellule con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 minuti a RT agitando delicatamente. Evitare l'uso di eventuali reagenti metanolo contenenti che possono permeabilize le cellule. Fissaggio con metanolo può essere utilizzato se non è necessario valutare interazioni ligando.
   Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Indossare dispositivi di protezione adeguati. Utilizzare in una cappa aspirante, con cura, e scartare correttamente.
3. Risciacquare con PBS come sopra. Per la colorazione anticorpi base, vedi 3.6.
4. Monte coprioggetto alle diapositive utilizzando Mowiol o altro mezzo di montaggio adatto.
5. Le diapositive di immagini utilizzando un microscopio confocale a fluorescenza o con gli appositi set di filtri per GFP di eccitazione e spettri di emissione. La microscopia confocale è preferito a causa della capacità di separare campioni nel piano z. Salvare le immagini in scala di grigi per quAi fini antitation in formato TIF (oltre a immagini a colori per le illustrazioni).
6. Per confronto con la WT TMEM184A espressa dalle cellule, preparare altre cellule per immunofluorescenza con anticorpi primari preparati ad un peptide (s) dalla sequenza TMEM184A, ad esempio ^1. Identificazione di GFP-TEMEM184A può essere eseguita utilizzando anticorpi contro GFP. Valutare sia campioni di cellule di tecniche di microscopia identici.

4. rodamina-eparina Binding e Colocalizzazione con cellule GFP-TMEM184A transfettate

1. Trattare GFP-TMEM184A-cellule che esprimono con 100 mg / ml rodamina-eparina aggiunto al mezzo di coltura, e consentire alle cellule di incubare per un determinato periodo di tempo, in genere meno di 10 min per le cellule A7r5. Risciacquare e fissare come in 3.1 e 3.2.
   NOTA: Il momento ottimale e la concentrazione del ligando dipende risposta cellulare, intensità di fluorescenza dell'intensità ligando e l'immagine ottenuta. Questo concentratione di eparina è stata impiegata perché comporta risposta più del 50% in altri test ^11. Questa concentrazione può essere visualizzato utilizzando tecniche di microscopia a fluorescenza standard quindi non era necessario aumentarlo. La diluizione di rodamina-eparina con risultati eparina non etichettati in basso a fluorescenza nelle cellule, è quindi più difficile per l'immagine e quantificare.
2. Per quantificare il legame a causa di GFP-TMEM184A trasfezione rodamina-eparina, preparare cellule identiche senza trasfettate GFP-TMEM184A.
3. Immagine le cellule utilizzando un microscopio confocale con la GFP appropriata (488 nm) e rodamina (543 nm) di eccitazione e di emissione (500-530 nm per la GFP e maggiore di 560 nm per rodamina) valori per determinare la co-localizzazione. Ottenere immagini di almeno 50 cellule di almeno tre esperimenti separati per ottenere le statistiche. Mantenere impostazioni identiche all'interno di esperimenti, e impiegano un campione di controllo (s) (ad esempio, cellule trasfettate con nessun trattamento) tha può essere utilizzato per standardizzare i dati per l'analisi dei diversi esperimenti.
4. Esaminare le immagini utilizzando un programma per computer per determinare relativo rodamina vincolante / assorbimento in ogni cella per la quantificazione del legame.
   NOTA: le immagini TIF devono essere utilizzati come sono convenienti per l'analisi e possono essere convertiti in scala di grigi, in molti programmi per computer, se non sono stati inizialmente salvati in quel formato. Immagine J (freeware) è stato impiegato nella presente analisi e permette area e intensità dei pixel da misurare per qualsiasi area definita dall'utente in un'immagine.
   1. Utilizzare uno strumento a mano libera a cerchio una cella all'interno di una immagine a fluorescenza e utilizzare lo strumento di misura per determinare l'intensità all'interno di quello spazio.
      NOTA: Queste misurazioni forniscono le informazioni necessarie per calcolare l'intensità totale per un'area definita dall'utente (cellula intera, nucleo, ecc), che fornisce un modo per confrontare le cellule diverse con diverse geometrie. Intensità media su un'area di sfondo può essere riferito, e che facilitanos raccolta di intensità bassa per l'analisi.
   2. Esporta in un foglio di calcolo per calcolare l'area moltiplicata per l'intensità e sottrarre sfondo per la stessa quantità di area. Nella media la fluorescenza / cella per abbastanza cellule / esperimento per ottenere una significatività statistica.

5. Fluorescence Resonance Energy Transfer da GFP-TMEM184A a rodamina-eparina

1. Preparare cellule trasfettate e incubare con 200 mg / ml rodamina-tag ligando come in 3.1. Si noti che il tempo di incubazione con ligando fluorescente è tipo cellulare dipendente. Fissare con solo PFA, e montare le diapositive per l'imaging.
2. In primo luogo, eccitare a 405 nm e immagine per l'emissione rodamina (566-685 nm; FRET). In secondo luogo, eccitare a 488 GFP (immagine a 493-530) per, e la terza, eccitare a 561 per rodamina (immagine a 566-685). Controlli senza GFP-TMEM184A o senza rodamina-eparina sono critici.

6. live-cell imaging di rodamina-Heparin Assorbimento

1. Seme della GFP-TMEM184A cellule transfettate in piatti individuali progettati per l'imaging dal vivo di cellule e trattare come al protocollo 3.
   NOTA: Il numero di celle richieste dipende dal tipo di cellula e la densità desiderata. Per ridurre al minimo la quantità di tempo cellule sono in sospensione, non contano le cellule. cellule seme da un piatto confluenti 100 millimetri in sei 35 mm piatti di imaging in tempo reale per ottenere cellule nei pressi di confluenza in 48 h.
2. Dopo 48 h, sostituire il mezzo con terreno di coltura senza rosso fenolo.
3. Trasferire un piatto di cellule ad un microscopio confocale con una fase di riscaldamento per mantenere la temperatura, e mettere a fuoco il microscopio.
4. Dispensare 100 mg / ml rodamina-eparina nel piatto e mescolare delicatamente.
5. iniziare immediatamente la registrazione di immagini in diretta. Se captazione cellulare di eparina avviene all'interno della regione in vista, spostare la parabola leggermente per identificare le cellule con almeno uno verde vescicola contenente l'etichetta rodamina.
   NOTA: eccitazione di imaging e delle emissioni specifiche sono lacome per il protocollo eparina assorbimento (punto 5). Il periodo di tempo tra le immagini è stato di circa 16 s. Le condizioni dell'esperimento e il microscopio tipicamente determinare la velocità a cui le immagini possono essere ottenuti.

7. Isolamento di GFP-TMEM184A e GFP da cellule in coltura

1. Dopo aver rimosso terreno di coltura e risciacquo con PBS, aggiungere 2 mL 0,2% (w / v) CHAPS PBS 1x con inibitori della proteasi ad una piastra 150 mm di cellule esprimenti GFP-TMEM184A o GFP (per controllo saggi di binding). Raschiare le cellule dal piatto, posizionare la soluzione cellule / Chaps in una provetta da 15 polipropilene sul ghiaccio, e mescolare bene toccando. Completare tutte le fasi di luce per garantire il tag GFP è sbiancato per il saggio di legame qui di seguito.
2. Per legare specificamente GFP-TMEM184A (o un controllo adeguato GFP), aggiungere 2 mg / mL biotinilato anticorpo anti-GFP alla soluzione e incubare una notte a 4 ° C con dondolo.
3. Aggiungere 500 microlitridi perline streptavidina-agarosio ad almeno 5 ml 0,2% CHAPS / PBS e centrifugare a circa 600 xg per 3 a 5 min. Rimuovere il surnatante. Ripetere altre due volte con CHAPS fresco / PBS ogni volta. Aggiungere perline per la soluzione di anticorpi e cellule e incubare una notte a 4 ° C con dondolo per consentire alle sfere di legarsi agli anticorpi anti-GFP biotinilato legato alla GFP o GFP-TMEM184A.
4. Pellet le perline per centrifugazione (come in 7.3) e rimuovere il materiale non legato. Aggiungere inibitori almeno 5 mL 0,2% CHAPS / PBS / proteasi da lavare. Ripetere il lavaggio e centrifugazione almeno 3x per rimuovere efficacemente qualsiasi proteina non legata.
5. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio, incubare le perline con 1 ml di 0,2 M glicina / 0,2% CHAPS in PBS (pH a 2,0 utilizzando HCl) in ghiaccio per 3 minuti a dissociarsi vincolante l'anticorpo-GFP (con conseguente libera GFP-TMEM184A o libero GFP). Mescolare delicatamente toccando ogni 30 s.
6. Centrifugare a circa 600 xg e trasferire il surnatante contenente il p purificatorotein ad un nuovo tubo 15 ml seguito da neutralizzazione immediato con 5 ml di 1 M bicarbonato di sodio (portare il pH a 7).
7. Concentrare il campione utilizzando un 10.000 Dalton peso molecolare di cut-off concentratore centrifugo (impiegare velocità di centrifugazione raccomandata dal fornitore). Quando il volume raggiunge circa 0,5 ml, aggiungere 0,2% CHAPS / PBS. Continua concentrazione e aggiungendo più 0,2% CHAPS / PBS fino / PBS sono stati aggiunti almeno dieci volumi (volte il volume del campione di partenza) della CHAPS 0,2%.
8. Per determinare una stima della quantità di GFP isolata o proteina GFP-tag, avere un'assorbanza a 280 nm e confrontarlo con una curva standard preparata da sieroalbumina bovina o altre proteine ​​di controllo nello stesso tampone.
   NOTA: A causa delle differenze del coefficiente di estinzione, questa concentrazione è una stima, ma può fornire una concentrazione approssimativa di proteine ​​per facilitare ulteriore analisi senza sprecare campione. la concentrazione di proteine ​​accurata può essere dissuadereestratto utilizzando un saggio proteico micro-Lowry assicurandosi per preparare la proteina normale nello stesso tampone per il campione. Ulteriori analisi della proteina isolata può essere realizzata mediante western blotting della proteina isolata (utilizzando l'individuazione di anticorpi per GFP) e rispetto al peso molecolare previsto. In alternativa, l'uso degli anticorpi TMEM184A dovrebbe comportare una banda della dimensione costrutto previsto, ma potrebbe anche comportare una banda WT TMEM184A se sono presenti nel campione dimeri (o oligomeri di ordine superiore). Una stima della purezza può essere ottenuto colorando un blot per proteine ​​totali dal campione isolato vs proteine ​​totali da un'aliquota del materiale di partenza.

8. In Vitro Eparina Binding Assay

1. Preparare una piastra a 96 pozzetti nero avidina rivestita mediante lavaggio con 200 ml 0,2% CHAPS / PBS tre volte per 5 minuti con agitazione. Preparare un nero noncoated piastra a 96 pozzetti identici utilizzando la stessa procedura di lavaggio. Preparare unlayout per i campioni sperimentali (in triplice copia) per seguire durante il dosaggio. Include pozzi per concentrazioni standard di eparina, controlli tampone, e pozzi con campioni GFP senza eparina per confermare lo sbiancamento della GFP.
   NOTA: Se l'isolamento o interazione ligando buffer ottimizzati sono diversi per la proteina in questione, fare tutte le preparazioni di piastra e lavaggio con il sistema tampone ottimale.
2. Aggiungere 100 ml di 60 pmol / ben biotinilato anti-GFP a tutti i pozzetti della piastra rivestita avidina dove GFP legame è desiderato. La quantità di anticorpo è sufficiente a saturare solo l'avidina alta affinità nei pozzetti.
   1. Aggiungere tampone solo per tutti i pozzetti utilizzati per il controllo (senza GFP o GFP-TMEM184A rilegatura desiderato). Sigillare i pozzetti con un coperchio piatto per evitare l'evaporazione. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente, con agitazione.
      NOTA: I volumi aggiunti a pozzi e tempi di incubazione sono basate sulle raccomandazioni del fornitore.
3. Lavare tutti i pozzetti tre volteper 5 min con 200 ml 0,2% CHAPS / PBS.
4. Aggiungere 100 ml di 5 nmol / ben GFP-TMEM184A o GFP nei relativi pozzetti nella piastra di avidina rivestita e incubare per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione. Lavare nuovamente come in 8.3.
   NOTA: Questa concentrazione di proteine ​​è stato scelto per garantire che tutti i siti sono stati saturati con un eccesso di GFP o GFP-TMEM184A. Questo è importante per garantire che la stessa quantità di proteina è legato a ciascun pozzetto. Minori quantità di proteine ​​potrebbe anche saturare tutti i siti, una possibilità che potrebbe essere esaminata valutando la proteina non legata residua dopo incubazione diverse concentrazioni di proteine ​​con la piastra e il confronto di proteine ​​non legato e ligando saggi vincolante.
5. Preparare varie concentrazioni di eparina marcato con fluoresceina, per esempio, 10, 25, 50, 75, 100, 200 mg / ml, in 0,2% CHAPS / PBS. Fare questo e tutti i restanti lavori nel buio.
   NOTA: Prima di preparare le concentrazioni, le concentrazioni specifiche per altri ligandi devono essere determinati per la Protein target in questione. La concentrazione più bassa dovrebbe essere rilevabile nel lettore di piastre. Pertanto è importante determinare prima l'intervallo che può essere rilevato con precisione nel sistema tampone impiegato. Quindi determinare la gamma necessaria per ottenere misurabile vincolante. Le concentrazioni di fluoresceina-eparina inferiore a 10 mg / ml non sempre registrano nel lettore di piastre nelle condizioni di buffer impiegate. Analogamente, mentre rodamina-eparina come utilizzato negli altri test, potrebbe essere visualizzato nel lettore di piastre, nelle condizioni di buffer e alle concentrazioni richieste per la rilegatura, le letture di fluorescenza per le norme non erano riproducibile differente con quella fluoroforo.
6. Aggiungere 100 ml di fluoresceina eparina a opportuni pozzetti nei pozzetti della piastra e degli standard concentrazione avidina rivestite in entrambe le avidina rivestite e la piastra non rivestito. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Conservare le piastre al buio (o foglio coperto).
7. Utilizzando un piatto reader, registrare l'emissione di fluorescenza iniziale dal eparina nei pozzetti di controllo di entrambe le piastre e la fluorescenza iniziale di emissione (totale) da pozzi con immobilizzata GFP-TMEM184A o GFP nella piastra avidina-rivestita. Se necessario, regolare il guadagno dello strumento per garantire l'individuazione di eparina a fluorescenza tra il più basso e più alte concentrazioni.
   NOTA: Accertarsi che il lettore di piastre legge pozzi dall'alto e legge presso la posizione ottimale nei pozzi se questo è regolabile. Per lo studio in questione, la posizione ottimale era circa il 75% rispetto ai pozzetti. Le informazioni disponibili con il lettore di piastre dovrebbe fornire suggerimenti che sono unici per il lettore di piastre in questione per la lettura di saggi di campione legato a piastre nere.
8. Rimuovere eparina fluorescente non legato da pozzi con immobilizzato GFP-TMEM184A o GFP e il luogo in pozzetti corrispondenti della piastra non rivestiti nero. Leggere immediatamente l'emissione di fluorescenza.
9. Aggiungere 100 microlitri freschi 0,2% CHAPS / PBS indietro into pozzi da cui la fluoresceina-eparina è stato rimosso, e leggere emissione di fluorescenza.
10. Ripetere i passaggi 8,8-8,9 3x.
    NOTA: Queste letture dalla piastra rivestita indicano eparina fluoresceina rimanendo nei pozzi GFP o GFP-TMEM184A. Se la fluorescenza significativa si trova nel terzo campione non legato, dovrebbe verificarsi un lavaggio supplementare. Se la fluorescenza continua ad essere rimosso in ogni lavaggio, legame del ligando potrebbe essere bassa affinità, e le condizioni dovrebbero essere rivalutato. La lettura finale costituisce la lettura eparina legato.
11. Record emissione di fluorescenza dalle rimosse, non legato, campioni nel piatto noncoated, ottenendo numeri per ogni lavaggio. Queste sono le letture "Unbound".
12. Utilizzare i valori totali delle emissioni di eparina ottenuti in 8.7 per confermare i corretti livelli di eparina aggiunta ad ogni pozzetto. Sottrarre letture medie di fondo dai valori.
    NOTA: Wells senza fluoresceina eparina servire come sfondo a causa di anticorpi, GFP e di buffer. average lo sfondo ripete per ottenere il valore di fondo. Sottrarre sfondo medie letture letture legati e non legati per ottenere i valori reali.
13. Impiegare un terreno di emissioni rispetto al totale fluoresceina eparina aggiunto per determinare la scala delle emissioni rispetto a quantità di eparina.
    NOTA: solo anticorpo, o anticorpi e antigeni portato ad alcuni quenching della fluorescenza. Pertanto, l'eparina totale è stato determinato sulla base della eparina aggiunto totale, come ha osservato in 8.7.
14. Tracciare la eparina legata corretto rispetto al eparina aggiunto per i triplice copia in entrambi caso GFP-TMEM184A e il caso GFP.
15. Determinare ligando aggiungendo le letture non legato da tutti i lavaggi per una concentrazione specifica.

Risultati

Mentre, in teoria, trasfezione di DNA qualsiasi costrutto in cellule potrebbe essere realizzato con i reagenti di trasfezione lipofili, relazioni precedenti indicano più efficace trasfezione di GFP costrutti in cellule endoteliali mediante elettroporazione ^12. Il protocollo fornito qui realizzato tipicamente GFP-costrutto di espressione in più del 80% delle cellule endoteliali primarie derivate e cellule muscolari lisce utilizzati. Progettazione del costrutto im...

Discussione

I protocolli qui riportati sono stati progettati per fornire la prova di conferma per l'identificazione di TMEM184A come recettore eparina in cellule vascolari ^1. tecniche Knockdown sono abitualmente utilizzati come uno meccanismo per confermare l'identificazione di nuove proteine. Tuttavia, qualche perdita funzionale dopo atterramento non è tipicamente una prova sufficiente che una proteina candidato è effettivamente il recettore corretta (o altra proteina funzionale). E 'anche imp...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-TMEM184A construct	OriGene	RG213192
Rhodamine-Heparin	Creative PEGWorks	HP-204	Light Sensitive
Fluorescein-Heparin	Creative PEGWorks	HP-201	Light Sensitive
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
Paraformaldehyde (methanol free)	Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific	PI28908 at Fisher	Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes)	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	PI15510 at Fisher	Pay attention to shelf-life
Black 96 well plates	Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific	064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line	ATCC	CRL 1444	Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	B304-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells	Cell Applications, Inc.	B354-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	R304-05a	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads	Sigma	S1638
HeBS	Available from Bio-Rad		Can be prepared in the lab.  The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus	Obtained from ProSci Inc, Poway, CA	Pro Sci 5681	ProSci used in figure 1
GFP antibodies	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Used in figures 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)	Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining.
CHAPS	Purchased from Sigma	C5849	Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35 mm dishes	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens	Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope	Nikon	C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens	Used for images in Figure 5
Confocal Microscope	Zeiss	Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens	Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes	Available from MidSci	EC2L	Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader	TECAN	TECAN Infinite® m200 Pro plate reader	Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line	Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail
Cell Culture trypsin solution	Sigma	T4174	purchased as a 10X solution